Drosophila Disección del cerebro de adultos: un método en neurobiología de moscas

- Realizar la disección en un plato con una solución tampón y bajo una iluminación uniforme. Transfiera una mosca, con el lado ventral hacia arriba, al plato y mantenga la preparación sumergida durante todo el procedimiento. Mientras sostiene la base de la probóscide, aleje suavemente la cabeza de la mosca del cuerpo para separar las dos. El cerebro se encuentra en la parte posterior, o lado caudal, de la cabeza de la mosca. Por lo tanto, sujétese de las partes frontales o rostrales de la cutícula durante la disección para evitar dañar el órgano.

Para aislar el cerebro, sostenga el borde medial de un ojo y agarre y tire de la probóscide en la dirección opuesta para crear una abertura en la cápsula de la cabeza. Mientras sostienes la cutícula en ese ojo, agarra el borde medial de la cutícula desde el otro ojo y separa lentamente la cápsula de la cabeza para revelar el cerebro. Si es necesario, continúe limpiando la cutícula residual, los sacos de aire adjuntos o la tráquea. Las preparaciones de alta calidad preservarán estructuras como los lóbulos ópticos, el cerebro central y el SOG. En el protocolo de ejemplo, veremos una demostración detallada de una disección de cerebro adulto de Drosophila utilizada para estudiar los cuerpos de los hongos.

- Para preparar la disección, coloque las moscas anestesiadas de interés en una almohadilla de metal fría o en una placa de Petri colocada sobre hielo. Alternativamente, use una almohadilla para moscas que emita dióxido de carbono. A continuación, coloque una pequeña cantidad de PTN en el centro de la placa de disección para crear una burbuja de PTN. Luego, bajo un microscopio estereoscópico, llene el campo de visión con la burbuja PTN bajo iluminación uniforme. Ahora, manipule las moscas para que estén boca arriba y transfiera una por el abdomen al PTN. Sumergir completamente al animal en el PTN y realizar toda la disección sumergido en el PTN. Con un segundo par de pinzas, agarre la probóscide y retire la cabeza del cuerpo.

- Ocasionalmente, se retirará la probóscide pero la cabeza permanecerá unida al cuerpo. Si esto ocurre, agarre el borde medial de una retina y aplique fuerza lateral para quitar la cabeza.

- Deseche el abdomen y el tórax. Es fundamental mantener la cabeza en el PTN durante este paso. Claramente, las conexiones desde el cerebro central hasta la VNC no se pueden analizar con este método. A continuación, agarre el borde medial de la retina izquierda en el borde del orificio central de la cutícula y separe lentamente las pinzas directamente entre sí para evitar el desgarro del lóbulo óptico, que es la estructura opaca cubierta por una tráquea blanca y fibrosa. A medida que la retina se disocia, habrá una ligera disminución de la tensión.

- Para evitar que el cerebro se desgarre, es de vital importancia agarrar el borde medial de cada ojo y separar muy lentamente las pinzas. Moverse demasiado rápido puede provocar una alteración de la morfología cerebral o daños en el tejido cerebral.

- Como se muestra aquí, agarre la cutícula con cada par de pinzas y tire de ellas muy lentamente en direcciones opuestas. Si se hace correctamente, la cutícula debe separarse del tejido cerebral, dejando el cerebro intacto. Se necesitan pinzas muy afiladas para este paso. A continuación, retire con cuidado la cutícula circundante pieza por pieza. Al eliminar la cutícula obstinadamente adherida, puede ayudar a asegurar el cerebro agarrando el VNC restante para evitar aplastar el cerebro. Por último, utilice una pipeta P200 para transferir los cerebros disecados a un pocillo de una placa llena de PTN para su fijación e inmunotinción.