Cultura de órganos y todo el montaje Inmunofluorescencia La tinción de mouse de Wolff Conductos

El objetivo general de este cultivo de órganos y método de inmunofluorescencia de montaje completo es visualizar y comprender mejor el proceso de enrollamiento y desarrollo de la inducción de Wolff. Este método ayudará a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo sobre los mecanismos involucrados en el desarrollo de la forma, estructura y función de los órganos. Las principales ventajas de esta técnica son que imita los sistemas in vivo y proporciona información más precisa que los estudios de cultivos celulares que carecen de factores de nicho.

Antes del mediodía del día 15 después de la concepción, coloque una rata embarazada en posición supina sobre papel de seda absorbente y rocíe el lado ventral del abdomen con etanol al 70%. Con fórceps, levante la piel inferior del abdomen en el lado ventral del animal y use unas tijeras quirúrgicas para hacer una incisión lateral que se extienda desde la abertura urogenital hasta la caja torácica. Agarre la vejiga urinaria con las pinzas justo por encima del cuello uterino y haga una incisión en el útero.

Sosteniendo la vejiga urinaria, haga una incisión en el ligamento ancho uterino y la unión tubárica del útero para separar el útero de la unión paratenigal. Coloque el útero en un tubo de 50 mililitros que contenga HBSS helado y agite suavemente el tejido para eliminar el exceso de sangre. Transfiera el útero enjuagado a una placa de Petri que contenga HBSS fresco y helado sobre hielo, y corte la pared uterina para extraer los embriones, colocándolos en una nueva placa de Petri con HBSS fresco en hielo a medida que se cosechan.

Coloque un embrión en su lado lateral sobre un pedazo de papel de seda estéril empapado en etanol en un plato nuevo. Y use una cuchilla estéril para hacer una incisión diagonal en la parte inferior del abdomen del animal. Sujete el embrión con alfileres en una base de esponja estéril a lo largo de la columna vertebral y mueva el embrión bajo un microscopio estereoscópico de disección.

Corta con cuidado a lo largo de la línea media ventral y retira el hígado y los intestinos. El sistema urogenital ahora debería ser visible. Hacer una incisión en el conducto deferente, cerrarlo en su unión uretral.

Seguido de una incisión en la unión de la parte inferior del conducto de Wolff al gubernáculo para extraer los testículos y los conductos de Wolffi. Colocar los pañuelos en una nueva placa de Petri con HBSS fresco en hielo a medida que se recolectan. Para cultivar las crestas gonadales embrionarias, primero agregue 300 microlitros de medio por pocillo a una placa de cultivo celular de 24 pocillos.

A continuación, agregue una pequeña gota de HBSS estéril en una nueva placa de Petri y coloque una membrana de grabado de pista de policarbonato de 0,8 micrómetros sobre la gota con la superficie brillante hacia el HBSS. Coloque siempre la membrana en la parte superior de la gota de HBSS para mantener el tejido hidratado con el lado rugoso de la membrana hacia arriba. Con pinzas limpias, coloque dos crestas genitales en el lado rugoso de la membrana sin que los tejidos se toquen entre sí.

Y use una toallita estéril para eliminar el exceso de HBSS. Mientras transfiere las crestas genitales a la membrana, recoja la muestra entre los dos brazos de las pinzas, teniendo cuidado de eliminar cualquier exceso de HBSS de la membrana después de la transferencia para evitar el crecimiento quístico de los conductos de Wolff. A continuación, coloque la membrana en un pocillo de la placa de 24 pocillos para cultivar los tejidos de la interfaz del medio del oído a 37 grados centígrados y al 5% de dióxido de carbono, con un cambio total del medio cada día durante tres días.

Para el cuarto día de cultivo, los conductos wolffianos desenrollados se habrán transformado en tubos muy enrevesados. Para fijar los tejidos para la inmunofluorescencia de montaje completo, transfiera las membranas con las gónadas cultivadas y los conductos de Wolff a nuevas placas de Petri que contengan PBS helado. Las membranas flotarán en el PBS.

Utilice la punta de las pinzas para hundir las membranas. Y transfiera los tejidos gonadales cultivados a un 4% de paraformaldehído. Después de la fijación, enjuague las muestras con tres lavados de 10 minutos en PBS más Triton X con un balanceo suave a temperatura ambiente.

A continuación, deshidratar los tejidos en una serie de etanol graduado durante 10 minutos por cada inmersión a cuatro grados centígrados y 30 rotaciones por minuto. Para cambiar las muestras entre inmersiones, deje que los tejidos se asienten durante los últimos dos minutos de la deshidratación. A continuación, retire la mayor cantidad de alcohol posible sin tocar los tejidos, y añada la siguiente concentración más alta de etanol.

Después de la última deshidratación, rehidrate los tejidos en una serie de etanol de grado inverso como se acaba de demostrar. A continuación, lave los pañuelos en PBS más Triton X cuatro veces durante 20 minutos a temperatura ambiente. Y 30 rotaciones por minuto para cada lavado.

Bloquee los tejidos durante una hora a temperatura ambiente con tampón secante, seguido de una incubación nocturna a cuatro grados centígrados y 30 rotaciones por minuto en el anticuerpo primario de interés. Al día siguiente, lave los pañuelos cuatro veces en PBS más leche en polvo descremada en preadolescentes durante 30 minutos a temperatura ambiente, y 30 rotaciones por minuto para cada lavado. Después del último lavado, etiquetar los tejidos con el anticuerpo secundario adecuado durante una hora a temperatura ambiente, con balanceo lento y protegidos de la luz.

A continuación, lave los pañuelos tres veces solo en PBS plus tween. Y analizar las muestras por microscopía de inmunofluorescente. Durante el desarrollo, el conducto Wolffian experimenta cambios significativos, en los que un tubo simple y recto se transforma en un conducto altamente complejo y en espiral.

Para diseccionar los mecanismos moleculares implicados en la morfogénesis del conducto wolffiano, el medio de cultivo puede complementarse con inhibidores y activadores que se dirigen a diferentes vías de señalización. Por ejemplo, este conducto de Wolff permaneció desenrollado después de tres días de cultivo en presencia de un inhibidor específico de uno a señalización. Una vía aparentemente involucrada en el enrollamiento.

La inmunotinción de montaje completo de los conductos de Wolff revela la expresión de citoqueratina-8 y la presencia de células proliferantes PH3 positivas y tejidos de cultivo de tres días, así como la expresión de beta catenina en tejidos de montaje entero recién aislados después de la concepción después de la concepción. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en unos cinco a 10 minutos por embrión si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden probar agentes farmacológicos u hormonas en los órganos de cultivo para responder preguntas adicionales sobre el efecto directo de estos agentes en tejidos gonadales específicos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe agarrar las crestas genitales directamente con las pinzas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo exploraran los mecanismos involucrados en el desarrollo de anomalías y anomalías congénitas del sistema reproductivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar crestas gentiles y realizar inmunofluorescencia de montaje completo.

No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se debe usar equipo de protección personal mientras se manipula este material.