Aplicación de la técnica de FlpOut MultiColor para estudiar morfología unicelular de alta resolución y las interacciones de la célula de Glia en Drosophila

El objetivo general de esta técnica es visualizar morfologías de células individuales en tejidos anatómicos complejos, simplificando así el estudio de la interacción célula y celular en Drosophila. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre morfologías complejas e interacciones celulares con la mosca de la fruta. La principal ventaja de esta técnica es que se puede adaptar al estudio de morfologías unicelulares en cualquier tejido y en cualquier etapa de desarrollo.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Anja Kieser, técnica de nuestro laboratorio. La técnica MCFO modifica la técnica FlpOut estándar de la siguiente manera. Una recombinasa FLP de choque térmico y diferentes reporteros permanecen bajo el control de UAS, sin embargo, cada reportero tiene una columna vertebral común de una superplegadora GFP miristoilada, en la que se han insertado copias de una etiqueta de epítopo.

Las proteínas no fluorescentes resultantes se denominan GFP del monstruo de espagueti y se identifican con anticuerpos. Dependiendo del número de escisiones, se expresa una combinación diferente de epítopos. Debido a que el promotor HSP está ligeramente activo a 25 grados centígrados, la configuración cruza a 18 grados centígrados, donde está realmente inactivo.

Luego, espere alrededor de 20 días para obtener la generación F1. Clasifique las hembras y los machos F1 en viales separados. Para someterlos a una descarga térmica, primero transfiéralos a viales de alimentos frescos cuando tengan tres o cuatro días de edad.

Las moscas más jóvenes pueden ser demasiado delicadas para el choque térmico. A continuación, transfiera los viales a un baño de agua a 37 grados centígrados. Sumérjalos profundamente para asegurar un choque térmico homogéneo.

Para el marcaje disperso de las células gliales, comience con cinco a ocho minutos de choque térmico y luego optimícelo. El tiempo óptimo de choque térmico marcará escasamente las celdas objetivo y su relación depende del controlador GAL4 específico en uso. Después del choque térmico, coloque los viales horizontalmente en el banco durante unos minutos para enfriarlos.

Ahora, comience a mantener las moscas a 25 grados centígrados en los mismos viales. Después de dos días, la expresión reportera será óptima y las moscas podrán ser diseccionadas. En preparación, coloque tres pozos de depresión profunda en hielo.

Llene un pocillo con etanol al 70%, otro con PBS y otro con medio de cultivo celular S2. Luego, cargue un plato de disección de tres centímetros forrado con silicona negra con S2 frío. Realice todas las disecciones en S2 para mantener los tejidos sanos. Ahora, anestesia a las moscas con dióxido de carbono.

Luego, usando pinzas o una pluma, ponga las moscas en etanol frío al 70% durante unos 30 segundos, seguido de PBS frío durante aproximadamente 30 segundos y luego transfiéralas a S2 frío. Por lo tanto, lave todas las moscas que se van a diseccionar. Hasta 10 moscas de un genotipo suelen ser suficientes. Ahora, en 30 minutos, disecciona todos los cerebros.

Primero, separa la cabeza del resto del cuerpo y desecha el cuerpo. Mantenga la cabeza sostenida con la mano izquierda durante toda la disección o será muy difícil recuperar el agarre de ella. A continuación, saque un ojo agarrando el tejido justo debajo de la retina.

A continuación, extraiga el otro ojo y exponga así el cerebro y los tejidos circundantes. A continuación, retire todo el tejido traqueal y la cutícula restante alrededor del cerebro, hasta que el tejido cerebral parezca limpio. Se debe eliminar todo el tejido traqueal para obtener resultados óptimos de tinción.

Esto es todo lo que se necesita para preparar el cerebro para la fijación. Proceda con la disección de todos los cerebros, mientras mantiene los cerebros diseccionados en S2 frío. Trate de tener hasta 10 cerebros preparados por tubo de microcentrífuga para una tinción óptima. Transfiera los cerebros aislados con una punta de pipeta P10 a un tubo de microcentrífuga de 200 microlitros con solución fijadora.

Nunca manipule el cerebro con fórceps. Incubar los tejidos protegidos de la luz. Evite aspirar el cerebro durante las transferencias de solución.

Para retirar el fijador, utilice tres o más lavados de 15 minutos con solución de lavado. A continuación, bloquee los tejidos con una solución bloqueadora durante 30 minutos o más. A continuación, reemplace la solución de bloqueo con anticuerpos primarios diluidos en solución de lavado e incube los cerebros durante la noche a cuatro grados centígrados.

Para eliminar los anticuerpos primarios, use tres lavados de una hora en solución de lavado. A continuación, agregue anticuerpos conjugados con fluoróforos secundarios en una solución de lavado e incube los cerebros durante la noche a cuatro grados centígrados o durante cuatro horas a temperatura ambiente. Para lavar completamente los anticuerpos no unidos, use tres lavados de una hora en solución de lavado seguidos de un lavado más prolongado con PBS.

Luego monta los cerebros. Prepare dos cubreobjetos con un espaciador de imaginación. En el espaciador y en el cubreobjetos adicional, aplique 10 microlitros de medio de montaje con un agente antidecoloración.

A continuación, con una pipeta P10, transfiera los cerebros al cubreobjetos, depositándolos junto al medio junto con un poco de PBS. No permita que el tejido se seque. Ahora, mueva con cuidado los cerebros al medio de montaje con la pipeta y finalmente muévalos al medio en el espaciador y colóquelos con pinzas.

A continuación, retire el revestimiento adhesivo de los espaciadores y coloque un cubreobjetos. Asegure el cubreobjetos con un poco de presión con pinzas y proceda inmediatamente con la obtención de imágenes o guarde los portaobjetos a menos 20 grados centígrados para su posterior análisis. Usando los métodos descritos, tres diferentes reporteros marcados con membrana se mantienen en silencio mediante terminadores transcripcionales flanqueados por sitios FRT.

Cuando los animales fueron sometidos a un choque térmico, se expresó la FLP recombinasa y se eliminaron aleatoriamente los terminadores, lo que llevó a la expresión de diferentes combinaciones de reporteros. En general, las diferentes combinaciones de reporteros proporcionan siete colores diferentes, por lo que se pueden visualizar y estudiar individualmente múltiples morfologías de células individuales. Se probaron varios tiempos de choque térmico con EG-GAL4 y ALG-GAL4.

El marcaje de una sola célula se analizó en la región del lóbulo antenal del cerebro. El impulsor EG-GAL4 se expresa en células gliales envolventes que se envuelven en la superficie del lóbulo antenal. En comparación, la glía similar a los astrocitos dirigida por ALG-GAL4, cubrió en su mayoría áreas no superpuestas del lóbulo antenal.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar células individuales en solución. Con el fin de comprender sus relaciones complejas y anatómicas utilizando Drosophila y, en principio y en organismo modelo, en el que se puede aplicar el sistema binario GAL4 UIS. Al intentar este procedimiento por primera vez, es importante recordar primero optimizar el tiempo de choque térmico y seguir en la medida de lo posible los pasos individuales del protocolo de tinción para obtener los mejores resultados.