Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto

El objetivo general de este protocolo es describir un procedimiento sencillo de disección en un solo paso para cerebros de Drosophila adultos, que pueda producir rápidamente cerebros con una morfología bien preservada, adecuados para análisis en montaje completo. Este método puede ayudar a responder preguntas en los campos de la neurociencia y la genética, incluyendo la cartografía detallada de circuitos cerebrales, el estudio de los efectos de manipulaciones genéticas en neuronas y la caracterización funcional de genes.

La principal ventaja de esta técnica es que implica un procedimiento fácil de aprender. Puede facilitar la disección de un cerebro de mosca adulta con una morfología bien preservada en menos de 10 segundos. La demostración en video de este método es fundamental, ya que controlar el momento necesario al soltar la pinza para arrancar el exoesqueleto que rodea la cabeza de la mosca requiere habilidad y práctica.

Estas pequeñas y molestas moscas de la fruta nos han enseñado mucho sobre los principios biológicos. También podrían ayudarnos a encontrar las causas y tratamientos para enfermedades humanas, como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. Utilizando un microscopio estereoscópico ajustado a un aumento de 1,2 X, inmovilice una mosca anestesiada y sumérjala en solución fría de disección con el abdomen orientado hacia arriba.

Mantenga la pinza en un ángulo de 160 a 170 grados con respecto a la placa de disección, y luego ejerza una pequeña fuerza sobre el abdomen de la mosca. Esto inmovilizará a la mosca, forzará la cabeza hacia atrás entre 15 y 25 grados y extenderá la probóscide hacia arriba. Tras esta maniobra, debería hacerse evidente una región blanda y translúcida del exoesqueleto debajo de la probóscide.

Aumente el aumento y ajuste el plano focal sobre esta región. Con la mano dominante, tome un par de pinzas de disección y ejerza presión para cerrar las puntas. Coloque las pinzas perpendicularmente a las pinzas que sujetan la mosca.

Atraviese con las puntas cerradas de la pinza la región blanda y translúcida de la cutícula, teniendo cuidado de no penetrar tan profundamente que toquen el cerebro. Luego, libere rápidamente pero con firmeza las puntas de la pinza, de modo que se abran y arranquen el exoesqueleto de la cabeza de la mosca. Utilice el impulso generado al abrir las puntas de la pinza para retirar suavemente, en un solo movimiento, el exoesqueleto y la mayor parte de la cápsula craneal, junto con el ojo y la tráquea asociados, del tejido cerebral.

Debería ser visible ahora un cerebro intacto. Utilizando la pinza, retire cuidadosamente los tejidos accesorios restantes, como el tejido fibroso blanco de la tráquea, teniendo cuidado de no tirar ni dañar el cerebro propiamente dicho. Coloque las muestras de cerebro disecadas junto con los torsos asociados en aproximadamente un mililitro de paraformaldehído al 4% sobre hielo durante 40 a 60 minutos.

Retire el paraformaldehído y luego enjuague las muestras con un mililitro de PBS 1X pipetando la solución hacia arriba y hacia abajo tres veces, teniendo cuidado de no aspirar los cerebros. A continuación, retire el PBS y lave cinco veces con un mililitro de PBT 1X durante cinco minutos cada vez con agitación rotatoria. Añada el anticuerpo primario de interés en la dilución adecuada.

A continuación, incubar las muestras durante la noche a cuatro grados Celsius con agitación suave. Retirar el anticuerpo primario y lavar las muestras cinco veces con un mililitro de PBT 1X durante cinco a 10 minutos cada lavado con agitación suave. Añadir el anticuerpo secundario a las muestras lavadas en la dilución y tiempo de incubación adecuados.

A continuación, lave las muestras seis veces con un mililitro de PBT 1X durante 10 minutos cada vez con agitación rotatoria. Este paso es fundamental para eliminar cualquier anticuerpo secundario unido de forma no específica. Incube las muestras en una dilución 1:10,000 de DAPI a un miligramo por mililitro en un mililitro de solución PBT 1X durante 30 a 60 minutos con agitación rotatoria.

Finalmente, enjuague las muestras añadiendo un mililitro de PBS 1X y luego pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo tres veces. Coloque un cubreobjetos sobre un portaobjetos de montaje. Utilizando una pipeta con la punta cortada, transfiera los cerebros en solución de PBS 1X sobre el cubreobjetos.

A continuación, utilizando pinzas, separe los cerebros de los cuerpos. Use una punta de pipeta fina para eliminar el líquido alrededor del tejido cerebral. Y luego, agregue de 20 a 40 microlitros de medio de montaje antifade.

Extienda suavemente los cerebros, desplazando al mismo tiempo el medio viscoso hacia afuera. Comenzando desde un lado, baje suavemente un segundo cubreobjetos sobre las muestras, teniendo cuidado de minimizar el contacto del cerebro con las burbujas. Deje que los cubreobjetos se asienten y luego retire cualquier líquido excesivo del borde de los mismos utilizando una toallita de laboratorio.

Utilice un pequeño trozo de cinta para sujetar temporalmente el par de cubreobjetos al portaobjetos de montaje. Para obtener imágenes de las muestras, utilice un microscopio compuesto fluorescente o confocal. Estas imágenes muestran vistas anterior y posterior del mismo Drosophila adulto.

Los núcleos celulares se visualizaron mediante tinción con DAPI y las neuronas se marcaron usando un marcador pan-neuronal y anticuerpos anti-ELAV. Las neuronas dopaminérgicas, o DA, se revelaron mediante tinción con anticuerpos anti-TH. Se observaron niveles similares de intensidad entre ambos lados del cerebro para todos los canales de imagen.

Vistas ampliadas de la parte anterior y posterior del cerebro permiten un examen detallado de los grupos neuronales de DA. El grupo medial anterior apareado puede observarse en las imágenes anteriores, y los grupos mediales posteriores apareados y los grupos laterales posteriores apareados en el lado posterior del cerebro. La cuantificación de estas neuronas reveló que moscas macho de tres días de edad de la cepa w1118 típicamente tienen 27 neuronas de DA en el grupo PPM en todo el cerebro, 16 en el grupo PPL por hemisferio y cinco en el grupo PAL por hemisferio.

Se observó un promedio de 97 neuronas dopaminérgicas en cada uno de los grupos PAM. La reconstrucción 3D de los grupos PAL y PAM también mostró que las neuronas dopaminérgicas en el grupo PAM tienen tamaños relativamente pequeños y una tinción de TH más débil que las de otros grupos, como el PAL. Cada vez más estudios se están centrando en los cerebros de moscas adultas para analizar las vías moleculares y la conectividad neuronal que subyacen a las funciones cerebrales superiores, y para modelar enfermedades cerebrales humanas.

En estudios basados en el cerebro como estos, será necesario preparar eficientemente muestras cerebrales con una morfología bien preservada. Esto podría ser especialmente importante en análisis a gran escala basados en el cerebro. Tuve por primera vez la idea de este método mientras intentaba sostener moscas con la pinza.

En lugar de pinzas con puntas afiladas que la mayoría de los investigadores de Drosophila utilizan, Shebna probó pinzas de extremo romo y descubrió que era más fácil diseccionar los cerebros. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de 10 segundos si se realiza correctamente. En una ocasión, diseccioné cerca de 100 cerebros de seis genotipos diferentes para un experimento en tan solo un día.

Aunque este procedimiento de disección pueda parecer sencillo, es importante practicarlo primero con moscas desechables. El investigador también podría tener dificultades para colocar la pinza sin dañar el cerebro de la mosca. Los cerebros diseccionados pueden utilizarse para otros estudios, como hibridación in situ, extracción de proteínas y muestras de ARN a partir del tejido cerebral.

Después de ver este video, usted debería ser capaz de diseccionar cerebros de mosca con una morfología bien preservada. Predecimos que se podrían desarrollar mejoras para hacer este procedimiento más sencillo y rápido. Esto podría potencialmente automatizarse en el futuro para estudios a gran escala.

No olvide que trabajar con paraformaldehído y pinzas de disección afiladas puede ser peligroso. Tome precauciones, como usar guantes, al manipular soluciones fijadoras, y una vez que la disección haya finalizado, coloque inmediatamente la tapa a las pinzas antes de guardarlas.