Name: Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprende un protocolo de disección de un solo paso para cerebros adultos de Drosophila con morfología bien preservada en menos de 10 segundos. Este método facilita investigaciones en neurociencia y genética.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Reconocemos el Sr. Mehmet Enes, la Sra Kiara Andrade, Sra. Pilar Rodríguez, Chris Kwok, y la Sra Danna Ghafir por su inmenso apoyo al proyecto.

1. Soluciones utilizadas para el Cerebro La disección y la tinción de inmunofluorescencia <ol><li> Diseccionar el cerebro adulto mosca artificial en el líquido cefalorraquídeo (ACSF): NaCl 119 mM, 26,2 mM NaHCO3, KCl 2,5 mM, 1 mM NaH 2 PO 4, 1,3 mM de MgCl2 y 10 mM de glucosa. Antes de su uso, el gas de la ACSF con 5% de CO2 / 95% de O2 durante 10 - 15 min y pico con 2,5 mM de CaCl2. Esterilizar la solución LCRa por filtración a través de un filtro de 0,22 micras membrana. Nota: tienda LCRa a 4 ° C para evitar la contaminación bacteriana. Fly cerebro también pueden ser diseccionados en una solución tamponada con fosfato salino (PBS), aunque no se han realizado comparaciones detalladas de los efectos de las dos soluciones de disección en la calidad de imagen final de los cerebros disecados. </li><li> Usar 4% de paraformaldehído (PFA) preparado en 1x PBS como la solución de fijación, que normalmente se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C. caution: PFA es tóxico y corrosivo y debe manejarse con cuidado. </li><li> Utilice 1x PBS para enjuagar la PFA de los cerebros y después de la última etapa de lavado, durante la tinción de inmunofluorescencia de los cerebros disecados. Preparar el PBS 1x PBS 10x de solución madre (1,37 M NaCl, KCl 27 mM, 100 mM de Na 2 HPO 4, y 18 mM KH 2 PO 4). </li><li> Use 0,3% de Tween-20 en PBS 1x (1x PBT) para todas las etapas de lavado posteriores durante la tinción de inmunofluorescencia de los cerebros disecados. </li></ol> 2. La disección microquirúrgica de Jefes de las moscas adultas Nota: El procedimiento de disección se ilustra en la Figura 1. <ol><li> Anestesiar las moscas adultas con CO2. Con unas pinzas, recoger una mosca y brevemente desparafinar su cutícula por inmersión en etanol al 70% durante 3 - 5 s. Esto asegura que no hay burbujas se adhieren a la cutícula mosca cuando se sumerge en la solución o LCRa disección 1X PBS. </li><li> Debajo demicroscopio de disección con una fuente de luz en un ángulo que no será bloqueada por las manos, establezca la lente del objetivo de alcanzar una visión clara de la marcha (ampliación 1.2X). El uso de fórceps con la mano no dominante para inmovilizar al animal y sumerja la mosca en la solución de disección en frío con su abdomen hacia arriba, como se muestra en la Figura 1A. </li><li> Mantener las pinzas en un 160 - 170 ° ángulo con respecto a la placa de disección, mientras se ejerce una pequeña fuerza sobre el abdomen de la mosca (ilustrado como flechas en la Figura 1A). Este paso inmovilizará la marcha y la fuerza para mover la cabeza hacia atrás para el 15 - 25 ° mientras se extiende la trompa hacia arriba. En el proceso, una región suave y translúcido de la cutícula, por debajo de la trompa, debería ser evidente. Aumentar la ampliación y ajustar el plano focal en esta región. Nota: No sostenga la pinza con demasiada fuerza, sino que simplemente lo suficientemente firme como para estabilizarla mosca. El exceso de fuerza hará que los órganos dentro de la rotura en la solución. </li><li> Utilice la mano dominante para presionar las pinzas de disección de modo que sus puntas están cerrados, lo que generará una fuerza resistente suave en la punta de las pinzas, por lo que el fórceps surgirán abierta cuando se libera la presión de la mano que sujeta. Coloque la pinza perpendicularmente a las pinzas que sostienen la marcha, como se muestra en la Figura 1B. <ol><li> Pierce las puntas cerradas de los fórceps de disección a través de la región suave y translúcido de la cutícula debajo de la trompa, como se ilustra por la flecha roja en la Figura 1B. Es importante que no penetre el fórceps demasiado profundamente que toque el cerebro. El cerebro adecuada debe ser visible. Mantener un agarre estable de la mosca con la mano no dominante. </li></ol></li><li> Rápidamente, pero de manera constante, suelte las puntas de las pinzas de disección por su propia fuerza y ​​se basan en el impulso de esta versión desgarrar tque exoesqueleto que rodea la cabeza de la mosca. Un cerebro intacto adecuada debe ser visible (el tejido blanco inmediatamente por encima de la punta de la pinza inferior en la figura 1C) Sigue una línea imaginaria para guiar el impulso de las puntas de fórceps liberados (ilustrados como las flechas rojas hacia el exterior que se muestran en la Figura 1C). Esto eliminará suavemente el exoesqueleto y la mayoría del ojo cerebro asociada y la tráquea del cerebro. El momento y la fuerza apropiada aplican para abrir el exoesqueleto será dependiente de la experiencia del investigador. Nota: Este es el paso más crítico durante la disección. Es importante que depender de la fuerza natural generado a partir del impulso de las pinzas de apertura para eliminar el exoesqueleto, dejando el cerebro expuesto permanece unido al resto del cuerpo. </li><li> Utilice las pinzas en la mano dominante para retirar cuidadosamente los tejidos remanentes de accesorios, tales como la tráquea que aparece como estructuras de fibras blancas remaining unido al cerebro. Tenga cuidado de no tirar o dañar el cerebro adecuado. </li></ol> 3. Inmunofluorescencia La tinción de los cerebros <ol><li> Fijar las muestras de cerebros disecados con sus torsos asociados en aproximadamente 1 ml de PFA al 4% durante 40 - 60 min. Nota: Para éste y los siguientes pasos, mantenga los tubos o placas con las muestras en un nutator para mezclar adecuadamente las muestras en la solución. </li><li> Enjuague con 1 ml de PBS 1x pipeteando la solución hacia arriba y abajo 3 veces. Tenga cuidado de no aspirar los cerebros de distancia. </li><li> Lavar 5 veces con 1x PBT de 5 min cada uno. Mantener las muestras en el nutator durante la incubación. </li><li> Se incuban con anticuerpos primarios a una dilución apropiada de O / N a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, eliminar los anticuerpos primarios, y lavar las muestras 5 veces con 1x PBT. Deje las muestras durante 5 - 10 min en la solución 1x PBT entre cada lavado. Mantener las muestras en el nutator durante la incubación. </li><li> Incubar la lavamuestras de anticuerpos secundarios apropiados con la dilución y el tiempo de incubación sugerido. </li><li> Lavar las muestras seis veces con 1x PBT con una incubación de 10 min entre cada lavado. Este paso es crítico para la eliminación de los anticuerpos secundarios unidos de forma no específica de la muestra. </li><li> Incubar en una dilución 1: 10000 de 1 mg / ml 4 &#39;, 6&#39;-diamino-2-fenilindol (DAPI) en solución PBT 1x durante 30 min. DAPI es un tinte de ADN que se une a las regiones de AT de ADN y se puede utilizar para revelar la morfología general del cerebro. </li><li> Enjuague tres veces con PBS 1x. </li><li> Transferir las muestras a un plato de disección, y se separan los cerebros de los órganos en una placa de disección con unas pinzas. </li><li> Después de las etapas de tinción y lavado, montar los cerebros en entre dos cubreobjetos y colocar el cubreobjetos en la parte superior de un portaobjetos de montaje. De esta manera, las muestras de cerebro se pueden bascular con facilidad de modo que ambos lados del cerebro se pueden obtener imágenes con una intensidad de señal similar. <strong&gt; Nota: Montaje del cerebro en el cubreobjetos en lugar de directamente sobre el portaobjetos de montaje permite mover de un tirón de la orientación de la muestra libremente. El proceso de montaje se explica con más detalle a continuación. <ol><li> Colocar un cubreobjetos de 18 x 18 mm en la parte superior de un portaobjetos de montaje. Ensanchar la abertura de una punta de pipeta con una cuchilla y utilizarla para transferir los cerebros en la solución de PBS 1x en la 18 x 18 mm cubreobjetos. </li><li> Coloque los cerebros en el centro del cubreobjetos, eliminar el líquido alrededor de los cerebros con una punta de pipeta fina, y luego añadir otro 20 - 40 l de medio de montaje anti-fade (0,2% (w v) n-propil galato / en 99,5 ACS% de glicerol de grado) en los cerebros. Nota: La cantidad de montaje añadido medio depende del número de cerebros examinados. </li><li> Suavemente separa los sesos al desplazar el medio de montaje viscoso hacia el exterior. Colocar un segundo 18 x 18 mm cubreobjetos en la parte superior de los cerebros mediante la reducción de la diapositiva primero de un lado hasta que haga contacto conla superficie de la hoja de montaje y, a continuación, reducir poco a poco el otro lado para minimizar el contacto cerebro con burbujas de aire. Nota: No hay necesidad de utilizar un espaciador entre los dos cubreobjetos, como el volumen del medio de montaje y el cerebro deben proporcionar un espacio suficiente para separar los dos cubreobjetos. </li><li> Deje que los portaobjetos para establecerse. Retire el líquido excesivo que salen de los lados de las tiras con un pañuelo de papel de laboratorio. </li><li> Para evitar que los cubreobjetos con los cerebros montados caiga fuera de la diapositiva de montaje durante el transporte, utilizar un pequeño trozo de cinta adhesiva para unir los cubreobjetos al portaobjetos de montaje. Nota: Los cerebros montan entre las diapositivas se pueden visualizar inmediatamente o se conservaron a 4 ° C durante un máximo de una semana sin pérdida significativa de la señal fluorescente, sin necesidad de utilizar ningún sellador para sellar las diapositivas. Para la conservación a largo plazo de los cerebros manchadas, el lado de los dos resbalones se puede sellar wITH esmalte de uñas y se almacena en un congelador a -20ºC, aunque cerebros manchados podrían perder sus señales a través del tiempo. Esto no es recomendable. </li></ol></li><li> Utilizar un microscopio compuesto fluorescente apropiada o un microscopio confocal para la imagen de los cerebros. <ol><li> En primer lugar, adquirir la imagen del lado del cerebro más cerca del objetivo, y luego la vuelta con cuidado el cubreobjetos tener las muestras intercaladas en el medio. Este paso facilita la adquisición de la imagen del otro lado de la misma cerebro. </li><li> Utilice un microscopio vertical compuesto fluorescente y una lente objetivo 20X en la imagen de conjunto del cerebro (ejemplos en la Figura 2) y un objetivo de 40X a imagen regiones más pequeñas del cerebro, tales como las neuronas DA en la región de clúster Paired anterior medial (PAM) (ejemplos en la Figura 3). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+flies+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fruit flies in biomedical research.</a> Genetics. 199, 639-653 (2015).</li>
<li>Bellen, H. J., Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morgan%27s+legacy%3A+fruit+flies+and+the+functional+annotation+of+conserved+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes.</a> Cell. 163, 12-14 (2015).</li>
<li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuronal+architecture+of+the+mushroom+body+provides+a+logic+for+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning.</a> Elife. 3, 04577(2014).</li>
<li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).</li>
<li>Yamagata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dopamine+neurons+mediate+reward+signals+for+short-+and+long-term+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).</li>
<li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+tools+for+multicolor+stochastic+labeling+reveal+diverse+stereotyped+cell+arrangements+in+the+fly+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).</li>
<li>Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Plasticity%3A+Dopamine+Tunes+the+Mushroom+Body+Output+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network.</a> Curr Biol. 26, 109-112 (2016).</li>
<li>Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroarchitecture+and+neuroanatomy+of+the+Drosophila+central+complex%3A+A+GAL4-based+dissection+of+protocerebral+bridge+neurons+and+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits.</a> J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).</li>
<li>Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+adult+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of adult Drosophila brains.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li>
<li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil%3A+anatomical+and+physiological+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5(2009).</li>
<li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205(2010).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pathology+and+muscle+and+dopaminergic+neuron+degeneration+caused+by+inactivation+of+Drosophila+Pink1+is+rescued+by+Parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).</li>
<li>Greene, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pathology+and+apoptotic+muscle+degeneration+in+Drosophila+parkin+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).</li>
<li>Whitworth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutathione+S-transferase+activity+rescues+dopaminergic+neuron+loss+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).</li>
<li>Pesah, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+parkin+mutants+have+decreased+mass+and+cell+size+and+increased+sensitivity+to+oxygen+radical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress.</a> Development. 131, 2183-2194 (2004).</li>
<li>Trinh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decaffeinated+coffee+and+nicotine-free+tobacco+provide+neuroprotection+in+Drosophila+models+of+Parkinson%27s+disease+through+an+NRF2-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson's disease through an NRF2-dependent mechanism.</a> J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).</li>
<li>Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+s-transferase+omega+1+activity+is+sufficient+to+suppress+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease.</a> J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con un creciente interés en el uso de adultos Drosophila cerebro para estudiar enfermedades humanas, los circuitos neuronales del cerebro y las funciones cerebrales superiores, es necesario desarrollar métodos simples y rápidos para obtener cerebros de moscas intactas para análisis de todo el montaje, lo cual es especialmente importante para a gran escalar las pantallas basadas en el cerebro. Nuestro método proporciona una forma sencilla y fácil de aprender enfoque para diseccionar una cabeza de mosca (a menudo...

El organismo modelo Drosophila, comúnmente conocida como la mosca de la fruta, durante mucho tiempo ha sido valorado por sus herramientas genéticas elegantes, tiempos cortos reproductivos, y muy conservadas vías moleculares y celulares. La mosca de la fruta ha sido empleado con éxito para diseccionar las vías de señalización básicos, los mecanismos de modelado de los organismos multicelulares, así como los mecanismos que subyacen en el desarrollo neuronal, funciones, enfermedades y 1,2. Con los recientes avances en las tecnologías de etiquetado celular y de formación de imágenes, el cerebro mosca de la fruta se ha vuelto especialmente potente en mapeo fino de la circuitería neuronal y en la disección de la base molecular y celular de las funciones cerebrales superiores, como el aprendizaje y la memoria, y el ritmo circadiano 1,3, 4.5.6.7.8. Una ventaja particular del sistema Drosophila es su tamaño relativamente pequeño, lo que permite todo el montaje preparación y el examen del cerebro usando un compuesto de regular o microscopio confocal. Thicaracterística s permite un análisis detallado anatómicas y funcionales de los circuitos neuronales, o incluso una sola neurona, a nivel celular y subcelular, en el contexto de un tejido de todo el cerebro, lo que proporciona tanto una visión integral del tema estudiado y su geometría exacta dentro del conjunto cerebro. Sin embargo, dado el tamaño miniatura en lugar del cerebro, sino que también presenta un desafío técnico en la disección de una manera eficiente el tejido cerebral intacto fuera de la caja protectora de la cabeza exoesqueleto en una mosca adulta. Varios métodos eficaces y relativamente simples de disección se han descrito en detalle, que por lo general implican cuidado y paso a paso la eliminación de la caja de cabeza y los tejidos asociados incluyendo los ojos, la tráquea, y grasa del cerebro adecuada 9, 10. Estos métodos de disección microquirúrgica menudo imponer exigencias más estrictas sobre la calidad de las pinzas de disección, apoyándose en unas pinzas finas con puntas bien alineados que se pueden dañar fácilmente. Además, como los cerebros disecados son a menudo separated del resto del cuerpo, el cerebro pueden perderse fácilmente durante los subsiguientes procesos de tinción y lavado debido a su pequeño tamaño y su transparencia en el tampón de procesamiento. A continuación, se describe un protocolo de disección de un paso relativamente simple y fácil de aprender, por cerebros adultos que mantienen los cerebros disecados unidos al torso. El proceso de disección a menudo desaparece con facilidad a la mayoría de los tejidos del cerebro asociada tal como el ojo y la tráquea y reduce la demanda de pinza de disección buena calidad. Además, cuando la formación de imágenes del cerebro bajo el microscopio compuesto fluorescente o un microscopio confocal, el lado del cerebro que está lejos de la fuente de luz fluorescente a menudo produce una señal más débil y menos imágenes nítidas debido a que el espesor del cerebro todo el montaje. Aquí, también se describe un método de montaje simple que permite una fácil mover de un tirón de las muestras de cerebro, lo que permite formación de imágenes conveniente de ambos lados del cerebro con intensi señal similarTy y calidad. Como una prueba de concepto para la aplicación de este método para estudiar el cerebro adulto, hemos examinado aún más la presencia de las neuronas dopaminérgicas en el cerebro de las moscas w 1118; un genotipo que se utiliza a menudo como la línea parental para la generación de moscas transgénicas y el control de tipo salvaje en muchos estudios de Drosophila.

<table><tbody><tr><td>w*; &nbsp; parquey Delta; 21/TM3,&nbsp; P{GAL4-Kr.C}DC2,&nbsp; P{UAS-GFP. S65T}DC10,&nbsp; Sb1</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>51652</td><td>El equilibrador se cambió a TM6B</td></tr><tr><td>PBac{WH}parkf01950</td><td>Exelixis en la Facultad de Medicina de Harvard</td><td>f01950</td><td>El equilibrador se cambió a TM6C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (NaHCO3)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-990</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio, monobásico monobásico (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-198</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-265</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-500G</td><td>Reemplaza la glucosa</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore&nbsp; Filtros de membrana de PVDF Durapore: hidrófilos: 0,22 y micro; m Tamaño de poro</td><td>Fisher Scientific</td><td>GVWP14250</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formol, 10% (histológico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-20</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio, dibásico, polvo, biorreactivo ultrapuro</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-823</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Excelta Pinzas de precisión con puntas muy finas</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-456-055</td><td>El protocolo no requiere puntos muy finos.</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P40101</td><td></td></tr><tr><td>Rat-Elav-7E8A10</td><td>Anti-Elav Los Estudios del Desarrollo Hibridoma Banco</td><td>Clon 7E8A10</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-rata IgG (H+L) contra cabras, conjugado Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-Rabbit IgG (H+L) para cabras, conjugado Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr><td>Solución DAPI (1 mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Polvo de galato de propilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol ACS reactivo, &ge; 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axioimager Z1</td><td>Zeiss</td><td>Quote</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Apotome.2</td><td>Zeiss</td><td>Quote</td><td></td></tr><tr><td>Zen lite software</td><td></td><td>Quote</td><td></td></tr></tbody></table>

un simple de un solo paso para la disección protocolo todo el montaje preparación de adulto<em&gt; drosophila</emlos cerebros&gt;

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Existe un interés creciente en el uso de Drosophila para modelar enfermedades degenerativas del cerebro humano, el mapa circuitería neuronal en el cerebro adulto, y el estudio de las bases moleculares y celulares de las funciones cerebrales superiores. Una preparación de todo el montaje de los cerebros de adultos con una morfología bien conservada es fundamental para este tipo de estudios integrales basados ​​en el cerebro, pero puede ser técnicamente difícil y requiere mucho tiempo. Este protocolo describe un enfoque disección de un paso fácil de aprender, de una cabeza de mosca adulta en menos de 10 s, mientras se mantiene el cerebro intacto unido al resto del cuerpo para facilitar las etapas de procesamiento posteriores. El procedimiento ayuda a eliminar la mayor parte de los tejidos del ojo y traqueales normalmente asociadas con el cerebro que puede interferir con la etapa de formación de imágenes más tarde, y también pone menos demanda de la calidad de los fórceps de disección. Además, se describe un método simple que permite flipping conveniente de las muestras de cerebro montados sobre un cubreobjetos, que es importante para obtener imágenes de ambos lados de la blluvias con intensidad de señal similar y la calidad. Como un ejemplo del protocolo, se presenta un análisis de las neuronas dopaminérgicas (DA) en cerebros adultos de WT (1118 w) vuela. La alta eficacia del método de disección hace que sea especialmente útil para los estudios basados en el cerebro adulto a gran escala en Drosophila.

La Figura 1 ilustra los principales procedimientos para la disección cerebro adulto, como se describe anteriormente Las figuras 2 y 3 son imágenes representativas de 3 días de edad WT. (Genotipo: w 1118) mosca adulta cerebros, que fueron costained con un anticuerpo contra tirosina hidroxilasa (TH , coloreado en rojo en la figura 2 y blanco en la figura 3), un marcador comúnmente utili...

El adulto de Drosophila cerebro es un sistema valioso para el estudio de los circuitos neuronales, las funciones cerebrales superiores, y los trastornos complejos. Un método eficaz para diseccionar el tejido cerebral entera de la cabeza pequeña mosca que facilitará los estudios basados ​​en el cerebro. Aquí se describe un protocolo de disección simple, de un solo paso de cerebros adultos con una morfología bien conservada.

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

El objetivo general de este protocolo es describir un procedimiento sencillo de disección en un solo paso para cerebros de Drosophila adultos, que pueda producir rápidamente cerebros con una morfología bien preservada, adecuados para análisis en montaje completo. Este método puede ayudar a responder preguntas en los campos de la neurociencia y la genética, incluyendo la cartografía detallada de circuitos cerebrales, el estudio de los efectos de manipulaciones genéticas en neuronas y la caracterización funcional de genes.La principal ventaja de esta técnica es que implica un procedimiento fácil de aprender. Puede facilitar la disección de un cerebro de mosca adulta con una morfología bien preservada en menos de 10 segundos. La demostración en video de este método es fundamental, ya que controlar el momento necesario al soltar la pinza para arrancar el exoesqueleto que rodea la cabeza de la mosca requiere habilidad y práctica.Estas pequeñas y molestas moscas de la fruta nos han enseñado mucho sobre los principios biológicos. También podrían ayudarnos a encontrar las causas y tratamientos para enfermedades humanas, como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. Utilizando un microscopio estereoscópico ajustado a un aumento de 1,2 X, inmovilice una mosca anestesiada y sumérjala en solución fría de disección con el abdomen orientado hacia arriba.Mantenga la pinza en un ángulo de 160 a 170 grados con respecto a la placa de disección, y luego ejerza una pequeña fuerza sobre el abdomen de la mosca. Esto inmovilizará a la mosca, forzará la cabeza hacia atrás entre 15 y 25 grados y extenderá la probóscide hacia arriba. Tras esta maniobra, debería hacerse evidente una región blanda y translúcida del exoesqueleto debajo de la probóscide.Aumente el aumento y ajuste el plano focal sobre esta región. Con la mano dominante, tome un par de pinzas de disección y ejerza presión para cerrar las puntas. Coloque las pinzas perpendicularmente a las pinzas que sujetan la mosca.Atraviese con las puntas cerradas de la pinza la región blanda y translúcida de la cutícula, teniendo cuidado de no penetrar tan profundamente que toquen el cerebro. Luego, libere rápidamente pero con firmeza las puntas de la pinza, de modo que se abran y arranquen el exoesqueleto de la cabeza de la mosca. Utilice el impulso generado al abrir las puntas de la pinza para retirar suavemente, en un solo movimiento, el exoesqueleto y la mayor parte de la cápsula craneal, junto con el ojo y la tráquea asociados, del tejido cerebral.Debería ser visible ahora un cerebro intacto. Utilizando la pinza, retire cuidadosamente los tejidos accesorios restantes, como el tejido fibroso blanco de la tráquea, teniendo cuidado de no tirar ni dañar el cerebro propiamente dicho. Coloque las muestras de cerebro disecadas junto con los torsos asociados en aproximadamente un mililitro de paraformaldehído al 4% sobre hielo durante 40 a 60 minutos.Retire el paraformaldehído y luego enjuague las muestras con un mililitro de PBS 1X pipetando la solución hacia arriba y hacia abajo tres veces, teniendo cuidado de no aspirar los cerebros. A continuación, retire el PBS y lave cinco veces con un mililitro de PBT 1X durante cinco minutos cada vez con agitación rotatoria. Añada el anticuerpo primario de interés en la dilución adecuada.A continuación, incubar las muestras durante la noche a cuatro grados Celsius con agitación suave. Retirar el anticuerpo primario y lavar las muestras cinco veces con un mililitro de PBT 1X durante cinco a 10 minutos cada lavado con agitación suave. Añadir el anticuerpo secundario a las muestras lavadas en la dilución y tiempo de incubación adecuados.A continuación, lave las muestras seis veces con un mililitro de PBT 1X durante 10 minutos cada vez con agitación rotatoria. Este paso es fundamental para eliminar cualquier anticuerpo secundario unido de forma no específica. Incube las muestras en una dilución 1:10,000 de DAPI a un miligramo por mililitro en un mililitro de solución PBT 1X durante 30 a 60 minutos con agitación rotatoria.Finalmente, enjuague las muestras añadiendo un mililitro de PBS 1X y luego pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo tres veces. Coloque un cubreobjetos sobre un portaobjetos de montaje. Utilizando una pipeta con la punta cortada, transfiera los cerebros en solución de PBS 1X sobre el cubreobjetos.A continuación, utilizando pinzas, separe los cerebros de los cuerpos. Use una punta de pipeta fina para eliminar el líquido alrededor del tejido cerebral. Y luego, agregue de 20 a 40 microlitros de medio de montaje antifade.Extienda suavemente los cerebros, desplazando al mismo tiempo el medio viscoso hacia afuera. Comenzando desde un lado, baje suavemente un segundo cubreobjetos sobre las muestras, teniendo cuidado de minimizar el contacto del cerebro con las burbujas. Deje que los cubreobjetos se asienten y luego retire cualquier líquido excesivo del borde de los mismos utilizando una toallita de laboratorio.Utilice un pequeño trozo de cinta para sujetar temporalmente el par de cubreobjetos al portaobjetos de montaje. Para obtener imágenes de las muestras, utilice un microscopio compuesto fluorescente o confocal. Estas imágenes muestran vistas anterior y posterior del mismo Drosophila adulto.Los núcleos celulares se visualizaron mediante tinción con DAPI y las neuronas se marcaron usando un marcador pan-neuronal y anticuerpos anti-ELAV. Las neuronas dopaminérgicas, o DA, se revelaron mediante tinción con anticuerpos anti-TH. Se observaron niveles similares de intensidad entre ambos lados del cerebro para todos los canales de imagen.Vistas ampliadas de la parte anterior y posterior del cerebro permiten un examen detallado de los grupos neuronales de DA. El grupo medial anterior apareado puede observarse en las imágenes anteriores, y los grupos mediales posteriores apareados y los grupos laterales posteriores apareados en el lado posterior del cerebro. La cuantificación de estas neuronas reveló que moscas macho de tres días de edad de la cepa w1118 típicamente tienen 27 neuronas de DA en el grupo PPM en todo el cerebro, 16 en el grupo PPL por hemisferio y cinco en el grupo PAL por hemisferio.Se observó un promedio de 97 neuronas dopaminérgicas en cada uno de los grupos PAM. La reconstrucción 3D de los grupos PAL y PAM también mostró que las neuronas dopaminérgicas en el grupo PAM tienen tamaños relativamente pequeños y una tinción de TH más débil que las de otros grupos, como el PAL. Cada vez más estudios se están centrando en los cerebros de moscas adultas para analizar las vías moleculares y la conectividad neuronal que subyacen a las funciones cerebrales superiores, y para modelar enfermedades cerebrales humanas.En estudios basados en el cerebro como estos, será necesario preparar eficientemente muestras cerebrales con una morfología bien preservada. Esto podría ser especialmente importante en análisis a gran escala basados en el cerebro. Tuve por primera vez la idea de este método mientras intentaba sostener moscas con la pinza.En lugar de pinzas con puntas afiladas que la mayoría de los investigadores de Drosophila utilizan, Shebna probó pinzas de extremo romo y descubrió que era más fácil diseccionar los cerebros. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de 10 segundos si se realiza correctamente. En una ocasión, diseccioné cerca de 100 cerebros de seis genotipos diferentes para un experimento en tan solo un día.Aunque este procedimiento de disección pueda parecer sencillo, es importante practicarlo primero con moscas desechables. El investigador también podría tener dificultades para colocar la pinza sin dañar el cerebro de la mosca. Los cerebros diseccionados pueden utilizarse para otros estudios, como hibridación in situ, extracción de proteínas y muestras de ARN a partir del tejido cerebral.Después de ver este video, usted debería ser capaz de diseccionar cerebros de mosca con una morfología bien preservada. Predecimos que se podrían desarrollar mejoras para hacer este procedimiento más sencillo y rápido. Esto podría potencialmente automatizarse en el futuro para estudios a gran escala.No olvide que trabajar con paraformaldehído y pinzas de disección afiladas puede ser peligroso. Tome precauciones, como usar guantes, al manipular soluciones fijadoras, y una vez que la disección haya finalizado, coloque inmediatamente la tapa a las pinzas antes de guardarlas.

a-simple-one-step-dissection-protocol-for-whole-mount-preparation

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

Se describe el procedimiento para preparar...

Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones

Este video describe un método para montar cerebros intactos de moscas adultas debajo de un portaobjetos de puente y muestra el protocolo realizado en cerebros inmunoteñidos para microscopía fluorescente.

Montaje de cerebros adultos de Drosophila: un método para preparar portaobjetos para la obtención de imágenes confocales

Este video describe cómo diseccionar y aislar el cerebro adulto de Drosophila, un procedimiento necesario para visualizar el órgano, que de otro modo estaría oscurecido por la cutícula, el ojo y el tejido traqueal. El protocolo de ejemplo muestra una demostración detallada que produce preparaciones de alta calidad que se pueden utilizar para la inmunotinción y los métodos de imagen en la neurobiología de Drosophila.

Drosophila Disección del cerebro de adultos: un método en neurobiología de moscas

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Células de mostrar diferentes morfologías y establecen una variedad de interacciones con sus vecinos. Este protocolo describe cómo revelar la morfología de las células y para investigar la interacción célula-célula mediante el bien establecido sistema de expresión de Gal4/UAS.

Aplicación de la técnica de FlpOut MultiColor para estudiar morfología unicelular de alta resolución y las interacciones de la célula de Glia en Drosophila

Este artículo presenta un método quirúrgico para disección Drosophila pupas retinas junto con protocolos para el procesamiento del tejido para la extracción de RNA, inmunohistoquímica y análisis occidental.

Disección de la Retina Pupal de Drosophila para inmunohistoquímica, Western análisis y aislamiento de ARN

Aquí, proporcionamos protocolos para realizar tres ensayos simples de degeneración de axón inducida por lesiones (muerte por axón) en Drosophila melanogaster para evaluar la preservación morfológica y funcional de los axones cortados y sus sinapsis.

Evaluación morfológica y funcional de los axónyis y sus sinapsis durante la muerte de Axon en Drosophila melanogaster

Este protocolo describe tres pasos para preparar los lóbulos ópticos de larvas y adultos de Drosophila para la obtención de imágenes: 1) disecciones cerebrales, 2) inmunohistoquímica y 3) montaje. Se hace hincapié en el paso 3, ya que se requieren distintas orientaciones de montaje para visualizar estructuras específicas de lóbulos ópticos.

Disección, inmunohistoquímica y montaje de cerebros de larvas y adultos de Drosophila para la visualización del lóbulo óptico

Este estudio presenta un protocolo simplificado para el procesamiento de tejidos que involucra decapitación, fijación, criosección, tinción de fluorescencia, inmunotinción e imágenes, que puede extenderse a imágenes confocales y multifotónicas. El método mantiene una eficacia comparable a las disecciones complejas, evitando la necesidad de habilidades motoras avanzadas. El análisis cuantitativo de imágenes ofrece un amplio potencial de investigación.

Criosección directa de cabezas de Drosophila para mejorar la tinción de fluorescencia cerebral y la inmunotinción

Aprende un protocolo de disección de un solo paso para cerebros adultos de Drosophila con morfología bien preservada en menos de 10 segundos. Este método facilita investigaciones en neurociencia y genética.

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto

Explorar más videos