Name: Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprende a visualizar células multiciliadas en Danio rerio mediante hibridación in situ e inmunofluorescencia simultánea. Este protocolo permite estudiar la organogénesis renal y la biología del desarrollo en embriones de pez cebra.

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Este trabajo fue apoyado en parte por la beca R01DK100237 R.A.W. y el nacional ciencia Fundación postgrado investigación beca no. DGE-1313583 a A.N.M. También agradecemos a la Universidad de ciencia verano pregrado investigación programa de becas para apoyo a M.U. Nos gustaría agradecer el centro para la investigación de pez cebra en la Universidad de Notre Dame para su cuidado dedicado de nuestro pez cebra. También nos gustaría dar las gracias al Departamento de ciencias biológicas así como los miembros de nuestro laboratorio por todo su apoyo y valiosa información.

El siguiente protocolo utiliza pez cebra adultos mantenidos y atendidos por el centro para la investigación del pez cebra en la Universidad de Notre Dame. Todos los métodos para trabajar con embriones y pez cebra adultos fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso.
1. embrión fijación
<ol><li>Recolectar embriones de pez cebra con métodos previamente descritos39,40. A las 24 hpf, Añadir 500 μl de solución de mezcla de proteasas no específicas (50 mg/mL) para el E3 en un embrión de plato incubar a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Una vez que los embriones comienzan rompiendo hacia fuera del corión, quitar todo el líquido del plato embrión.</li>
	<li>Lavar los embriones 2 - 3 veces con E3 fresco, añadir aproximadamente 20 mL de E3, girando suavemente el E3 en el plato y luego decantar el líquido en un recipiente de desechos líquido.</li>
	<li>Para eutanasia a los embriones antes de fijar, añadir 2 mL de metanosulfonato de 0.2% para el E3.</li>
	<li>Transferencia de los embriones en un frasco de vidrio de 5 mL con una pipeta Pasteur de plástico. Eliminar la mayor parte de la solución de Metanosulfonato/E3 utilizando la pipeta después de que los embriones se han asentado en el fondo del frasco.</li>
	<li>Solución 24 embriones de hpf con 5 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) para 2-4 h a temperatura ambiente, sin agitación. PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico y soluciones PFA deben manejarse bajo una campana química mientras el investigador está usando protección para los ojos, guantes y una bata de laboratorio. Preparación del fijador de PFA del polvo granulado de PFA debe realizarse con cuidado excepcional, como la PFA granulado tiende a dispersarse a través de la carga estática. Nota: Los embriones se pueden fijar en 4% PFA durante la noche a 4 ° C. Preparar 4% PFA calentando 1 x de tampón fosfato salino (PBS) a ebullición agitando constantemente la solución para disolver completamente la PFA granulado. Una vez que la solución se ha enfriado a RT, el 4% del PFA es filtro esterilizado pasando a través de un sistema desechable de 0.45 μm para la filtración de vacío, entonces y alícuotas en porciones de 15 mL o 50 mL para el almacenamiento a-20 ° C.</li>
	<li>Quitar los 4% PFA y embriones de lavado dos veces con tampón de fosfato X 1 salina con 0,1% Tween-20 (SAFT) a TA. lavar los embriones una vez con 5 mL de metanol (MeOH) de 100% en RT. Añadir 5 mL de dulce 100% MeOH a los embriones e incubar a-20 ° C durante al menos 20 minutos. Nota: Los embriones se pueden almacenar en un 100% MeOH a-20 ° C hasta que esté listo para la preparación del embrión.</li>
</ol>2. hibridación y la preparación de embriones
<ol><li>Rehidratar los embriones por lavado una vez en 5 mL de 50% MeOH 1 x PBST 5 min a TA. continuar rehidratación por lavar los embriones en 5 mL de 30% MeOH en 1 x PBST por 5 min a TA. Lave los embriones en 5 mL de 1 x PBST dos veces por 5 min a RT.</li>
	<li>Permeabilizar los embriones por incubación en 5 mL de una solución de proteinasa K de 1:1,000 (pK) (10 mg/mL) en 1 x PBST por 2 min a TA. Nota: Embriones mayores pueden incubarse más de 2 minutos en la concentración de pK arriba indicada, sin embargo una concentración de 5 mg/mL e incubación tiempo de menos de 2 min se sugiere para embriones menores de 24 hpf.</li>
	<li>Quitar pK la solución y lavar inmediatamente en 5 mL de 1 x SAFT dos veces en RT. fijar los embriones en 5 mL de 4% PFA a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos. Nota: Los embriones se pueden fijar en 4% PFA durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Quitar PFA y lavado dos veces en 5 mL de 1 x PBST a TA.</li>
	<li>Transferencia de embriones en 5 mL de 1 x PBST en tubos de microcentrífuga de fondo plano posición vertical en un rack de microcentrífuga a temperatura ambiente para facilitar las interacciones entre cada embrión y la solución de hibridación posterior.</li>
	<li>Lavar los embriones dos veces en 1,5 mL de solución de hibridación (Hyb +) RT. Añadir 1.5 ml de Hyb fresco + e incubar embriones a 70 ° C en un horno de hibridación durante 4-6 h.</li>
	<li>Reemplazar los 1,5 mL de Hyb + con un volumen de solución de la sonda (10 μl RNA sonda/500 μl Hyb +) suficiente para cubrir completamente los embriones. Nota: Síntesis antisentido sonda RNA usando anteriormente descrito métodos39.</li>
	<li>Hibridar la sonda durante la noche en el horno de hibridación a 70 ° C con el vertical de tubos individuales colocados en el estante de microcentrífuga, sin agitar.</li>
</ol>3. caliente lavados y bloqueo
Nota: Se realizaron lavados caliente poniendo la solución adecuada en los embriones y luego incubar en el horno de hibridación a 70 ° C. Para mantener las soluciones de lavado a 70 º C, coloque tubos de 50 mL de cada solución en el horno de hibridación cuando la sonda / Hyb + mezcla es añadido.
<ol><li>Extraiga la sonda. Lavar los embriones dos veces a 70 ° C en 1,5 mL de formamida 50% / 2 x buffer citrato salino-sódico (SSC) para 20-30 minutos cada uno. Nota: La sonda se puede almacenar en Hyb + a-20 ° C y volver a utilizarse en una fecha posterior.</li>
	<li>Lavar los embriones una vez a 70 ° C en 1,5 mL de 2 x SSC por 15 minutos lavar los embriones dos veces a 70 ° C en 1,5 mL de 0,2 X SSC de 20-30 minutos cada uno. X SSC reemplazar 0.2 con 1,5 mL de reactivo de bloqueo e incubar durante la noche a 4 ° C. Nota: Es posible incubar bloqueo reactivo a temperatura ambiente durante 4 horas en lugar de la noche a la mañana.</li>
</ol>4. anticuerpo incubación y lavados de ácido Maleic amortiguamiento
Nota: Mantener embriones protegidos de la luz ambiental.
<ol><li>Reemplazar el bloqueo reactivo con 0,2 mL de anti-DIG-POD en el bloqueo reactivo a razón de 1:1,000 e incubar durante 3 h en papel de aluminio o tapa de bloqueo de luz otra a TA. Nota: Como alternativa, el anticuerpo puede incubar durante una noche a 4 ° C.</li>
	<li>Después de 3 horas, lave los embriones en 1,5 mL de tampón ácido maleico 2 - 4 veces por 10-15 minutos cada uno en RT. incubar los embriones durante la noche a 4 ° C en 1,5 mL de tampón ácido maleico fresco. Nota: No es necesario incubar durante una noche en ácido maleic amortiguamiento, pero hacer disminuye tan fondo sonda.</li>
</ol>5. sonda de detección y eliminación de la peroxidasa
Nota: Mantener embriones protegidos de la luz ambiental.
<ol><li>Elimine el tampón de ácido maleico y reemplazar con 1,5 mL de PBS 1 x. Lavar los embriones dos veces en 1,5 mL de PBS 1 x por 5 min en RT. Incubar embriones en 0,2 mL de Cy3 fluorescente manchas solución durante 60 min a TA. Nota: El tiempo de incubación puede variar de diversas puntas de prueba.</li>
	<li>Lave los embriones una vez con 1,5 mL de lo siguiente porcentaje MeOH 1 X PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH y 100% MeOH.</li>
	<li>Incubar los embriones con 1,5 mL de 1% H2O2 en MeOH durante 30 min a RT. Wash los embriones una vez con 1,5 mL de las siguientes soluciones de MeOH en PBS 1 x durante 10 min a temperatura ambiente: 75% MeOH, 50% MeOH y 30% MeOH. Lavar los embriones dos veces por 5 minutos a temperatura ambiente en 1,5 mL de PBS 1 x. Nota: Los embriones pueden almacenarse en PBS durante la noche a 4° C.</li>
</ol>6. inmunofluorescencia
Nota: Mantener embriones protegidos de la luz ambiental.
<ol><li>Lave los embriones en 1,5 mL de ddH2O 5 minutos en RT. Wash los embriones en 1,5 mL de acetona enfriada previamente (mantenido a-20 ° C) de 7 min a TA. lavar los embriones una vez en 1,5 mL de ddH2O 5 minutos en RT. Wash los embriones una vez en 1.5 mL de 1 x PBST con DMSO 1% (PBDT) por 5 min a TA.</li>
	<li>Incubar los embriones en 1,5 mL de PBDT + 10% suero bovino fetal (FBS) en un eje de balancín a temperatura ambiente por 2 h.</li>
	<li>Quite PBDT + FBS y reemplácelo con 1,5 mL de anticuerpos primarios, tubulina acetilada anti (producido de ratón) y anti-γ-tubulina (producido de conejo), juntos diluido al 1: 400 en PBDT + 1% FBS. Incubar los embriones durante la noche a 4 ° C. Nota: Tiempos de incubación pueden variar dependiendo del anticuerpo primario. Pruebas de diferentes intervalos de tiempo pueden ser necesario para optimizar el etiquetado.</li>
</ol>7. secundaria anticuerpo
Nota: Mantener embriones protegidos de la luz ambiental.
<ol><li>Para retirar el anticuerpo no Unido exceso de los embriones, lavar en 1,5 mL de PBDT + 1% FBS + 0,1 M de NaCl durante 1 min a temperatura ambiente en un eje de balancín.</li>
	<li>Lavar los embriones 5 veces en 1,5 mL de PBDT + 1% FBS + 0,1 M de NaCl por 30 min en un eje de balancín en RT. Lave los embriones en 1,5 mL de PBDT + 1% FBS por 30 min a temperatura ambiente en un eje de balancín.</li>
	<li>Incubar los embriones durante la noche a 4 ° C en 200 μL de los anticuerpos secundarios, Alexa 488 cabra anti-ratón IgG y Alexa 647 cabra anti-IgG de conejo, diluido juntos en PBDT al 1: 500.</li>
</ol>8. tinción DAPI
Nota: Mantener embriones protegidos de la luz ambiental.
<ol><li>Lavar los embriones rápidamente a temperatura ambiente en 1,5 mL de PBDT dos veces. Reemplazar PBDT con 1,5 mL de DAPI, diluido 1:15000 en 1 X Saft e Incubar 15 min a temperatura ambiente en un eje de balancín.</li>
	<li>Lave los embriones en 1,5 mL de PDBT + 1% FBS + 0.1 M NaCl tres veces a TA durante 15-20 min cada uno. Almacenar embriones en 1,5 mL de PBDT a 4 ° C hasta que esté listo de montar y de imagen.</li>
</ol>9. montaje y proyección de imagen de pez cebra Pronefros
<ol><li>Endecha del embrión lateral sobre portaobjetos de cristal en un pequeño volumen, aproximadamente 10 μl, de PBDT.</li>
	<li>Apriete el embrión detrás de los ojos con un par de Pinzas finas para quitar la cabeza y algunos de la bola de yema de huevo.</li>
	<li>Utilizar la pinza fina para raspar suavemente la bola de yema de huevo restante del cuerpo del embrión. Quitar la yema disociado y el líquido extra de la diapositiva con un pañuelo fino.</li>
	<li>Añadir una gota de montaje de los medios de comunicación a la cola restante del embrión y coloque de manera que la cola se coloca lateralmente. Coloque un cubreobjetos encima de la cola para aplanar la muestra, luego coloque en una caja de tobogán.</li>
	<li>Cilios renales con 60 aumentos en un microscopio confocal utilizando los siguientes canales de imagen: DAPI en azul (láser ajustado a 408.0 nm), FITC en verde (laser set en 488.0 nm), Cy3 teñir-etiquetados en rojo (laser set en 561.0 nm) y Alexa 680 en blanco (láser conjunto en 637.0 nm).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo detallado arriba está optimizado para el etiquetado de MCC en el Pronefros con transcripciones de odf3b y α-tubulina en embriones de pez cebra de 24 hpf. Para obtener los mejores resultados se recomienda utilizar embriones recién arreglados y preparados. Embriones que han sido fijados y almacenados en MeOH o Hyb + a-20 ° C por más de una semana se pueden utilizar, pero la probabilidad de fondo no deseados manchas aumenta con el tiempo que los embriones se mantienen en el almacenamiento.
Modificaciones y la resolución de problemas de esta técnica están necesarios adaptar este método para otras suites de marcadores particulares, por ejemplo otros riboprobes antisentido y otros anticuerpos. Muchos métodos para ajustar los parámetros de pasos en el proceso de montaje todo en situ hibridación han sido documentado previamente por nuestro grupo y otros31,34,36,38, 39. Asimismo, cada anticuerpo proteína requerirá algunos problemas en cuanto a tiempos de tinción y rangos aproximados de diluciones y tiempos de incubación para cada anticuerpo primario se estiman mejor mediante la evaluación de resultados documentados28, 35. embriones menores de 24 hpf, tratamiento pK debe ser menor que 2 min, donde embriones mayores de 24 hpf debe tratarse con pK por mas de 2 minutos. También, los embriones mayores de 24 hpf debe ser blanqueada de pigmento antes del tratamiento de pK.
Después de la tinción con la solución de tinción fluorescente, es fundamental para quitar cualquier mancha, anticuerpo y peroxidasas restantes mediante la realización de la serie de lavados de metanol y agua oxigenada. Los lavados de PBS inmediatamente después son vitales para eliminar el metanol sobrante de los embriones. Lo importante, antes de proceder con los anticuerpos IF, hemos encontrado que la acetona y agua desionizada lavados hacen los embriones menos propensos a adherirse a uno con el otro o los tubos de la centrífuga. En nuestra experiencia, anticuerpos para factores de transcripción específicos y otros genes, aunque puede trabajar eficientemente Western blots, no funcionan bien pues si en el pez cebra. Sin embargo, altamente conservadas y abundantes proteínas, como la α-tubulina y β-catenina, funcionan bien en el pez cebra para IF16,37.
Con peces, es posible visualizar las transcripciones del RNA de los genes que aún no tienen anticuerpos específicos en el pez cebra. Mediante la combinación de pescado con IF, según lo demostrado por este protocolo, co-localización de las transcripciones del RNA y la proteína puede ser visto en vivo (figura 2). La naturaleza flexible del protocolo permite la rápida solución de problemas para la visualización de distintos transcritos de RNA y proteínas en numerosos tejidos y puntos del tiempo. Cuando se combina con los rasgos ya respetados de embriones de pez cebra, este protocolo de pescado + si proporciona otra herramienta para explorar la expresión de genes y proteínas importantes a la regulación de la vía del desarrollo.

En las últimas décadas, el pez cebra (Danio rerio) ha surgido como un organismo modelo principal para el estudio de la biología del desarrollo. Los embriones desarrollan fuera de la madre y son ópticamente transparentes. Además, la formación de órganos vitales como el ojo, el riñón y el cerebro anterior se produce rápidamente, con estructuras formadas por sólo 24 h post fertilización (hpf). Lo importante, el genoma del pez cebra se conserva altamente con mamíferos1,2,3. Además, pez cebra y órganos mamíferos tienen similar fisiología y anatomía. El riñón embrionario del pez cebra, o Pronefros, demuestra el valor del sistema modelo de examen de funciones de los genes durante nephrogenesis precoz y determinación del destino de las poblaciones de la célula epitelial conservado de la nefrona vertebrados4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. del mismo modo, el embrión del pez cebra se ha vuelto cada vez más importante en el examen de la ontogenia de MCC11,12,13,14,15, 16 , 17.
Como su nombre lo indica, MCC es las células epiteliales se caracterizan por un haz de cilios móviles ubicados en la superficie apical17. En el pez cebra, MCC funciona en flujo de fluidos y se dispersa en un "canosos" como la moda a lo largo de la mitad de cada Nefrona de los Pronefros 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. aunque sólo se han observado en un puñado de riñón humano enfermedad casos18,19,20,21, MCC es frecuente en otros tejidos mamíferos tales como el cerebro y tráquea22,23,24, que plantea una serie de retos para el diseño experimental. Estudios elegante en varios modelos vertebrados incluyendo peces cebra han demostrado un camino conservado del destino MCC, con la muesca que se vía de señalización como un inhibidor de la MCC desarrollo12,17,25 ,26,27. Por lo tanto, el Pronefros de pez cebra proporciona un modelo de fácil acceso para estudiar los mecanismos genéticos de MCC desarrollo en vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Transparencia y fácil manipulación genética de embriones de pez cebra han demostrado para ser inestimable rasgos al estudiar las vías genéticas y moleculares que regulan el destino celular, crecimiento y desarrollo del temprano embrión1,2 ,3. Como tales, las técnicas tradicionales a visualizar transcripciones proteína y gen, como hibridación en situ y en caso de montar todo, han sido aplicados a y optimizado para el pez cebra16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Mediante la combinación de protocolos populares de pescado y si, es posible etiquetar y analizar MCC en vivo16,28,37,38.

<table><tbody><tr><td>solución de mezcla de proteasas no específica</td><td>Roche 11459643001</td><td>, pronasa de Streptomyces griseus</td><td>Diluir en E3 <fuerte>sin</fuerte> azul de metileno para hacer una solución madre de 50 mg/mL; almacenar a -20 grados; C</td></tr><tr><td>E3 solución</td><td></td><td></td><td>Diluir 50X E3 (250 mM de NaCl, 8,5 mM de KCl, 16,5 mM de CaCl2, 16,5 mM de MgSO4 en agua destilada) en agua destilada; añadir 1 x 10-5 M de azul de metileno (sigma M9140) para inhibir la contaminación</td></tr><tr><td>tricaína (3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato)</td><td>Fluka</td><td>A5040-250G</td><td>Para hacer una solución madre al 0,2%, disuelva 1 g de polvo de tricaína en 10 mL de Tris, pH 9,5 y agua destilada hasta 500 mL</td></tr><tr><td>Placas de embriones</td><td>VWR</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>viales de vidrio de 5 ml</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>plástico desechable Pasteur pipetas VWR</td><td></td><td>414004-004</td><td></td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído (PFA) al 4% Servicios de</td><td>microscopía electrónica</td><td>19210</td><td>Disuelva el 4% de PFA en 1X PBS y deje hervir bajo una campana extractora. Deje enfriar y alícuota, luego guárdelo a -20 ° C. No vuelva a congelar una vez descongelado para su uso.</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td>Diluir en agua destilada para hacer 1X</td></tr><tr><td>stock Tween-20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>Hacer un caldo Tween-20 al 0,1% diluyendo en agua destilada.</td></tr><tr><td>1X solución salina tamponada con fosfato con 0.1% Tween 20 (PBST)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>0.1% Tween-20 en 1X PBS</td></tr><tr><td>metanol (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>proteinasa K</td><td>Roche 3115879001</td><td></td><td>Disolver en agua destilada para hacer un caldo de 10 mg / mL; alícuota y almacenar a -20 grados; Tubos</td></tr><tr>de<td>microcentrífuga de fondo plano</td><td>C VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>formamida</td><td>American Bioanalytical</td><td></td><td>AB00600 almacene a -20 grados; </td></tr><tr><td>Solución de hibridación C (HYB+)</td><td></td><td></td><td>50% formamida, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 5 mg/mL de levadura ARN de torula, 50 &mu; g/&mu; L heparina; tienda a -20 ° C; C</td></tr> horno <tr><td>de hibridación</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10Q</td><td></td></tr><tr><td>20X solución tampón de citrato salino-sódico (SSC)</td><td>American Bioanalytical AB13156</td><td></td><td>diluir en agua destilada para hacer 2X y 0.2X</td></tr><tr><td>solución reactiva de bloqueo</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>diluir en tampón de ácido maleico para hacer una solución madre al 10%; almacenar a 4&deg; C</td></tr><tr><td>solución tampón de ácido maleico</td><td>Sigma</td><td>M0375 y S7653</td><td>150 mM de ácido maleico, 100 mM de NaCl (pH 7,5)</td></tr> <tr><td>anti-Digoxigenina-POD, Fab fragmentos Roche</td><td></td><td>11207739910</td><td>almacenar a 4&deg; C</td></tr><tr><td>Solución de tinción fluorescente Cy3</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT, tienda del sistema TSA Plus Cyanin3</td><td>a 4&deg; C; prepare la solución de tinción fresca haciendo una dilución 1:50 del reactivo TSA (disuelto en 60 uL de DMSO) en el tampón del kit</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno (H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009-500mL</td><td>almacene a 4&deg; </td></tr><tr><td>Agua destilada de grado molecular C (ddH2O)</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>acetona</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00636-01000</td><td>almacena una alícuota a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>alícuota y almacenar a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>clon de tubulina monoclonal antiacetilada 6-11B-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>alícuota y almacenamiento a -20 ° C</td></tr><tr><td>anti-&gamma;-tubulina anitbody producido en conejo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>alícuota y almacenar a -20&deg; C</td></tr><tr><td>odf3b clon de ADNc MGC:63985</td><td>OpenBiosystems</td><td>IMAGEN:6792478</td><td>almacene el stock de glicerol bacteriano a -80 grados; C</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915-05000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa harina 647 cabra anti-conejo IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td>tienda en 4&deg; C; proteger de la luz</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 cabra anti-ratón IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>tienda en 4&deg; C; proteger de la luz</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>alícuota y almacenar a -20&deg; </td></tr><tr><td>Corredera de vidrio</td> C <td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>pinza fina</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Pinzas Patrón #55</td></tr><tr><td>medios de montaje</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18606, tienda Aqua-Poly/Mount</td><td>en 4&deg; </td></tr><tr><td>Microscopio confocal C y software</td><td></td><td></td> asociado <td>Utilizamos un microscopio confocal Nikon C2plus con elementos NIS,</td></tr><tr><td>balancín</td> de software AR <td>Bio-Rad</td><td>1660710EDU</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de las células multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo monte fluorescente in situ hibridación e inmunofluorescencia

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

En los últimos años, el embrión del pez cebra se ha convertido en un modelo popular para estudiar la biología del desarrollo debido a rasgos como ex útero desarrollo del embrión y la transparencia óptica. En particular, el embrión del pez cebra se ha convertido en un organismo importante para el estudio de la organogénesis de vertebrados del riñón así como desarrollo de las células multiciliated (MCC). Para visualizar el MCC en el riñón de embrión de pez cebra, han desarrollado un protocolo combinado de montaje conjunto fluorescente en situ del hibridación (pescado) y todo Monte inmunofluorescencia (IF) que permite la proyección de imagen de alta resolución. Este manuscrito describe la técnica para localizar Co las transcripciones del RNA y la proteína como una herramienta para entender mejor la regulación de los programas de desarrollo a través de la expresión de diversos factores de linaje.

Embriones de pez cebra de tipo salvaje se fijaban en 24 hpf e inmediatamente preparado como se describió anteriormente. La figura 1 muestra un flujo de trabajo experimental junto con las etapas ilustradas. El flujo de trabajo descrito en los pasos 1-8 abarca los procesos de obtención de muestras, fijación y manipulación de los tejidos fijos etiquetar transcritos endógenos con riboprobes antisentido seguido por inmunofluorescencia a etiqueta proteínas de interés. Paso 9 en el flujo de trabajo se refiere a técnicas diseñadas específicamente para optimizar la visualización del tronco embrionario pez cebra de imagen y el montaje. En los dibujos que acompañan el paso 9, ilustramos el método de manipulación para colocar el tejido en un portaobjetos de vidrio. En este paso, el balón de cabeza y yema de embrión se retiran, dejando la cola lateralmente se coloca entre el cubreobjetos y portaobjetos de vidrio. Extracción de la bola de la yema y se sugiere para la mejor proyección de imagen de la población residente de MCC en el Pronefros, como la bola de yema auto fluorescencia y obstruye el proceso de montaje.
Obtenidos mediante un microscopio confocal de imágenes representativas se encuentran en la figura 2, que muestra el mismo embrión de tipo salvaje a 60 aumentos y un zoom digital en el mismo aumento. Los paneles superiores proporcionan imágenes de cada canal individual, mientras que los dos paneles de la parte inferior son el recubrimiento compuesto de estos datos de imágenes. La caja blanca (en la imagen de la columna de la izquierda) describe la zona que es el foco del zoom digital (la imagen de la columna de la derecha). Resaltado en el panel final del zoom digital, los núcleos fueron etiquetados en DAPI, y MCC se detectaron basado en un riboprobe antisentido diseñado para reconocer odf3b, donde γ-tubulina se une a los anticuerpos indican los cuerpos básicos y α-tubulina denota los cilios. En el zoom digital del recubrimiento compuesto, el círculo amarillo discontinuo indica el perímetro de un MCC, que fue identificado por la posesión de certificados de odf3b , múltiples cuerpos basales y cilios. La célula ciliada mono adyacente, marcada con un círculo punteado amarillo, identificó basado en el fenotipo de poseer un solo cuerpo basal y un cilio único.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> Figura 1: esquema de diagrama de flujo experimental. Este diagrama muestra un flujo de trabajo experimental, acompañado por las ilustraciones de las etapas críticas en que el copo de nieve indica frío incubación, las tres líneas curvas representan el calor y el reloj representa tiempos de incubación prolongados. El flujo de trabajo puede realizarse en un mínimo de 6 días (véase número de día en la esquina superior derecha de cada etapa del proceso), aunque algunos pasos se pueden realizar sobre períodos más largos, como se señala en el protocolo. Una descripción detallada del proceso de montaje se dibuja hacia fuera, mostrando la cola final embrión montado entre el vidrio portaobjetos y cubreobjetos. Una caja negra punteada indica la zona que es reflejada en un aumento de 60 X. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> Figura 2: resultados de representante para la visualización de MCCs del pez cebra Pronefros. Proyecciones de imagen máxima de un embrión de pez cebra tipo hpf 24 a 60 X aumentos y un zoom digital en el confocal con 60 aumentos del embrión mismo. Las cajas blancas indican el área enfocado para el zoom. Manchas individuales de DAPI (núcleos), odf3b (MCC), γ-tubulina (cuerpos basales) y α-tubulina (cilios) son etiquetadas y luego fusionarse en los paneles de la parte inferior dos. En el zoom digital, brindamos aproximaciones de los lugares de la célula como sigue: un MCC está delineado por el círculo amarillo punteado, y el círculo punteado amarillo describe una célula ciliada de mono. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

El objetivo general de este protocolo es etiquetar y visualizar in situ las células multiciliadas del pez cebra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como por ejemplo, ¿qué factores regulan los sulfatos multiciliados en el riñón embrionario del pez cebra? La principal ventaja de esta técnica es que tanto las proteínas como los transcritos de ARN pueden etiquetarse simultáneamente, lo cual es útil en ausencia de anticuerpos específicos para el pez cebra.Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando fuimos a marcar células multiciliadas en el pronefros mientras analizábamos la presencia de cilios tras realizar cambios en el embrión. Comience fijando los embriones de pez cebra a las 24 horas post-fecundación en cinco mililitros de paraformaldehído al 4% durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente sin agitación. A continuación, lave los embriones dos veces en PBS con Tween 20 al 0,1% o PBST, seguido de un lavado con cinco mililitros de metanol al 100%.A continuación, incubar los embriones en cinco mililitros de etanol fresco al 100 % durante al menos 20 minutos a menos 20 grados Celsius. Para preparar los embriones para la hibridación, rehidratar los neonatos en cinco mililitros de metanol al 50 % y PBST durante cinco minutos, seguido de cinco minutos en cinco mililitros de metanol al 30 % y PBST. Lavar los embriones dos veces durante cinco minutos cada vez en cinco mililitros de PBST e incubar los embriones en cinco mililitros de una solución de proteinasa K y PBST en una proporción de uno a 1.000 durante dos minutos, seguido inmediatamente por dos lavados más en cinco mililitros de PBST.Fije los embriones en cinco mililitros de paraformaldehído al 4 % durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en cinco mililitros de PBST 20. Para facilitar las interacciones entre los embriones y la solución de hibridación, transfiera los embriones a cinco mililitros de PBST en tubos microcónicos de fondo plano colocados en posición vertical en una gradilla para microcentrífuga, y lave los embriones dos veces durante cinco minutos cada vez en 1,5 mililitros de solución de hibridación. Después del segundo lavado, incube los embriones en 1,5 mililitros de solución de hibridación fresca a 70 grados Celsius en un horno de hibridación durante cuatro a seis horas.A continuación, sustituya la solución de hibridación por 10 microlitros de la sonda de ARN de interés y 500 microlitros de solución de hibridación para una hibridación de sonda durante la noche a 70 grados Celsius. A la mañana siguiente, lave los embriones dos veces en 1,5 mililitros de formamida al 50 % y tampón 2X de citrato de sodio-salino o SSC durante 20 a 30 minutos por lavado a 70 grados Celsius. Luego, lave los embriones una vez en 1,5 mililitro de 2X SSC solo a 70 grados Celsius durante 15 minutos, seguido de dos lavados en 1,5 mililitros de 0,2X SSC a 70 grados Celsius durante 20 a 30 minutos por lavado.Después del segundo lavado, sustituya el SSC 0,2X por 1,5 mililitros de reactivo bloqueante para una incubación nocturna a cuatro grados Celsius. A la mañana siguiente, sustituya el reactivo bloqueante por 0,2 mililitros de anticuerpo anti-digoxina conjugado con peroxidasa de rábano picante en reactivo bloqueante en una proporción de uno a 1.000 para una incubación de tres horas a temperatura ambiente protegido de la luz. Luego, lave los embriones de dos a cuatro veces en 1,5 mililitros de tampón de ácido málico durante 10 a 15 minutos por cada lavado, seguido de una incubación nocturna a cuatro grados Celsius en 1,5 mililitros de tampón de ácido málico fresco.A la mañana siguiente, sustituya el tampón de ácido málico con 1,5 mililitros de PBS y lave los embriones dos veces con 1,5 mililitros de PBS durante cinco minutos por lavado. Incube los embriones en 0,2 mililitros de solución fluorescente Si3 durante 60 minutos, seguido de cuatro lavados consecutivos de 10 minutos cada uno con 1,5 mililitros de concentraciones crecientes de metanol. Después de la última incubación, incube los embriones a temperatura ambiente en 1,5 mililitros de peróxido de hidrógeno al 1% en metanol durante 30 minutos.A continuación, lave los embriones durante 10 minutos por lavado en soluciones descendentes de metanol de 1,5 mililitros, seguido de dos lavados de cinco minutos en 1,5 mililitros de PBS. A continuación, lave los embriones en 1,5 mililitros de agua doblemente destilada durante cinco minutos, seguido de un lavado de siete minutos en 1,5 mililitros de acetona a menos 20 grados Celsius. Lave los embriones en otros 1,5 mililitros de agua doblemente destilada durante cinco minutos, seguido de un lavado de cinco minutos en 1,5 mililitros de PBST con 1 % DMSO o PBDT.Incube los embriones a temperatura ambiente en 1,5 mililitros de PBDT con 10 % de FBS sobre un agitador durante dos horas. Luego, sustituya el PBDT y el FBS por 1,5 mililitros de los anticuerpos primarios para una incubación nocturna a cuatro grados Celsius. A la mañana siguiente, lave los embriones en 1,5 mililitros de PBDT, FBS y cloruro de sodio 0,1 molar durante un minuto con agitación, seguido de cinco lavados de 30 minutos con agitación en 1,5 mililitros de PBDT, FBS y cloruro de sodio.Después del último lavado, lave los embriones una vez con 1,5 mililitros de PBDT y FBS durante 30 minutos con agitación, seguido de una incubación nocturna en 200 microlitros de los anticuerpos secundarios apropiados a cuatro grados Celsius, protegidos de la luz. A la mañana siguiente, lave rápidamente los embriones dos veces con 1,5 mililitros de PBDT, seguido de una incubación de 15 minutos en 1,5 mililitros de DAPI en un agitador. Luego, lave los embriones tres veces con 1,5 mililitros de PBDT con FBS y cloruro de sodio durante 15 a 20 minutos por cada lavado, y almacene los embriones en 1,5 mililitros de PBDT a cuatro grados Celsius, protegidos de la luz ambiental.Para obtener imágenes de los riñones de pez cebra, coloque los embriones en posición lateral sobre portaobjetos de vidrio en aproximadamente 10 microlitros de PBDT. Utilizando un par de pinzas finas y un microscopio estereoscópico, presione suavemente detrás de los ojos del primer embrión para retirar la cabeza y parte del vitelo. Luego, raspe suavemente el vitelo restante del cuerpo del embrión.Al retirar la bola de yema, tenga cuidado de no tocar la extensión del saco vitelino, ya que el tejido de interés se rompe fácilmente y se encuentra directamente por encima de la extensión. Utilice un tejido delgado para eliminar la yema disociada y el líquido adicional del portaobjetos. A continuación, agregue una gota de medio de montaje a la cola restante y coloque la cola en posición lateral.Aplaste la cola con una laminilla y coloque el portaobjetos en una caja para portaobjetos cubierta. Luego, utilice el objetivo de 60X en un microscopio confocal para obtener imágenes de los cilios del riñón en los canales fluorescentes adecuados. En las siguientes imágenes representativas de un embrión de pez cebra teñido como se acaba de demostrar, las células multiciliadas pueden identificarse en función de la visualización de la sonda de riboproba antisentido utilizada para reconocer la expresión del transcrito ODF3B, los cuerpos basales marcados con tubulina gamética y los cilios marcados con alfa tubulina acetilada.De hecho, con esta ampliación del pronefros embrionario, puede observarse una célula multiciliada con transcritos de ODF3B, múltiples cuerpos basales y cilios. La célula monociliada adyacente puede distinguirse por su fenotipo de un solo cuerpo basal y un solo cilio. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar embriones fijados recientemente y mantener las muestras protegidas de la luz ambiental después de haber agregado el primer anticuerpo.

visualizing-multiciliated-cells-zebrafish-through-combined-protocol

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Todo el montaje hibridación in situ es una de las técnicas más utilizadas en la biología del desarrollo. Aquí se presenta una alta resolución de doble fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para analizar el patrón de expresión precisa de un solo gen y para determinar la superposición de los dominios de expresión de dos genes. Se incluye un yoduro de propidio nuclear tinción de contraste para destacar la organización del tejido.

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

La clave para entender los procesos morfogenéticos que forma el embrión temprano es la capacidad de las células de la imagen en alta resolución. Se describe aquí una técnica para el etiquetado de las células individuales o pequeños grupos de células en embriones de pez cebra con toda la membrana dirigidos proteína verde fluorescente.

Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra

Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

Se describen las técnicas de inmunotinción fosfo-epítopos en embriones de pez cebra enteros y luego llevar a cabo la localización de dos colores confocal de fluorescencia en las estructuras celulares tan pequeños como los cilios primarios. Las técnicas para la fijación y formación de imágenes pueden definir la ubicación y la cinética de la aparición o la activación de proteínas específicas.

Inmunotinción fosfo-epítopos en ciliadas Órganos de todo el montaje embriones de pez cebra

Este protocolo demuestra la inmunofluorescencia secuencial y la inmunohistoquímica en criosecciones de embriones de pez cebra en etapa temprana que permiten análisis precisos de la colocación en poblaciones celulares específicas.

Inmunofluorescencia secuencial e inmunohistoquímica en embriones de pez cebra crioseccionados

Aquí, presentamos un protocolo para la detección de proteínas mediadas por anticuerpos fluorescentes en preparaciones enteras de embriones y larvas de peces cebra.

Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

Este protocolo describe cómo obtener imágenes combinando hibridación in situ e inmunohistoquímica de secciones embrionarias de pez cebra. La hibridación in situ se realizó antes de la criosección, seguida de tinción de anticuerpos. Es útil detectar los patrones de expresión de dos genes en el pez cebra si hay escasez de anticuerpos.

In situ Hibridación combinada con inmunohistoquímica en embriones crioseccionados de pez cebra

Aprende a visualizar células multiciliadas en Danio rerio mediante hibridación in situ e inmunofluorescencia simultánea. Este protocolo permite estudiar la organogénesis renal y la biología del desarrollo en embriones de pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia (Video) | JoVE Journal

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

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