Name: Aplicación de la técnica de FlpOut MultiColor para estudiar morfología unicelular de alta resolución y las interacciones de la célula de Glia en Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende la técnica MCFO para visualizar morfologías unicelulares y estudiar interacciones celulares en Drosophila. Este método utiliza el sistema Gal4/UAS y permite analizar tejidos complejos en cualquier etapa del desarrollo.

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Los autores agradecen a Arnim Jenett Aljoscha Nern y otros miembros del laboratorio Rubin de asesoramiento e intercambio de reactivos no publicados y el Janelia volar luz equipo de proyecto para la generación de imágenes confocales. Los autores también agradecen a los miembros del laboratorio galo de comentarios sobre el manuscrito.

1. preparación de moscas para los experimentos de FlpOut MultiColor (MCFO) Nota: técnica MCFO el se refiere a una versión modificada de la supresión de casete parada mediada por Flp llamada (FlpOut). Moscas transgénicas de MCFO llevan un promotor de choque térmico (hsp)-Flp recombinase y diferentes reporteros en UAS de control. Cada reportero consiste en un esqueleto común de myristoylated (myr) super carpeta verde fluorescente en una proteína (sfGFP), que 10 copias de una etiqueta del epítopo (e.g., HA, bandera o V5) se han insertado. Las proteínas no fluorescente resultantes se nombran &#34; monstruo espagueti Pfg &#34; (smGFPs) 14 y pueden ser detectadas utilizando anticuerpos específicos contra las etiquetas de epítopos diferentes.
<ol><li>Cruz vuela con el casete MCFO y hsp-Flp (hsp-Flp, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) a las correspondientes líneas gliales de conductor en GAL4 (véase tabla de materiales) .
	<ol><li>El hsp ya está activo a 25 ° C y pocas células pueden sufrir recombinación hacia un etiquetado inespecíficas, establece cruces a 18 ° C para evitar la filtración del sistema. Esperar alrededor de 20 días a 18 ° C para obtener la generación F1. Tras el calor del choque (ver paso 2), mantener moscas a 25 ° C ( figura 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. Choque de calor Nota: dependiendo del sitio de inserción, puede variar la eficacia de la hsp-Flp; por lo tanto, el tiempo de descarga de calor óptimo tiene que ser optimizado. De este protocolo, se ha utilizado un stock mosca MCFO que el hsp-Flp fue insertado en el cromosoma X (véase Tabla de materiales).
<ol><li>Transferencia de la progenie de la Cruz en el paso 1.1 (moscas de generación F1, 3-4 días de edad) en nuevos frascos de alimento y calor les choque a 37 ° C en un baño de agua. 
	Nota: Las moscas jóvenes (1-2 días) son muy sensibles al choque térmico. Esperar 1 o 2 días más antes de realizar el choque térmico para reducir la tasa de mortalidad causada por el tratamiento. Algunos de la generación F1 vuela como control, sin choque térmico uso.</li>
	<li>Durante el choque del calor, mantener moscas en frascos normales con alimentos para disminuir la tasa de mortalidad inducida por el estrés. Poner hembras y machos en viales independientes.</li>
	<li>No se olvide de sumergir el frasco entero en el agua para un choque de calor homogéneo. Utilizar un choque de 5-8 min como punto de partida conveniente para el etiquetado dispersos de células de la glia con muchas líneas de controlador GAL4; la duración de choque debe optimizarse para cada conductor y el experimento (tiempos de choque de calor menor o mayor pueden ser necesarios).</li>
	<li>Después del choque del calor, poner los frascos horizontalmente sobre la mesa durante unos minutos para permitir que las moscas para recuperarse del choque del calor. 
	Nota: No es necesario cambiar los frascos de.</li>
	<li>Mantener las moscas a 25 ° C y diseccionarlos (ver paso 3 y 4) 2 o más días después del choque del calor para la expresión óptima del reportero.</li>
</ol> 3. Preparación de disección y soluciones <ol><li>el día de la disección, preparar solución fresca de fijación en tubos PCR de 200 μL mezclando 180 μl de medio de cultivo celular de S2 con 20 μl del 20% paraformaldehido (PFA) para obtener una solución 2% de la PFA. Mantener la solución fijadora en el hielo antes y durante la disección. 
	PRECAUCIÓN: PFA es tóxica y debe manipularse con cuidado. 
	Nota: Mezclar 160 μl de medio de cultivo celular de S2 con 40 μl del 20% paraformaldehido (PFA) en un tubo PCR de 200 μL para preparar una solución PFA 4% en lugar de una solución al 2%.</li>
	<li>Utilizar un tubo de PCR por genotipo con un máximo de 8-10 cerebros por el tubo para obtener resultados óptimos tinción.</li>
	<li>Preparar el cerebro adulto, solución de lavado: albúmina de suero bovino de 0.5%, 0.5% Tritón X-100 en PBS. 
	Nota: Dependiendo de la tinción, una solución que contiene 1% Tritón X-100 puede ser necesaria. Una mayor concentración de Triton X-100 aumenta la penetración de los anticuerpos en el tejido y es necesario a las regiones de manchas que se encuentran dentro del tejido (por ejemplo, regiones sinápticas en el cerebro adulto de Drosophila).</li>
	<li>Prepare la solución de bloqueo: suero de cabra normal 3%, 3% burro normal suero y 0.5% Tritón X-100 en PBS.</li>
	<li>El cerebro adulto de lavado solución y la solución de bloqueo puede almacenarse a 4 ° C durante algunas semanas.</li>
	<li>Poner la placa de cristal de pozos de depresión profunda en el hielo y rellenar cada uno con las siguientes soluciones: uno con etanol al 70%, uno con PBS y otro con medio de cultivo celular S2.</li>
</ol> 4. Disección de cerebro adulto <ol><li>colocar un 3 cm plato de disección en el escenario de un estereomicroscopio y llenar con medio de cultivo de células de S2 frío. Llevar a cabo todas las disecciones en este medio para que el tejido permanezca saludable durante el procedimiento de disección. 
	Nota: Utilice un plato disección con varios milímetros de silicona negra que proporciona un contraste de fondo buena (en las imágenes) y preservar el fórceps durante la disección.</li>
	<li>Anestesiar las moscas del genotipo deseado con CO 2.</li>
	<li>Con pinzas, coge la mosca por las alas y lavar en etanol frío al 70% durante 30 s, luego con PBS frío adicional 30 s.</li>
	<li>Transferencia de la mosca en la profunda depresión bien relleno con medio de cultivo celular S2.</li>
	<li>Repetir el mismo procedimiento para todas las moscas del mismo genotipo y mantenerlas en frío medio de cultivo celular de S2 hasta la disección, que preserve el tejido. 
	Nota: Anestesiar sólo el número de moscas que puede ser disecado en un período de tiempo de unos 30 minutos largos tiempos de incubación en medio de cultivo celular de S2 puede dañar el tejido.</li>
	<li>Agarrar la mosca con fórceps y, bajo un estereomicroscopio, sumerja la mosca en medio de cultivo celular S2.</li>
	<li>Separar la cabeza del resto del cuerpo. Deseche el cuerpo y mantener la cabeza sumergida en el medio de cultivo celular de S2. Es muy importante sostener la cabeza con unas pinzas para toda la duración de la disección. Si la cabeza empieza a flotar, va a ser difícil recuperarlo sin dañar el tejido.</li>
	<li>Comenzar la disección sacando un ojo, mientras sostiene la cabeza con pinzas al menos una en todo momento. Asegúrese de que la punta de las pinzas es justo debajo de la retina para evitar dañar el tejido por debajo. Saca el otro ojo y empezar a quitar la cutícula hasta el cerebro aparece.</li>
	<li>Eliminar todo tejido traqueal y cutícula alrededor del cerebro aparezca limpiado el tejido. Asegúrese de eliminar todo el tejido traqueal alrededor del cerebro para óptimos resultados de tinción; los tejidos están ahora listos para ser fijados y teñidos.</li>
	<li>Mantener todos los cerebros disecados en frío S2 celular medio de cultivo antes de transferirlos a la solución PFA para el paso de la fijación del tiempo.</li>
</ol> 5. Cerebro adulto la coloración < ol&gt; <li>Transferir el cerebro aislado con una pipeta P10 en la solución de la PFA a temperatura ambiente (RT). Para evitar el daño de tejido, nunca utilice pinzas para transferir el cerebro después de la disección. Realizar todos los pasos en tubos PCR de 200 μL en un nutator.</li>
	<li>Para todos los pasos, antes de tirar la vieja solución con una pipeta de P200, permiten el cerebro colocar en la parte inferior del tubo. Intente extraer el sobrenadante sin aspirar el tejido. Proteger el tejido contra la exposición a la luz.</li>
	<li>Fijar el cerebro en 200 μL de 2% PFA en medio de cultivo celular de S2 durante 1 hora o en el 4% PFA durante 30 minutos. Mantener tiempos de fijación idéntico entre muestras para aumentar la reproductibilidad.</li>
	<li>Después de 3 (o más) lavados de 15 minutos cada uno en 200 μL de solución, de lavado de cerebro adulto bloquear los tejidos con 200 μL de solución de bloqueo durante 30 minutos. Tiempo de incubación en el bloqueo de solución es posible.</li>
	<li>Incubar el cerebro durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios diluidos en cerebro adulto solución de lavado en un volumen total de 200 μl. 
	Nota: Los tiempos de incubación pueden variar dependiendo del tipo de anticuerpo usado. Incubaciones más largas pueden ser necesarias.
	<ol><li>Para el etiquetado de los tres marcadores MCFO, incubar los cerebros con anti-HA (1: 500), anti-FLAG (método DYKDDDDK) (1: 100) y anticuerpos primarios anti-V5.</li>
		<li>Primaria directamente conjugados con anticuerpos podrían ser utilizados en lugar de la normal combinación primaria + secundaria (por ej., anti-V5:DyLight 549 (1: 200)). En este caso, tratar directamente conjugados con anticuerpos como anticuerpos secundarios. 
		Nota: Para cada genotipo, mantenga algunos cerebros como controles para verificar la especificidad de la tinción. Olvidese de la incubación del anticuerpo primario y vaya directamente al paso siguiente.</li>
	</ol></li> <li>Lavar los tejidos 3 veces durante 1 h en 200 μL de solución (paso 3.3) de lavado de cerebro adulto e incubar con secundarios conjugados fluoróforo-primaria directamente anticuerpos conjugados con diluido en cerebro adulto solución de lavado durante la noche en 4 ° C o 4 h a temperatura ambiente, en un volumen total de 200 μL Nota: ejemplos de anticuerpos adecuados: AlexaFluor 488 (1: 250), anti-V5:DyLight 549 (1: 200) y DyLight 647 (1: 100)-conjugado anticuerpos.</li>
	<li>Lavar el cerebro 3 veces durante 1 h en 200 μL de solución, seguida de un lavado final en 200 μL de PBS durante la noche a 4 ° C o por 1-2 h a temperatura ambiente de lavado de cerebro adulto; el paso de lavado final en PBS elimina cualquier rastro de Triton X-100 y es necesario para óptimos resultados de tinción. Montar los cerebros en el medio de montaje con un agente anti-fade en cubreobjetos de cristal.</li>
</ol> 6. Montaje de cerebros para la proyección de imagen <ol><li>Trim una proyección de imagen de espaciador para el tamaño apropiado con unas tijeras. Para microscopía de alta resolución, emparedado de la muestra y proyección de imagen de espaciador entre dos cubreobjetos de cristal. 
	Nota: Los espaciadores de la proyección de imagen son delgada (0,12 mm de espesor) separadores adhesivos que pelan y adhieren al portaobjetos cubreobjetos o microscopio, permitiendo el montaje de especímenes sin compresión.</li>
	<li>Uso de fórceps, retire la lámina protectora adhesiva de una superficie y aplique el espaciador, el lado adhesivo hacia abajo, en la superficie de un vidrio cubreobjetos (22 mm x 60 mm). Aplicar 10 μl de medio de montaje para un cubreobjetos de vidrio nueva.</li>
	<li>Con P10 una pipeta, transferir los cerebros del tubo 200 μL al cubreobjetos, junto a la gota de medio de montaje. Junto con los tejidos, transferir algunos PBS para mantener el cerebro en la solución.</li>
	<li>Pipeta con un P10, mueva los cerebros del PBS a la gota de medio de montaje tratando de limitar la cantidad de PBS. Transferencia de las muestras en medio de montaje sobre el cubreobjetos con el espaciador de la proyección de imagen. Use suficiente medios de montaje para cubrir la muestra.</li>
	<li>Quitar el otro forro adhesivo de la parte superior del espaciador y añadir un cubreobjetos de cristal sobre las muestras. Con la punta de unas pinzas, aplicar una ligera presión sobre el área adhesivo para sellar. Imagen de los tejidos montados inmediatamente o almacenar las diapositivas a-20 ° C para su posterior análisis.</li>
</ol> 7. Adquisición de la imagen <ol><li>pilas de adquisición de imágenes de fluorescencia confocal utilizando un microscopio confocal con un 40 X (NA = 1.2, inmersión en agua) objetivo o 63 X (NA = 1.4, inmersión aceite) objetivo (tamaño de pixel = 1.024 x 1.024 en el plano xy; Distancia entre dos secciones confocales = 0.5 μm). Ajustar la ganancia del detector y el desplazamiento en cada canal de tal manera que no hay pixeles saturados y cero valores de los píxeles están presentes en las imágenes; Esto evita la pérdida de información y asegura uso del rango dinámico completo del detector de. 
	Nota: Puesto que la proyección de imagen 3D es desperdiciador de tiempo, las mediciones pueden automatizarse mediante la exploración de múltiples muestras en paralelo en diferentes lugares. Para evitar la evaporación con el objetivo de inmersión de agua, uso de medio de inmersión de aceite especial con índice de refracción n = 1.33.</li>
	<li>Procesar las pilas confocales para proyecciones de máxima densidad, cambios en el tono del canal y el ajuste de brillo y contraste con cualquier software de análisis de imagen estándar (véase Tabla de materiales).</li>
</ol>

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<li>Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flybow%3A+Genetic+multicolor+cell+labeling+for+neural+circuit+analysis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster.</a> Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).</li>
<li>Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glia+of+the+adult+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The glia of the adult Drosophila nervous system.</a> Glia. 65 (4), 606-638 (2017).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tienen competencia o conflicto de intereses.

Este protocolo describe un método sencillo y eficaz para estudiar la morfología de los diferentes tipos de células en un tejido de interés en alta resolución. Con la técnica MCFO, varios reporteros con epítopos diferentes etiquetas se utilizan en combinación para etiquetado estocástico multicolor (figura 2). Similar a otros métodos como Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO aumenta la diversidad de etiqueta...

Glia, la población de células no neuronales del sistema nervioso (NS), se ha creído durante mucho tiempo para proporcionar un marco estático para las neuronas y por lo tanto no fueron estudiados en detalle. Sin embargo, en los seres humanos, glía constituyen la gran mayoría de las células en el NS (~ 90%) y caída en varias categorías diferentes, incluyendo astrocitos, oligodendrocitos, microglía y células de Schwann. En Drosophila, glía constituyen cerca del 10% de las células en el NS. Curiosamente, sus morfologías y funciones son notablemente similares a las que se encuentran en vertebrados1,2. Sus morfologías incluyen barrera blood - brain (BBB) formación de epitelios, envolvente y astrositos-como las células.
El sistema de nervioso central de Drosophila (CNS) consta de las siguientes estructuras principales: regiones de la corteza que contienen los cuerpos celulares neuronales; neuropils que albergan conexiones sinápticas; tractos de axones pequeños y grandes que conectan diferentes neuropiles; nervios periféricos que conectan músculos y órganos sensoriales con el SNC (figura 1). Glia se encuentran asociados a todas estas estructuras anatómicas: glía (CG) de la corteza en las regiones corticales, astrositos-como glia (ALG) y glía envolvente (GE) en las regiones de neuropilos, glia envolvente también están asociados con tractos axón central y periférico nervios (EGN) y por último, dos de hoja-como glia, glia perineurial (PG) y subperineurial (SPG), que juntos forman una capa contigua que cubre el entero NS (figura 2).
Estudios anteriores han demostrado que glía desempeñan un papel importante en el desarrollo del NS; monitorear el número de células neuronales reaccionando a la circulación sistémica péptidos similares a la insulina, proporcionan apoyo trófico para las neuronas, como la lanzadera de lactato astrositos-neurona y eliminar las neuronas moribundas por fagocitosis3,4 , 5 , 6. en el NS maduro, glia mantener el BBB, tomar neurotransmisores y mantener la homeostasis iónica, actúan como las principales células inmunes en el NS, puesto que los macrófagos no incumple el BBB y modulan la actividad sináptica así como el comportamiento de los animales6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Si los diferentes subtipos gliales realizan funciones especializadas, sigue siendo una incógnita importante. Sin embargo, un análisis sistemático del genoma de glia, especialmente en el adulto, se ha visto obstaculizado por la falta de adecuadas herramientas genéticas para su manipulación. Aquí, se presenta un método que permite la caracterización eficiente y fácil de las formas de la célula para el estudio de las interacciones célula-célula compleja. Esta técnica se ha aplicado para caracterizar la morfología de los diferentes subtipos gliales en el cerebro adulto de Drosophila , pero, según el driver específico de GAL4 utilizado, podría adaptarse para estudiar las neuronas12,13 , cualquier tipo de entrelazar las células y en principio cualquier tejido en cualquier fase del desarrollo.

<table><tbody><tr><td>Baño de agua</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Dumont</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Plato de disección 30 mm x 12 mmm</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>70543-30</td><td>Plato de disección de vidrio</td></tr><tr><td>Pyrex 3 Depression Placa puntual de vidrio</td><td>Corning</td><td>7223-34 Placas de</td><td>disección de vidrio</td></tr><tr><td>Sylgard Black</td><td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td><td>805998</td><td>hecho en casa con carbón vegetal</td></tr><tr><td>Medio de cultivo celular ExpressFive S2</td><td>Invitrogen</td><td>10486-025</td><td></td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Normal suero de burro</td><td>Jackson Laboratories</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino Albúmina</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Conejo HA-tag</td><td>Señalización celular</td><td>C29F4</td><td>Anticuerpo primario, dilución 1:500</td></tr><tr><td>Rata FLAG-tag</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-06712</td><td>Anticuerpo primario, dilución 1:100</td></tr><tr><td>Ratón V5-tag:DyLight 549</td><td>AdSerotec</td><td>0411</td><td>Conjugado anticuerpo, dilución 1:200</td></tr><tr><td>anti-conejo AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Anticuerpo secundario, dilución 1:250</td></tr><tr><td>anti-ratas DyLight 647</td><td>Jackson Laboratories</td><td>712-605-153</td><td>Anticuerpo secundario, dilución 1:100</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SlowFate Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Espaciador de sellado seguro</td><td>Grace Biolabs</td><td></td><td>Contactar con la empresa para realizar un pedido</td></tr><tr><td>Cubreobjetos para microscopios 22 x 60 mm</td><td>Marienfeld</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 22 x 22 mm</td><td>Microscopio</td> estereoscópico Roth <td>H874</td><td></td></tr><tr><td>, Leica MZ6</td><td>Microscopio</td> de barrido láser Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>518 F</td><td>Aceite de inmersión para microscopía de fluorescencia, libre de halógenos</td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>W 2010</td><td>Fluido de inmersión para objetivos de inmersión en agua, libre de halógenos</td></tr><tr><td>R56F03-GAL4 (EG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>39157</td><td>Controlador GAL4</td></tr><tr><td>R86E01-GAL4 (ALG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>45914</td><td>Controlador</td></tr> <tr><td>GAL4hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64085</td><td>UAS reportero (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td></tr><tr><td>Fiji (Imagen J)</td><td></td><td></td><td>Software de análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Multi Time Macro</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Software para escaneo automatizado</td></tr></tbody></table>

aplicación de la técnica de flpout multicolor para estudiar morfología unicelular de alta resolución y las interacciones de la célula de glia en drosophila

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Las células muestran morfologías diferentes y complejas relaciones anatómicas. ¿Cómo las células interactúan con sus vecinos? ¿Las interacciones difieren entre los tipos de la célula o incluso dentro de un tipo determinado? ¿Qué tipo de reglas espaciales siguen? Las respuestas a tales preguntas fundamentales en vivo se han visto obstaculizadas hasta ahora por la falta de herramientas para el etiquetado de celda única de alta resolución. Aquí, se proporciona un protocolo detallado para apuntar las células con una técnica de FlpOut (MCFO MultiColor). Este método se basa en tres diferente etiquetados Reporteros (HA, bandera y V5) bajo control de la UAS que se guardan silenciosos por un terminador transcripcional flanqueado por dos sitios de la FRT (FRT-parada-FRT). Un pulso de choque de calor induce la expresión de un calor inducida por choque Flp recombinase, que elimina al azar los cassettes FRT-parada-FRT en celdas individuales: expresión ocurre solamente en células que expresan también un conductor de GAL4. Esto conduce a una matriz de células diferentemente coloreadas de un tipo celular dado que permite la visualización de la morfología de la célula individual en alta resolución. Por ejemplo, la técnica MCFO puede combinarse con controladores específicos de GAL4 gliales para visualizar la morfología de los diferentes subtipos gliales en el cerebro adulto de Drosophila .

Esta sección ilustra ejemplos de resultados que pueden obtenerse mediante la técnica MCFO en el cerebro adulto de Drosophila . La figura 3 muestra un esquema del método. Tres diferentemente etiquetadas de membrana Reporteros (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-FLAG y myr-smGFP-V5) bajo control de la UAS se guardan silenciosos por un terminador transcripcional flanqueado por dos sitios de la FRT (FRT-parada-FRT). Un pulso de choque de calor in...

Células de mostrar diferentes morfologías y establecen una variedad de interacciones con sus vecinos. Este protocolo describe cómo revelar la morfología de las células y para investigar la interacción célula-célula mediante el bien establecido sistema de expresión de Gal4/UAS.

Aplicación de la técnica de FlpOut MultiColor para estudiar morfología unicelular de alta resolución y las interacciones de la célula de Glia en Drosophila

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

El objetivo general de esta técnica es visualizar las morfologías de células individuales en tejidos anatómicos complejos, simplificando así el estudio de las interacciones entre células en Drosophila. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre morfologías complejas e interacciones entre células utilizando la mosca de la fruta. La principal ventaja de esta técnica es que puede adaptarse al estudio de las morfologías de células individuales en cualquier tejido y en cualquier etapa del desarrollo.La procedura será demostrada por Anja Kieser, una técnica en nuestro laboratorio. La técnica MCFO modifica la técnica estándar FlpOut de la siguiente manera. Una recombinasa FLP inducida por choque térmico y diferentes reporteros permanecen bajo control de UAS; sin embargo, cada reportero tiene un armazón común de GFP súper plegado miroilado, en el cual se han insertado copias de una etiqueta de epítopo.Las proteínas no fluorescentes resultantes se denominan GFP del monstruo espagueti y se identifican mediante anticuerpos. Dependiendo del número de excisiones, se expresa una combinación diferente de epítopos. Dado que el promotor HSP tiene una actividad leve a 25 grados Celsius, realice los cruces a 18 grados Celsius, donde es verdaderamente inactivo.Luego, espere aproximadamente 20 días para obtener la generación F1. Separe las hembras y los machos F1 en viales separados. Para aplicar el choque térmico, primero transfiera los organismos a viales con alimento fresco cuando tengan entre tres y cuatro días de edad.Las moscas más jóvenes pueden ser demasiado delicadas para el choque térmico. A continuación, transfiera los frascos a un baño de agua a 37 grados Celsius. Súmérjalos profundamente para asegurar un choque térmico homogéneo.Para la etiqueta esparsa de células gliales, comience con una exposición al calor de cinco a ocho minutos y luego optimice. El tiempo óptimo de exposición al calor etiquetará de forma esparsa las células diana, y su relación depende del conductor GAL4 específico que se utilice. Después de la exposición al calor, coloque los frascos horizontalmente sobre la mesa durante unos minutos para que se enfríen.Ahora, comience a mantener a las moscas a 25 grados Celsius en los mismos viales. Después de dos días, la expresión del gen reportero será óptima y las moscas podrán disecarse. Como preparación, coloque tres pocillos profundos con cavidad sobre hielo.Llene un pocillo con etanol al 70 %, uno con PBS y otro con medio de cultivo celular S2. Luego, coloque un platillo de disección de tres centímetros forrado con silicona negra con S2 frío. Realice todas las disecciones en S2 para mantener los tejidos sanos. Ahora, anestesie las moscas con dióxido de carbono.Luego, utilizando pinzas o una pluma, coloque las moscas en etanol frío al 70 % durante aproximadamente 30 segundos, seguido de PBS frío durante aproximadamente 30 segundos, y a continuación transfiéralas a S2 frío. De este modo, lave todas las moscas que se van a diseccionar. Habitualmente, hasta 10 moscas de un mismo genotipo son suficientes. Ahora, dentro de los 30 minutos siguientes, extraiga todos los cerebros.Primero, separe la cabeza del resto del cuerpo y deseche el cuerpo. Mantenga la cabeza sujeta con la mano no dominante durante toda la disección, ya que de lo contrario será muy difícil recuperar el agarre. A continuación, extraiga un ojo agarrando el tejido justo debajo de la retina.Luego retire el otro ojo y exponga así el cerebro y los tejidos circundantes. A continuación, elimine todo el tejido traqueal y la cutícula restante alrededor del cerebro, hasta que el tejido cerebral aparezca limpio. Todo el tejido traqueal debe eliminarse para obtener resultados óptimos de tinción.Esto es todo lo necesario para preparar el cerebro para la fijación. Continúe disecando todos los cerebros, manteniendo los cerebros disecados en S2 frío. Intente tener hasta 10 cerebros preparados por tubo microcentrífugo para una tinción óptima. Transfiera los cerebros aislados utilizando una punta de pipeta P10 a un tubo microcentrífugo de 200 microlitros con la solución fijadora.Nunca manipule los cerebros con pinzas. Incube los tejidos protegidos de la luz. Evite aspirar los cerebros durante las transferencias de solución.Para eliminar el fijador, realice tres o más lavados de 15 minutos con la solución de lavado. Luego, bloquee los tejidos con la solución de bloqueo durante 30 minutos o más. A continuación, sustituya la solución de bloqueo por los anticuerpos primarios diluidos en la solución de lavado e incube los cerebros durante la noche a cuatro grados Celsius.Para eliminar los anticuerpos primarios, realice tres lavados de una hora cada uno en la solución de lavado. A continuación, agregue los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo en la solución de lavado e incube los cerebros durante toda la noche a cuatro grados Celsius o durante cuatro horas a temperatura ambiente. Para eliminar completamente los anticuerpos no unidos, realice tres lavados de una hora cada uno en la solución de lavado, seguidos por un lavado más prolongado con PBS.Luego, monte los cerebros. Prepare dos cubreobjetos con un espaciador para imágenes. En el espaciador y en el cubreobjetos adicional, aplique 10 microlitros de medio de montaje con un agente antifade.A continuación, utilizando una pipeta P10, transfiera los cerebros a la laminilla, depositándolos junto al medio y con algo de PBS. No permita que el tejido se seque. Ahora, mueva cuidadosamente los cerebros al medio de montaje usando la pipeta y finalmente colóquelos en el medio dentro del espaciador, acomodándolos con pinzas.A continuación, retire la capa adhesiva de los espaciadores y coloque una lámina de cobertura. Fije la lámina de cobertura aplicando una ligera presión con pinzas y proceda inmediatamente con la adquisición de imágenes o almacene los portaobjetos a menos 20 grados Celsius para su análisis posterior. Mediante los métodos descritos, tres reporteros etiquetados en la membrana se mantienen silenciados por terminadores transcripcionales flanqueados por sitios FRT.Cuando los animales fueron sometidos al choque térmico, se expresó la recombinasa FLP y eliminó aleatoriamente los terminadores, lo que llevó a la expresión de diferentes combinaciones de reporteros. En conjunto, las distintas combinaciones de reporteros proporcionan siete colores diferentes, permitiendo así visualizar y estudiar morfologías de células individuales múltiples de forma independiente. Se probaron diversos tiempos de choque térmico con EG-GAL4 y ALG-GAL4.La etiqueta individual de células se analizó en la región del lóbulo antenal del cerebro. El conductor EG-GAL4 se expresó en células gliales envolventes que rodearon por completo la superficie del lóbulo antenal. En comparación, la glía tipo astrocito dirigida por ALG-GAL4 cubrió áreas mayormente no superpuestas del lóbulo antenal.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar células individuales en solución. Con el fin de comprender sus relaciones complejas y anatómicas utilizando Drosophila y, en principio, en cualquier organismo modelo en el que pueda aplicarse el sistema binario GAL4 UIS. Al intentar este procedimiento por primera vez, es importante recordar primero optimizar el tiempo de choque térmico y seguir lo más posible cada uno de los pasos del protocolo de tinción para obtener los mejores resultados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Se describen las características estructurales de la sinapsis neuromuscular Glia-en una nueva preparación de tejidos de adentro hacia afuera de las larvas de mosca en directo con tintes fluorescentes con microscopía confocal. Hemos marcado terminales de las neuronas en vivo con anticuerpos fluorescentes primaria de HRP, y también se visualiza el espacio perisynaptic con dextranos fluorescentes.

Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

A continuación se describe un protocolo para examinar la migración de las células gliales en el desarrollo del ojo de Drosophila mediante el análisis microscópico directo emparejado con GFP etiquetados células gliales.

Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila

Hemocitos Drosophila se dispersan sobre la totalidad del embrión en desarrollo. Este protocolo demuestra cómo montar y la imagen de estas migraciones el uso de embriones con hemocitos marcados con fluorescencia.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Solo Drosophila Omatidio disección e Imagen

Este video muestra la tinción de inmunofluorescencia de un cerebro transgénico de Drosophila para la obtención de imágenes de células gliales de una sola célula. El cerebro expresa proteínas dirigidas a la membrana fusionadas con diferentes combinaciones de epítopos antigénicos bajo el control de un sistema de recombinasa específico de la glía. Los cerebros aislados y fijos se tiñen con anticuerpos primarios específicos para los epítopos antigénicos, seguidos de anticuerpos secundarios...

Tinción de inmunofluorescencia de cerebros de Drosophila para la obtención de imágenes unicelulares de células gliales

Se presenta una técnica para el etiquetado de las neuronas individuales en el sistema nervioso central (SNC)...

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

En el embrión temprano de Drosophila , muchos orgánulos son móviles. En principio, se pueden obtener imágenes en vivo a través de sondas fluorescentes específicas, pero la cáscara del huevo impide la aplicación directa al embrión. Este protocolo describe cómo introducir tales sondas a través de la microinyección, y luego analizar el movimiento de orgánulos a granel a través de la velocimetría de imagen de partículas.

Visualización del tráfico dependiente de citoesqueletos de orgánulos que contienen lípidos en embriones de Drosophila

Aquí, se describen métodos no invasivos para la localización de proteínas de membrana fotorreceptoras y la evaluación de la degeneración retiniana en el ojo compuesto de Drosophila utilizando fluorescencia eGFP.

Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP

La hibridación in situ iterativa de fluorescencia asistida por expansión (EASI-FISH) es una técnica robusta que combina la microscopía de expansión con la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para detectar la expresión de múltiples genes en tejido grueso. Este protocolo describe los avances recientes en el método y su adaptación para etiquetar el sistema nervioso central intacto de Drosophila.

Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión

Aprende la técnica MCFO para visualizar morfologías unicelulares y estudiar interacciones celulares en Drosophila. Este método utiliza el sistema Gal4/UAS y permite analizar tejidos complejos en cualquier etapa del desarrollo.

Aplicación de la técnica de FlpOut MultiColor para estudiar morfología unicelular de alta resolución y las interacciones de la célula de Glia en Drosophila (Video) | JoVE Journal

Aplicación de la técnica de FlpOut MultiColor para estudiar morfología unicelular de alta resolución y las interacciones de la célula de Glia en Drosophila

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