Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

El objetivo general de este protocolo es etiquetar y visualizar in situ las células multiciliadas del pez cebra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como por ejemplo, ¿qué factores regulan los sulfatos multiciliados en el riñón embrionario del pez cebra? La principal ventaja de esta técnica es que tanto las proteínas como los transcritos de ARN pueden etiquetarse simultáneamente, lo cual es útil en ausencia de anticuerpos específicos para el pez cebra.

Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando fuimos a marcar células multiciliadas en el pronefros mientras analizábamos la presencia de cilios tras realizar cambios en el embrión. Comience fijando los embriones de pez cebra a las 24 horas post-fecundación en cinco mililitros de paraformaldehído al 4% durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente sin agitación. A continuación, lave los embriones dos veces en PBS con Tween 20 al 0,1% o PBST, seguido de un lavado con cinco mililitros de metanol al 100%.

A continuación, incubar los embriones en cinco mililitros de etanol fresco al 100 % durante al menos 20 minutos a menos 20 grados Celsius. Para preparar los embriones para la hibridación, rehidratar los neonatos en cinco mililitros de metanol al 50 % y PBST durante cinco minutos, seguido de cinco minutos en cinco mililitros de metanol al 30 % y PBST. Lavar los embriones dos veces durante cinco minutos cada vez en cinco mililitros de PBST e incubar los embriones en cinco mililitros de una solución de proteinasa K y PBST en una proporción de uno a 1.000 durante dos minutos, seguido inmediatamente por dos lavados más en cinco mililitros de PBST.

Fije los embriones en cinco mililitros de paraformaldehído al 4 % durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en cinco mililitros de PBST 20. Para facilitar las interacciones entre los embriones y la solución de hibridación, transfiera los embriones a cinco mililitros de PBST en tubos microcónicos de fondo plano colocados en posición vertical en una gradilla para microcentrífuga, y lave los embriones dos veces durante cinco minutos cada vez en 1,5 mililitros de solución de hibridación. Después del segundo lavado, incube los embriones en 1,5 mililitros de solución de hibridación fresca a 70 grados Celsius en un horno de hibridación durante cuatro a seis horas.

A continuación, sustituya la solución de hibridación por 10 microlitros de la sonda de ARN de interés y 500 microlitros de solución de hibridación para una hibridación de sonda durante la noche a 70 grados Celsius. A la mañana siguiente, lave los embriones dos veces en 1,5 mililitros de formamida al 50 % y tampón 2X de citrato de sodio-salino o SSC durante 20 a 30 minutos por lavado a 70 grados Celsius. Luego, lave los embriones una vez en 1,5 mililitro de 2X SSC solo a 70 grados Celsius durante 15 minutos, seguido de dos lavados en 1,5 mililitros de 0,2X SSC a 70 grados Celsius durante 20 a 30 minutos por lavado.

Después del segundo lavado, sustituya el SSC 0,2X por 1,5 mililitros de reactivo bloqueante para una incubación nocturna a cuatro grados Celsius. A la mañana siguiente, sustituya el reactivo bloqueante por 0,2 mililitros de anticuerpo anti-digoxina conjugado con peroxidasa de rábano picante en reactivo bloqueante en una proporción de uno a 1.000 para una incubación de tres horas a temperatura ambiente protegido de la luz. Luego, lave los embriones de dos a cuatro veces en 1,5 mililitros de tampón de ácido málico durante 10 a 15 minutos por cada lavado, seguido de una incubación nocturna a cuatro grados Celsius en 1,5 mililitros de tampón de ácido málico fresco.

A la mañana siguiente, sustituya el tampón de ácido málico con 1,5 mililitros de PBS y lave los embriones dos veces con 1,5 mililitros de PBS durante cinco minutos por lavado. Incube los embriones en 0,2 mililitros de solución fluorescente Si3 durante 60 minutos, seguido de cuatro lavados consecutivos de 10 minutos cada uno con 1,5 mililitros de concentraciones crecientes de metanol. Después de la última incubación, incube los embriones a temperatura ambiente en 1,5 mililitros de peróxido de hidrógeno al 1% en metanol durante 30 minutos.

A continuación, lave los embriones durante 10 minutos por lavado en soluciones descendentes de metanol de 1,5 mililitros, seguido de dos lavados de cinco minutos en 1,5 mililitros de PBS. A continuación, lave los embriones en 1,5 mililitros de agua doblemente destilada durante cinco minutos, seguido de un lavado de siete minutos en 1,5 mililitros de acetona a menos 20 grados Celsius. Lave los embriones en otros 1,5 mililitros de agua doblemente destilada durante cinco minutos, seguido de un lavado de cinco minutos en 1,5 mililitros de PBST con 1 % DMSO o PBDT.

Incube los embriones a temperatura ambiente en 1,5 mililitros de PBDT con 10 % de FBS sobre un agitador durante dos horas. Luego, sustituya el PBDT y el FBS por 1,5 mililitros de los anticuerpos primarios para una incubación nocturna a cuatro grados Celsius. A la mañana siguiente, lave los embriones en 1,5 mililitros de PBDT, FBS y cloruro de sodio 0,1 molar durante un minuto con agitación, seguido de cinco lavados de 30 minutos con agitación en 1,5 mililitros de PBDT, FBS y cloruro de sodio.

Después del último lavado, lave los embriones una vez con 1,5 mililitros de PBDT y FBS durante 30 minutos con agitación, seguido de una incubación nocturna en 200 microlitros de los anticuerpos secundarios apropiados a cuatro grados Celsius, protegidos de la luz. A la mañana siguiente, lave rápidamente los embriones dos veces con 1,5 mililitros de PBDT, seguido de una incubación de 15 minutos en 1,5 mililitros de DAPI en un agitador. Luego, lave los embriones tres veces con 1,5 mililitros de PBDT con FBS y cloruro de sodio durante 15 a 20 minutos por cada lavado, y almacene los embriones en 1,5 mililitros de PBDT a cuatro grados Celsius, protegidos de la luz ambiental.

Para obtener imágenes de los riñones de pez cebra, coloque los embriones en posición lateral sobre portaobjetos de vidrio en aproximadamente 10 microlitros de PBDT. Utilizando un par de pinzas finas y un microscopio estereoscópico, presione suavemente detrás de los ojos del primer embrión para retirar la cabeza y parte del vitelo. Luego, raspe suavemente el vitelo restante del cuerpo del embrión.

Al retirar la bola de yema, tenga cuidado de no tocar la extensión del saco vitelino, ya que el tejido de interés se rompe fácilmente y se encuentra directamente por encima de la extensión. Utilice un tejido delgado para eliminar la yema disociada y el líquido adicional del portaobjetos. A continuación, agregue una gota de medio de montaje a la cola restante y coloque la cola en posición lateral.

Aplaste la cola con una laminilla y coloque el portaobjetos en una caja para portaobjetos cubierta. Luego, utilice el objetivo de 60X en un microscopio confocal para obtener imágenes de los cilios del riñón en los canales fluorescentes adecuados. En las siguientes imágenes representativas de un embrión de pez cebra teñido como se acaba de demostrar, las células multiciliadas pueden identificarse en función de la visualización de la sonda de riboproba antisentido utilizada para reconocer la expresión del transcrito ODF3B, los cuerpos basales marcados con tubulina gamética y los cilios marcados con alfa tubulina acetilada.

De hecho, con esta ampliación del pronefros embrionario, puede observarse una célula multiciliada con transcritos de ODF3B, múltiples cuerpos basales y cilios. La célula monociliada adyacente puede distinguirse por su fenotipo de un solo cuerpo basal y un solo cilio. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar embriones fijados recientemente y mantener las muestras protegidas de la luz ambiental después de haber agregado el primer anticuerpo.