Conjugación de apareamiento Los ensayos para el análisis específico de la secuencia de proteínas de transferencia que participan en la conjugación bacteriana

El objetivo general de este ensayo de apareamiento es evaluar los efectos de las mutaciones dentro del gen de transferencia conjugativo en su capacidad para afectar la transferencia de plásmidos dentro del contexto de un complejo funcional de secreción de tipo cuatro. Este método permite hacer preguntas específicas de proteínas, como identificar regiones de interacciones proteína-proteína que ocurren entre las proteínas de transferencia a medida que ensamblan un sistema de secreción funcional de tipo cuatro en la conjugación bacteriana. En esta técnica, los genes de los plásmidos conjugativos grandes se eliminan por recombinación homóloga.

La función génica se evalúa proporcionando el gen diana a los knock-outs en un plásmido más pequeño. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la organización y la configuración son clave para llevar a cabo con éxito este procedimiento. Es necesaria una preparación experimental adecuada para obtener resultados interpretables.

Comience este protocolo con la preparación del plásmido pBAD33 digerido como se describe en el protocolo de texto. Ejecute cada digestión en un gel de agarosa. Con un gabinete UV y una maquinilla de afeitar estéril, corte la banda base de 2,8 kilos que responde a la secuencia de cateterismo del gel.

Trabaje rápidamente para minimizar la exposición UV del ADN. Extraiga el ADN de la rebanada de gel recortada utilizando un kit de extracción de gel según el protocolo del fabricante. Para amplificar el casete de gato extraído mediante reacción en cadena de la polimerasa o PCR.

Prepare la mezcla de reacción en un tubo de PCR estéril. Utilice cebadores que contengan salientes que sean homólogos a la secuencia del gen objetivo para la recombinación homóloga. Configure un control negativo que tenga los mismos componentes, excepto que reemplace el ADN molde con agua destilada doble.

Además, configure un control positivo utilizando ADN molde y cebadores que se ha demostrado que funcionan en una reacción de PCR. Mezcle suavemente todo el contenido de la reacción pipeteando. A continuación, amplifique el casete de gato extraído utilizando los parámetros de PCR enumerados en el protocolo de texto.

Utilice solo cinco microlitros de cada reacción para confirmar el tamaño correcto de la amplificación a través de la electroforesis en gel de agarosa. Purifique el amplicón de PCR utilizando un kit de purificación de PCR con el protocolo del fabricante. Agregue 300 nanogramos del casete de gato amplificado en 50 microlitros de celdas DY330R electrocompetentes, que albergan el plásmido pOX38-Tc en hielo.

Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Repita este paso utilizando un plásmido pBAD33 no modificado como control positivo. Luego, transfiera las celdas a una cubeta de electroporación preenfriada de un milímetro.

Electropore las celdas a 1,8 kilovoltios con una constante de tiempo de 5,5 milisegundos utilizando un electroporador. Inmediatamente, después de aplicar el pulso, diluya las células con un mililitro de medio SOC y transfiéralas a un tubo de microfuga nuevo. Incubar las células a 32 grados centígrados durante dos horas.

A continuación, alícuota 100 microlitros de cada muestra en placas de agar que contengan 10 microgramos por mililitro de tetraciclina y 20 microgramos por mililitro de cloranfenicol. Extienda la alícuota sobre la placa con un esparcidor estéril. Incuba la placa boca abajo a 32 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, seleccione los recombinantes exitosos. El casete de gato introducido en la célula experimentará una recombinación homóloga con el gen de interés y creará el clon knock-out de cloranfenicol pOX38-Tc. Separe los 300 nanogramos electroporados del gen pK184 o el plásmido mutante del gen pK184 en 50 microlitros de células DY330R electrocompotentes que albergan el plásmido knock-out de cloranfenicol pOX38-Tc como antes.

Para generar las células donantes XK1200, realice un apareamiento conjugativo seguido de electroporación para generar células XK1200 que arrastren tanto el knock-out de cloranfenicol como el plásmido PK184 como se describe en el protocolo de texto. Preparación del cultivo nocturno de estas células donantes XK1200 en 20 mililitros de LB estéril con cloranfenicol y kanamicina. También prepare células receptoras de MC4100 en 50 mililitros de LB con 50 microgramos por mililitro de estreptomicina utilizando células de un stock de glicerol o de una sola colonia en una placa de agar ang.

Cultive los cultivos a 37 grados centígrados, agitando a 200 rpm. Añadir glucosa hasta una concentración final de 100 milimolares a todas las células del donante. Al día siguiente, haga 1 de cada 70 diluciones de cada cultivo nocturno por separado en dos mililitros de LB estéril con los mismos antibióticos.

Haga crecer las células hasta la fase logarítmica media a 37 grados centígrados con agitación a 200 rpm. Centrifugar el cultivo celular para pellet las células y desechar el sobrenadante. A continuación, lave el pellet de células una vez con LB estéril frío para eliminar los antibióticos.

Después de centrifugar por segunda vez, como antes, suspendemos las células en dos mililitros de LB.In estéril en frío, alícuotas de 100 microlitros de células donantes y 100 microlitros de células receptoras a 800 microlitros de medios LB estériles para un volumen total de un mililitro. Deje que las células se apareen a 37 grados centígrados durante una hora sin agitar. Después de una hora, vórtice las células durante 30 segundos para interrumpir los pares de apareamiento.

Luego, coloque las celdas en hielo durante 10 minutos para evitar un mayor apareamiento. Utilizando los cultivos de registro medio y LB estéril fresco, prepare seis diluciones seriadas de las células donantes y receptoras de 1 y 100 a 1 y 10 millones. En cada una de las dos mitades de una placa de agar que contiene ácido naladicídico, cloranfenicol y kanamicina, localice 10 alícuotas de microlitros de cada dilución de células donantes XK1200.

Repita el manchado para las diluciones de las células receptoras MC4100 en placas de agar que contienen estreptomicina. Luego, incuba las placas durante la noche a 37 grados centígrados. A continuación, utilizando la mezcla de vórtice y LB estéril fresco, prepare seis diluciones de los transconjugantes.

Seleccione las células transconjugadas MC4100 que albergan el knock-out de cloranfenicol pOX38-Tc, detectando diez alícuotas de microlitros de cada dilución en cada mitad de las placas de agar que contienen estreptomicina y cloranfenicol. Repita para ambas mezclas duplicadas. Luego, incuba las placas durante la noche a 37 grados centígrados.

Calcule la eficiencia de apareamiento contando el número de colonias de la misma dilución para cada célula donante, receptora y transconjugante en sus respectivas placas. Además, cuente las colonias receptoras para probar cualquier sesgo resultante de un mayor número de transconjugantes que los receptores en esa dilución dada. Calcule la eficiencia de apareamiento como el número de colonias transconjugantes dividido por el número de colonias donantes, multiplicado por 100 para obtener el valor de eficiencia por 100 células donantes.

Cuando el sistema de secreción de tipo cuatro gene-tra-F se elimina del plásmido pOX38-Tc, se produce una pérdida de la transferencia conjugativa del plásmido knock-out de cloranfenicol pOX38-Tc traF de las células donantes a las receptoras. Sin embargo, cuando el gen traF es proporcionado en trans por el plásmido PK184 traF y las células donantes, se observa una recuperación de la transferencia conjugativa del plásmido knock-out de cloranfenicol pOX38-Tc traF. Cuando se les suministran mutantes de dilución de traF y el plásmido PK184 en las células donantes, se puede observar la pérdida de la transferencia conjugativa del plásmido knock-out de cloranfenicol pOX38-Tc traF.

La pérdida de transferencia conjugativa indica la región de la proteína importante para las interacciones proteína-proteína dentro del sistema de secreción conjugativo de tipo cuatro. Esta región se puede sondear con más detalle mediante mutaciones puntuales que afectan a la eficiencia de la transferencia. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un solo día de trabajo con tiempos de crecimiento esperados.

Este protocolo se puede realizar en celdas distintas a las que se muestran aquí. El aspecto crítico, en este punto, es que las células donante y receptora no albergan el plásmido de interés. De modo que cuando agregue el plásmido knock-out, no obtenga resultados contradictorios.

Al intentar este procedimiento, es importante ser muy organizado, ya que existen diferentes condiciones de crecimiento y antibióticos para las células donantes, receptoras y transconjugadas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la cristalografía, la RMN o la espectrometría de masas para obtener una imagen estructural y funcional detallada de la proteína de interés.