Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto Drosophila

El objetivo general de este protocolo es describir un procedimiento de disección simple de un solo paso para cerebros adultos de Drosophila, que puede producir rápidamente cerebros con una morfología bien conservada adecuada para el análisis de montura completa. Este método puede ayudar a responder preguntas en los campos de la neurociencia y la genética. Esto incluye el mapeo fino de los circuitos cerebrales, el estudio de los efectos de las manipulaciones genéticas de las neuronas y la caracterización funcional de los genes.

La principal ventaja de esta técnica es que implica un procedimiento fácil de aprender. Puede facilitar la disección del cerebro de una mosca adulta con una morfología bien conservada en menos de 10 segundos. La demostración en video de este método es fundamental, ya que controlar el impulso requerido al soltar las pinzas para arrancar el exoesqueleto que rodea la cabeza de la mosca requiere habilidades y práctica.

Estas diminutas y molestas moscas de la fruta nos han enseñado mucho sobre los principios biológicos. También pueden ayudarnos a encontrar las causas y las curas de las enfermedades humanas, como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. Usando un microscopio de disección con un aumento de 1,2X, inmovilice una mosca anestesiada y sumérjala en una solución de disección fría con el abdomen hacia arriba.

Mantenga las pinzas en un ángulo de 160 a 170 grados con respecto a la placa de disección, y luego ejerza una pequeña fuerza sobre el abdomen de la mosca. Esto debería inmovilizar a la mosca, forzar la cabeza hacia atrás de 15 a 25 grados y extender la probóscide hacia arriba. Después de esta maniobra, debería hacerse evidente una región suave y translúcida de la cutícula debajo de la probóscide.

Aumente la ampliación y ajuste el plano focal en esta región. Con la mano dominante, tome un par de pinzas de disección y ejerza presión para cerrar las puntas. Coloque las pinzas perpendicularmente a las pinzas que sujetan la mosca.

Perfore las puntas cerradas de las pinzas a través de la región suave y translúcida de la cutícula, teniendo cuidado de no penetrar tan profundamente que toquen el cerebro. Luego, de manera rápida, pero constante, suelte las pinzas, de modo que las puntas se abran, arrancando el exoesqueleto de la cabeza de la mosca. Utilice el impulso de soltar las puntas de las pinzas para extraer suavemente el exoesqueleto y la mayor parte del ojo y la tráquea asociados a la cabeza del tejido cerebral en un solo movimiento.

Un cerebro intacto ahora debería ser visible. Con las pinzas, retire con cuidado los tejidos accesorios restantes, como el tejido traqueal fibroso blanco, teniendo cuidado de no tirar ni dañar el cerebro propiamente dicho. Coloque las muestras de cerebro disecadas con torsos asociados en aproximadamente un mililitro de paraformaldehído al 4% en hielo durante 40 a 60 minutos.

Retire el paraformaldehído y luego enjuague las muestras con un mililitro de un X PBS pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo tres veces, teniendo cuidado de no aspirar los cerebros. A continuación, retire el PBS y luego lave cinco veces con un mililitro de un X PBT durante cinco minutos cada uno con nutación. Agregue el anticuerpo primario de interés en la dilución adecuada.

Y luego incubar las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados con nutación. Retire el anticuerpo primario y lave las muestras cinco veces con un mililitro de un X PBT durante cinco a 10 minutos cada lavado con nutación. Añada un anticuerpo secundario a las muestras lavadas en el momento adecuado de dilución e incubación.

Después de esto, lave las muestras seis veces en un mililitro de un X PBT durante 10 minutos cada una con nutación. Este paso es fundamental para eliminar cualquier anticuerpo secundario no unido específicamente. Incubar las muestras en una dilución de uno a 10.000 de un miligramo por mililitro de DAPI en un mililitro de una solución de X PBT durante 30 a 60 minutos con nutación.

Finalmente, enjuague las muestras agregando un mililitro de un X PBS y luego pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo tres veces. Coloque un deslizamiento de cubierta en una corredera de montaje. Con una pipeta con una punta cortada, transfiera los cerebros en una solución de X PBS al cubreobjetos.

A continuación, con fórceps, separe los cerebros de los cuerpos. Use una punta de pipeta fina para eliminar el líquido que rodea el tejido cerebral. Y luego, agregue de 20 a 40 microlitros de medio de montaje anti-decoloración.

Extienda suavemente los sesos, mientras desplaza el medio viscoso hacia afuera. Comenzando por un lado, baje suavemente un segundo cubreobjetos sobre las muestras, teniendo cuidado de minimizar el contacto cerebral con las burbujas. Deje que los deslizamientos se asienten y luego elimine el exceso de líquido del borde de los deslizamientos con una toallita de laboratorio.

Utilice un pequeño trozo de cinta adhesiva para fijar temporalmente el par de cubreobjetos a la corredera de montaje. Para obtener imágenes de las muestras, utilice un microscopio fluorescente compuesto o confocal. Estas imágenes muestran vistas anterior y posterior de la misma Drosophila adulta.

Los núcleos celulares se visualizaron mediante tinción DAPI y las neuronas se marcaron utilizando un marcador panneuronal y anticuerpos anti-ELAV. Las neuronas dopaminérgicas, o DA, fueron reveladas por la tinción de anticuerpos anti-TH. Se observaron niveles similares de intensidad entre ambos lados del cerebro para todos los canales de imagen.

Las vistas ampliadas de la parte anterior y posterior del cerebro permiten un examen detallado de los grupos neuronales DA. El grupo medial anterior emparejado se puede ver en las imágenes anteriores, y el grupo medial posterior emparejado y el grupo lateral posterior emparejado en el lado posterior del cerebro. La cuantificación de estas neuronas reveló que las moscas macho de tres días de edad de la cepa w1118 suelen tener 27 neuronas DA en el grupo PPM en todo el cerebro, 16 en el grupo PPL por hemisferio y cinco en el grupo PAL por hemisferio.

Se observó un promedio de 97 neuronas DA en cada uno de los grupos de PAM clusters. 3D reconstrucción de los grupos PAL y PAM también mostró que las neuronas DA en el grupo PAM tienen tamaños relativamente pequeños y una tinción TH más débil que las de los otros grupos, como el PAL. Cada vez son más los estudios que se centran en los cerebros de las moscas adultas para diseccionar las vías moleculares y los circuitos neuronales que subyacen a las funciones cerebrales superiores, y para modelar las enfermedades cerebrales humanas.

En este tipo de estudios basados en el cerebro será necesario preparar eficazmente muestras de cerebro con una morfología bien conservada. Esto podría ser especialmente importante en pantallas cerebrales a gran escala. La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando luchaba por sujetar moscas en las pinzas.

En lugar de pinzas con puntas afiladas que usan la mayoría de los investigadores de Drosophila, Shebna probó pinzas de extremo romo y descubrió que era más fácil diseccionar los cerebros. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de 10 segundos si se realiza correctamente. Una vez, diseccioné alrededor de 100 cerebros de seis genotipos diferentes para un experimento en un solo día.

Si bien este procedimiento de disección puede parecer simple, es importante practicarlo primero con moscas prescindibles. El investigador también puede tener dificultades para colocar las pinzas sin destruir el cerebro de la mosca. Los cerebros disecados se pueden utilizar para otros estudios, como el ARN, la hibridación in situ y la extracción de muestras de proteínas y ARN del tejido cerebral.

Después de ver este video, debería poder diseccionar cerebros de moscas con una morfología bien conservada. Prevemos que se pueden desarrollar mejoras para que este procedimiento sea más sencillo y rápido. Esto puede automatizarse potencialmente en el futuro para estudios a gran escala.

No olvide que trabajar con el paraformaldehído y las pinzas de disección afiladas puede ser peligroso. Tome precauciones, como usar guantes, cuando manipule soluciones fijadoras, y una vez que se complete la disección, tape inmediatamente las pinzas antes de dejarlas a un lado.