Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

El objetivo general de este protocolo es etiquetar y visualizar in situ las células multiciliadas del pez cebra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como ¿qué factores regulan los sulfatos multiciliados en el riñón embrionario de pez cebra? La principal ventaja de esta técnica es que tanto las transcripciones de proteínas como las de ARN se pueden marcar simultáneamente, lo que es útil en ausencia de anticuerpos específicos del pez cebra.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando fuimos a etiquetar células multiciliadas en el pronefros mientras analizábamos la presencia de cilios después de realizar cambios en el embrión. Comience fijando los embriones de pez cebra a las 24 horas después de la fertilización en cinco mililitros de paraformaldehído al 4% durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente sin agitación. A continuación, lavar los embriones dos veces en PBS con 0,1%Tween 20 o PBST, seguido de un lavado con cinco mililitros de metanol al 100%.

Luego, incube los embriones en cinco mililitros de etanol fresco al 100% durante al menos 20 minutos a menos 20 grados centígrados. Para preparar los embriones para la hibridación, se rehidrató a los neonatos en cinco mililitros de metanol al 50% y PBST durante cinco minutos, seguidos de cinco minutos en cinco mililitros de metanol al 30% y PBST. Lavar los embriones dos veces durante cinco minutos cada uno en cinco mililitros de PBST e incubar los embriones en cinco mililitros de una solución de 1 a 1.000 proteinasa K y PBST durante dos minutos, seguidos inmediatamente de dos lavados más en cinco mililitros de PBST.

Fijar los embriones en cinco mililitros de paraformaldehído al 4% durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en cinco mililitros de PBST 20. Para facilitar las interacciones entre los embriones y la solución de hibridación, transfiera los embriones a cinco mililitros de PBST en tubos de microcentrífuga verticales de fondo plano en un estante de microcentrífuga y lave los embriones dos veces durante cinco minutos cada una en 1,5 mililitros de solución de hibridación. Después del segundo lavado, incubar los embriones en 1,5 mililitros de solución de hibridación fresca a 70 grados centígrados en un horno de hibridación durante cuatro a seis horas.

Luego, reemplace la solución de hibridación con 10 microlitros de sonda de ARN de interés y 500 microlitros de solución de hibridación para una hibridación de sonda durante la noche a 70 grados Celsius. A la mañana siguiente, lavar los embriones dos veces con 1,5 mililitros de formamida al 50% y 2 veces tampón de solución salina-citrato de sodio o SSC durante 20 a 30 minutos por lavado a 70 grados centígrados. A continuación, lavar los embriones una vez en 1,5 mililitros de 2X SSC solo a 70 grados Celsius durante 15 minutos, seguido de dos lavados en 1,5 mililitros de 0,2X SSC a 70 grados Celsius durante 20 a 30 minutos por lavado.

Después del segundo lavado, reemplace el SSC 0.2X con 1.5 mililitros de reactivo de bloqueo para una incubación nocturna a cuatro grados Celsius. A la mañana siguiente, reemplace el reactivo de bloqueo con 0,2 mililitros de anti-digoxina en peroxidasa de rábano picante y reactivo de bloqueo en una proporción de uno a 1,000 para una incubación de tres horas a temperatura ambiente protegida de la luz. A continuación, lavar los embriones de dos a cuatro veces con 1,5 mililitros de tampón de ácido málico durante 10 a 15 minutos por lavado, seguido de una incubación nocturna a cuatro grados centígrados en 1,5 mililitros de tampón de ácido málico fresco.

A la mañana siguiente, reemplace el tampón de ácido málico con 1,5 mililitros de PBS y lave los embriones dos veces en 1,5 mililitros de PBS durante cinco minutos por lavado. Incubar los embriones en 0,2 mililitros de solución fluorescente de Si3 durante 60 minutos, seguidos de cuatro lavados consecutivos de 10 minutos en concentraciones ascendentes de metanol de 1,5 mililitros. Después de la última incubación, incubar los embriones a temperatura ambiente en 1,5 mililitros de peróxido de hidrógeno al 1% y metanol durante 30 minutos.

A continuación, lavar los embriones durante 10 minutos por lavado en soluciones descendentes de metanol de 1,5 mililitros, seguido de dos lavados de cinco minutos en 1,5 mililitros de PBS. A continuación, lavar los embriones en 1,5 mililitros de agua destilada doble durante cinco minutos, seguido de un lavado de siete minutos en 1,5 mililitros de acetona de menos 20 grados centígrados. Lavar los embriones en otros 1,5 mililitros de agua bidestilada durante cinco minutos, seguido de un lavado de cinco minutos en 1,5 mililitros de PBST con 1% de DMSO o PBDT.

Incubar los embriones a temperatura ambiente en 1,5 mililitros de PBDT con 10%FBS en un balancín durante dos horas. A continuación, sustituya el PBDT y el FBS por 1,5 mililitros de los anticuerpos primarios para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, lavar los embriones con 1,5 mililitros de PBDT, FBS y cloruro de sodio 0,1 molar durante un minuto con balanceo, seguido de cinco lavados de 30 minutos con 1,5 mililitros de PBDT, FBS y cloruro de sodio.

Después del último lavado, lavar los embriones una vez en 1,5 mililitros de PBDT y FBS solo durante 30 minutos con balanceo seguido de una incubación nocturna en 200 microlitros de los anticuerpos secundarios apropiados a cuatro grados centígrados protegidos de la luz. A la mañana siguiente, lavar rápidamente los embriones dos veces en 1,5 mililitros de PBDT, seguido de una incubación de 15 minutos en 1,5 mililitros de DAPI en una mecedora. A continuación, lavar los embriones tres veces en 1,5 mililitros de PBDT con FBS y cloruro de sodio durante 15 a 20 minutos por lavado y almacenar los embriones en 1,5 mililitros de PBDT a cuatro grados centígrados protegidos de la luz ambiental.

Para obtener imágenes de los riñones del pez cebra, coloque los embriones lateralmente en portaobjetos de vidrio en aproximadamente 10 microlitros de PBDT. Con un par de pinzas finas y un microscopio de disección, exprima el primer embrión detrás de los ojos para extraer la cabeza y parte de la bola de yema. Luego, raspe suavemente la bola de yema restante del cuerpo del embrión.

Al retirar la bola de yema, tenga cuidado de no tocar la extensión del saco vitelino, ya que el tejido de interés se desgarra fácilmente y se encuentra directamente encima de la extensión. Use un pañuelo delgado para eliminar la yema disociada y el exceso de líquido del portaobjetos. A continuación, añade una gota de medio de montaje a la cola restante y coloca la cola lateralmente.

Aplana la cola con un cubreobjetos y coloca la corredera en una caja de correderas cubierta. A continuación, utilice el objetivo 60X en un microscopio confocal para obtener imágenes de los cilios del riñón en los canales fluorescentes adecuados. En las siguientes imágenes representativas de un embrión de pez cebra teñido como se acaba de demostrar, se pueden identificar células multiciliadas basadas en la visualización de la ribosonda antisentido utilizada para reconocer la expresión de la transcripción de ODF3B, los cuerpos basales marcados con tubulina de gametos y los cilios marcados con alfa tubulina acetilada.

De hecho, en este aumento de la pronefros embrionaria, se puede observar una célula multiciliada con transcripciones de ODF3B, múltiples cuerpos basales y cilios. La célula monociliada adyacente se puede distinguir por su único cuerpo basal y su fenotipo de cilio único. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar embriones recién fijados y mantener los especímenes protegidos de la luz ambiental después de que se haya agregado el primer anticuerpo.