Name: Conjugación de apareamiento Los ensayos para el análisis específico de la secuencia de proteínas de transferencia que participan en la conjugación bacteriana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprende ensayos de apareamiento para analizar mutaciones en genes de transferencia conjugativa mediante recombinación homóloga en bacterias. Este método identifica regiones críticas de interacción proteica en sistemas de secreción tipo IV.

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Esta investigación fue apoyada por un Descubrimiento donación del Consejo de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC).

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

proceso de conjugación bacteriana proporciona un medio por el cual las bacterias se pueden propagar genes proporciona una ventaja evolutiva para el crecimiento en entornos difíciles, tales como la propagación de los marcadores de resistencia a antibióticos. Debido a que muchos de los plásmidos de conjugación son tan grandes, 12 estudios funcionales en las proteínas implicadas en el montaje del aparato de transferencia a través de mutaciones de los genes diana en el propio plásmido conjugativo son difíciles de...

La transferencia de genes y proteínas a nivel micro del organismo desempeña un papel central en la supervivencia bacteriana y evolución, así como los procesos de infección. El intercambio de ADN entre bacterias o entre una bacteria y una célula se puede lograr a través de la transformación, conjugación o transducción de vector. 1,2 La conjugación es único en comparación con la transformación y la transducción en que durante la conjugación entre las bacterias gram-negativas tales como Escherichia coli, la transferencia de DNA se produce de una manera controlada de donantes mediante el cual un sistema macromolecular compleja conecta las células donantes y receptores. La conjugación es también la manera más directa en la cual las células bacterianas interactúan con las células huésped para inyectar los genes, las proteínas o los productos químicos en los sistemas de acogida. 3 Muy a menudo, la transferencia de dichos agentes tienen efectos notables sobre el anfitrión, que van desde la patogénesis y la carcinogénesis de acoger la evolución y la adaptación. Se ha demostrado que recombinatio conjugativon aumenta la tasa de adaptación de 3 veces en las bacterias con altas tasas de mutación en condiciones de estrés ambiental. 4 Por otra parte, la conjugación es, con mucho, la ruta más común a través del cual se extienden los genes de resistencia a antibióticos en cepas bacterianas. 5,6 Los microorganismos han evolucionado los sistemas de secreción especializados para apoyar la transferencia de macromoléculas a través de las membranas celulares; en la actualidad hay 9 tipos de sistemas de secreción (DST) en bacterias gram negativas que se han descrito: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, así como la SEC (secreción) y Tat (de dos arginina translocación) vías. 7,8 Cada tipo de sistema de secreción se divide en diferentes subtipos, una necesidad debido a la diversidad de las proteínas y el carácter distintivo de vías existentes en diferentes cepas bacterianas. Por ejemplo, en el sistema de secreción de tipo IV (T4SS), los sistemas de Ti y Cag facilitar el transporte, mientras que el efector F-plásmido, R27 unand pKM101 T4SSs facilitar la transferencia de un plásmido conjugativo. 7,9,10 Una comprensión detallada de los mecanismos por los cuales los organismos ensamblan sus respectivos sistemas de secreción de proteínas de sus componentes y comparten contenido celular con un receptor o su entorno es un factor importante en el desarrollo de estrategias dirigidas a combatir los microorganismos y procesos de patógenos la infección celular. Después de la conjugación bacteriana identificación inicial en E. coli por Lederberg y Tatum, 11 se han identificado y caracterizado un gran número de plásmidos móviles y conjugativo. 12 Tales plásmidos móviles muestran una considerable gama es de tamaño (de 1 a más de 200 kilobases (kb)), sin embargo todos los plásmidos móviles contienen una relaxasa, que reconoce el origen de transferencia (oriT) permitiendo de ese modo la transmisión del plásmido. plásmidos de conjugación más genes codifican para el montaje de un T4SS funcional, así como un tipo deIV proteína de acoplamiento. 12 Por ejemplo, el 100 kb del plásmido F de E. coli codifica todos los genes de conjugación dentro de una región de transferencia de 33,3 kB (TRA). Los 13 genes en la región tra del plásmido F codifican todas las proteínas que facilitan la formación del pilus, el apareamiento formación de la pareja (MPF), la transferencia de ADN y las funciones de exclusión durante la transferencia de plásmido conjugativo. 10,14,15 Un volumen importante de información está disponible para conjugación T4SSs, por más detallados estudios estructurales de las proteínas y complejos de conjugación sólo se están volviendo más reciente disponible. 16-28 Con el fin de montar una visión global del proceso de conjugación, se requiere un acoplamiento de los estudios estructurales detallados para mutacional análisis de proteínas de transferencia de conjugación. Esto se puede lograr a través de ensayos de apareamiento de conjugación. Para el plásmido F, cada proteína codificada dentro de la región tra juega un papel en la co mediada-Fnjugation; Por lo tanto, el knockout / deleción de un gen de transferencia va a suprimir la capacidad de conjugación de la célula (Figura 1). Mientras plásmidos móviles más pequeños son más propicias a los procedimientos de eliminación estándar, por los plásmidos conjugativos más grandes tales como F, knockouts de genes se logran más fácilmente por medio de recombinación homóloga en el que el gen diana se sustituye con uno transmitir un gen de resistencia a antibiótico distinto. En el protocolo actual, que emplean la recombinación homóloga para sustituir un gen de transferencia de interés con cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) de la 55 kb F plásmido derivado pOX38-Tc; 29,30 plásmido resultante knockout, pOX38-Tc Δgene :: Cm, facilita la resistencia a la presencia de cloranfenicol (Cm) en el medio de crecimiento. Las células donantes que albergan pOX38-Tc Δgene :: Cm no son capaces de afectar a la transferencia de ADN conjugativo / apareamiento tal como se observa a través del uso de un ensayo de apareamiento; la eficiencia de acoplamiento de una célula donante pOX38-Tc Δgene :: Cm y un recip normalesient disminuirá o, más a menudo, ser abolida. la transferencia por conjugación del plásmido pOX38-Tc Δgene :: Cm se puede restaurar a través de una pequeña recuperación plásmido que alberga el gen de transferencia concentrados. Este plásmido de recuperación puede ser uno que proporciona la expresión constitutiva, como pK184 plásmido (pK184-gen), 31 o una que proporciona expresión inducible mientras que el plásmido se dirige correctamente el gen a la ubicación correcta dentro de la célula (citoplasma o periplasma). En consecuencia, en los ensayos de apareamiento entre este nuevo donante (que alberga pOX38-Tc Δgene plásmidos :: Cm + pK184-gen) y una célula receptora, se espera que la eficiencia de acoplamiento para restaurar a cerca de la de un ensayo normal de apareamiento donante-receptor. Este sistema permite a uno para sondear la función del gen noqueado a través de la generación de una serie de construcciones de pK184-gen (deleciones o mutaciones puntuales) y prueba de la capacidad de cada constructo para restaurar la capacidad de acoplamiento de la pOX38-Tc Δgene :: Cm albergar célula donantes.

<table><tbody><tr><td>Kit de minipreparación de plásmidos GeneJet</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel GeneJet</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0692</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR GeneJet</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0702</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Kit de mutagénesis dirigida al sitio</td><td>New England Biolabs</td><td>E0554S Escalera de</td><td></td></tr><tr><td>ADN de amplio rango</td><td>New England Biolabs</td><td>N0303A Placas de</td><td></td></tr><tr><td>Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Electroporador</td><td>Eppendorf 4309000027</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de electroporación</td><td>Las cubetas</td><td>FB101</td> de Fisher Scientific <td>tienen un espacio de 1 mm.</td></tr><tr><td><Enzimas>fuertes</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA Polymerasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN Ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Antibióticos</fuerte></td><td></td><td></td><td><fuerte>Concentraciones finales</fuerte></td></tr><tr><td>Cloranfenicol (cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>20 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Kanamicina (Km)</td><td>BioBasic Inc.</td><td>DB0286</td><td>50 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>Ácido nalidíxico (Nal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878-25G</td><td>10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>de rifampicina (Rif)</td><td>Calbiochem</td><td>557303</td><td>20 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>de tetraciclina (Tc)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td>10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>de estreptomicina (Sm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td>50 &micro; g/mL</td></tr></tbody></table>

conjugación de apareamiento los ensayos para el análisis específico de la secuencia de proteínas de transferencia que participan en la conjugación bacteriana

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

La transferencia de material genético por conjugación bacteriana es un proceso que tiene lugar a través de complejos formados por proteínas de transferencia específicas. En Escherichia coli, estas proteínas de transferencia forman una maquinaria de transferencia de ADN conocida como formación de pares de apareamiento o complejo de transferencia de ADN, que facilita la transferencia de plásmidos conjugativos. El objetivo de este trabajo es proporcionar un método que pueda utilizarse para determinar el papel de una proteína de transferencia específica que está involucrada en la conjugación utilizando una serie de deleciones y/o mutaciones puntuales en combinación con ensayos de apareamiento. El gen diana se elimina en el plásmido conjugativo y luego se proporciona en trans mediante el uso de un pequeño plásmido de recuperación que alberga el gen diana. Las mutaciones que afectan al gen diana en el plásmido de recuperación pueden revelar información sobre aspectos funcionales de la proteína diana que dan lugar a la alteración de la eficiencia de apareamiento de las células donantes que albergan el gen mutado. Las alteraciones en la eficiencia del apareamiento proporcionan información sobre el papel y la importancia de la proteína de transferencia particular, o una región de la misma, en la facilitación de la transferencia de ADN conjugativo. El acoplamiento de este ensayo de apareamiento con estudios estructurales tridimensionales detallados proporcionará una comprensión completa de la función de la proteína de transferencia conjugativa, así como un medio para identificar y caracterizar las regiones de interacción proteína-proteína.

El proceso de F conjugación bacteriana plásmido guiado es un proceso coordinado que implica proteínas de transferencia dentro de la región tra de la F-plásmido que reúne un T4SS para facilitar la síntesis pilus y la transferencia de ADN conjugativo. La proteína TraF (# de acceso GenBank BAA97961; UniProt ID P14497) es necesaria para la formación de F-pilus conjugativo. 10,14,35 - 37 La proteína contiene un dominio similar a la tiorredoxina C-term...

Aquí, presentamos un protocolo para eliminar un gen de interés involucrado en la conjugación de plásmidos y posteriormente analizamos el impacto de su ausencia utilizando ensayos de apareamiento. La función del gen se explora más a fondo en una región específica de su secuencia mediante deleción o mutaciones puntuales.

Conjugación de apareamiento Los ensayos para el análisis específico de la secuencia de proteínas de transferencia que participan en la conjugación bacteriana

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

El objetivo general de este ensayo de apareamiento es evaluar los efectos de las mutaciones dentro del gen de transferencia conjugativo en su capacidad para afectar la transferencia de plásmidos dentro del contexto de un complejo funcional de secreción de tipo cuatro. Este método permite hacer preguntas específicas de proteínas, como identificar regiones de interacciones proteína-proteína que ocurren entre las proteínas de transferencia a medida que ensamblan un sistema de secreción funcional de tipo cuatro en la conjugación bacteriana. En esta técnica, los genes de los plásmidos conjugativos grandes se eliminan por recombinación homóloga.La función génica se evalúa proporcionando el gen diana a los knock-outs en un plásmido más pequeño. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la organización y la configuración son clave para llevar a cabo con éxito este procedimiento. Es necesaria una preparación experimental adecuada para obtener resultados interpretables.Comience este protocolo con la preparación del plásmido pBAD33 digerido como se describe en el protocolo de texto. Ejecute cada digestión en un gel de agarosa. Con un gabinete UV y una maqu

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Un método rápido y eficiente para integrar ADN ajeno de interés en cepas aceptor pre-hechas, llamadas cepas pista de aterrizaje, se describe. El método permite específica del sitio de integración de un cassette de ADN en el locus de aterrizaje almohadilla de ingeniería de una cepa dada, a través de la conjugación y expresión de la integrasa ΦC31.

Sitio específico de Ingeniería cromosoma bacteriano: ΦC31 integrasa mediada Cassette Exchange (IMCE)

Fuente: Erdogan, F., et al., Ensayos de apareamiento conjugativo para el análisis específico de secuencias de proteínas de transferencia involucradas en la conjugación bacteriana. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra el procedimiento para transferir un plásmido F de células de E. coli del donante al receptor utilizando un plásmido de rescate y seleccionando transconjugantes a través de una doble resistencia a los antibióticos. El proceso incluye la mezcla de cultivos bacterianos, la...

F Transferencia de plásmidos y selección dual de antibióticos en E. coli

Se describe aquí tres protocolos diferentes para la investigación in vitro de la conjugación, transducción, transformación y natural en el Staphylococcus aureus.

Metodología para el Estudio de la transferencia horizontal de genes en<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Con el objetivo de entender el comportamiento de los distintos elementos de ADN conjugativos bacterianos bajo condiciones diferentes, se describe un protocolo para la detección de diferencias en la frecuencia de conjugación, con alta resolución, para estimar cómo eficazmente la bacteria donante inicia verbal.

Alta resolución comparación de frecuencias de la conjugación bacteriana

Aquí, presentamos un protocolo que describe cómo i) ensamblar un vector autorreplicante usando el kit de herramientas de clonación modular CyanoGate, ii) introducir el vector en un host cianobacteriano por conjugación, y iii) caracterizar las cepas de cianobacterias transgénicas usando un lector de placas o citometría de flujo.

Modificación genética de las cianobacterias por conjugación utilizando el kit de herramientas de clonación modular CyanoGate

Describimos un método para generar saturación de bibliotecas mutantes transposon en bacterias Gram-negativas y la posterior preparación de bibliotecas de amplicón de ADN para la secuenciación de alto rendimiento. Como ejemplo, nos centramos en el patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, pero este protocolo es susceptible a una amplia gama de organismos Gram-negativos.

Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

La conjugación media la transferencia horizontal de genes mediante la movilización de ADN plásmido a través de dos células diferentes, facilitando la propagación de genes beneficiosos. Este trabajo describe un método ampliamente utilizado para la detección eficiente de la transferencia conjugativa de plásmidos, basado en el uso de marcadores diferenciales en el plásmido conjugativo, donante y receptor para detectar la transconjugación.

Detección de transferencia horizontal de genes mediada por plásmidos conjugativos naturales en E. coli

En este manuscrito, describimos un protocolo para examinar funcionalmente la transcripción y la actividad inhibitoria de agentes antibacterianos dirigidos a la transcripción bacteriana.

Los ensayos in vitro de transcripción y su aplicación en el descubrimiento de medicamentos

Aquí presentamos un protocolo que facilita la caracterización funcional de rendimiento medio a alto de construcciones de genes y promotores en tejido de tallo secundario de árbol dentro de marcos de tiempo comparativamente cortos. Es eficiente, fácil de usar y ampliamente aplicable a una variedad de especies de árboles.

El uso de Inducida somática Análisis del Sector (ISSA) para el estudio de genes y promotores implicados en la formación de la madera y el desarrollo del tallo Secundaria

Aquí, presentamos protocolos de cultivo de células humanas para analizar los factores de iniciación de la traducción que se unen a la tapa 5' del ARNm durante las condiciones fisiológicas de oxígeno. Este método utiliza un análogo de tapa m7GTP ligado a agarosa y es adecuado para investigar los factores de unión a la tapa y sus socios que interactúan.

Análisis de proteínas Cap-unión en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas

Aprende ensayos de apareamiento para analizar mutaciones en genes de transferencia conjugativa mediante recombinación homóloga en bacterias. Este método identifica regiones críticas de interacción proteica en sistemas de secreción tipo IV.

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