Name: Preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a preparar muestras de nanolitros para microscopía electrónica de transmisión sin blotting en papel. Este método reduce la pérdida de muestra y permite el análisis de lisados de células individuales para proteómica visual.

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Los autores desean dar las gracias al taller de Biozentrum de la Universidad de Basilea para su apoyo, S. A. Müller para los debates críticos y para leer cuidadosamente el manuscrito, A. Fecteau-LeFebvre para asistencia técnica con EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann para la proteína de la membrana de prueba muestras (todos del C-CINA, Biozentrum, Universidad de Basilea) y A. Engel, emérito de Universidad de Basilea para sus conversaciones inspiradoras. Prueba de las muestras fueron proporcionada amablemente por P. Ringler, M. A. Mahi y T. Schwede (Biozentrum, Universidad de Basilea), p. Leiman (laboratorio de biología estructural y biofísica, EPFL) y R. Díaz-Avalos (centro de biología estructural de Nueva York, Estados Unidos). El proyecto fue apoyado por el Instituto Suizo de Nanociencia (SNI, proyecto P1401, proyecto ARGOVIA MiPIS) y el Swiss National Science Foundation (SNF, proyecto 200021_162521).

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Los autores Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg y Thomas Braun declaran el interés financiero de competencia siguiente: el concepto de cryoWriter es parte de la solicitud de patente PCT / EP2015/065398 y EP16194230.

El instrumento de 'cryoWriter' y los protocolos necesarios para preparar rejillas muestra para NS - y cryo-EM desde volúmenes de nL tamaño total de la muestra y evitar por completo el paso de borrar papel clásico se presentan. Principios de microfluidos y un sistema de Micromecánica se combinan en el cryoWriter para hacer esto posible.
Nuestra experiencia demuestra que cuando se utilizan los métodos miniaturizados presentados en este manuscrito, el espacio de parámetros para la preparación de EM de la red es mayor que para los métodos clásicos y bajo un control de usuario. Lo importante, la mayor reproducibilidad alcanzada permite preseleccionar con sistema de buffer de muestra, complementada con una proteína de prueba disponibles, para determinar los parámetros óptimos antes de realiza el experimento real. Esto mantiene el consumo de la muestra de interés para el absoluto mínimo y es muy recomendable. Pasos críticos para ambos preparación de red NS - y cryo-EM son: (i) cebado del sistema de la bomba; para sub-nanoliter volumen dispensado, el líquido del sistema (agua) debe ser desgasificada y bubble gratis. (ii) preciso control de la descarga del resplandor o plasma limpieza paso; las características de la superficie de la rejilla de la EM son cruciales para obtener resultados reproducibles. (iii) acondicionamiento de muestra; el tiempo necesario para el acondicionamiento, por ejemplo, con el NS, depende el tipo de buffer, contenido de sal y concentración (figura 3), así como en la geometría de la boquilla de la microcapillary24. (iv) las tasas de evaporación preparados NS-EM para EM cuantitativa; el efecto anillo de café puede prohibir los análisis cuantitativos de los preparados de NS-EM y debe ser suprimido por las tasas de evaporación lenta controladas por la etapa de DP.
Diferentes aspectos de los métodos de preparación de red presentadas pueden combinarse libremente permitiendo el desarrollo de protocolos versátiles para muestras específicas. Ejemplos típicos serían la eliminación de una sustancia que previene la EM de alta resolución, por ejemplo, glicerol, de un paso de acondicionamiento antes de la preparación de la red para cryo-EM; la introducción de moléculas de mediador, como ligandos, por acondicionamiento antes de las rejillas están preparadas; o el examen de unicelular lisado por NS - o cryo-EM (figura 6).
El uso de la microfluídica y cantidad de muestra mínima en los métodos presentados completamente elimina la necesidad de medidas de papel-blotting. Esto es una gran ventaja, porque borrar del papel es un tratamiento duro para proteínas, potencialmente contaminando la muestra con los iones no deseados e intrínsecamente conduce a la pérdida de muestra masiva. Por otra parte, efectos potencialmente causados por la interfaz de aire y agua de la película muestra delgada que se forma cuando se preparan muestras de cryo-EM en la forma clásica no se evitan cuando se utiliza el cryoWriter. Rejillas adecuadas para cryo-EM se pueden preparar con un menos de 0,2 s tiempo de espera entre la aplicación de la muestra y la vitrificación (datos no mostrados). Sin embargo, las proteínas viajes de unas pocas décimas de un nanómetro en unos nanosegundos por difusión, todavía hay tiempo suficiente para que puedan chocar con la interfaz aire agua de una película de espesor de la muestra 100 nm varias veces. Sin embargo, la cantidad de proteínas que se pega a la interfaz aire-agua puede reducirse significativamente estas brechas de corto plazo y podría impedir la desnaturalización de la proteína o restringido la orientación de la partícula. Otro enfoque prometedor que podría proteger las proteínas sensibles desde la interfaz aire agua es cubrir la película muestra por sustancias tensoactivas de bajo peso molecular. Estos compuestos podrían introducirse rápidamente por un paso de acondicionado en el cryoWriter antes de la preparación de la red. La alta relación superficie a volumen de sistemas microfluídicos es otra limitación de la cryoWriter, como muestra se puede potencialmente perder por adsorción no específica a la superficie microcapillary y perturbar el análisis cuantitativo por conteo de partículas. El problema es abordado de dos maneras: en primer lugar, la muestra no viaja largas distancias dentro de la microcapillary. De hecho, el volumen de muestra nanoliter sigue en la punta del capilar durante el proceso. En segundo lugar, la superficie al cociente del volumen es reducida aún más utilizando microcapilares con diámetros interiores relativamente grandes, por ejemplo, 180 μm. en tercer lugar, las superficies de los microcapilares pueden fácilmente apaciguadas si es necesario, por ejemplo, tratándolos con glicoles de etanol polylysine comercialmente disponibles (PLL-PEG).
El análisis de alta resolución de proteínas por el enfoque de la sola partícula utilizado en EM sólo requiere 100.000 a unas imágenes de millones de partículas de proteínas individuales. Esto significa que técnicas microfluídico pueden proporcionar bastante complejos para la investigación estructural. Se desarrolló un método de inmuno-precipitación miniaturizado para el aislamiento rápido de complejos de proteínas (alrededor de 1 hora) de cantidades mínimas de la célula (aprox. 40.000 células) anterior28. Este método ahora se vinculará directamente a la etapa de preparación de muestra miniaturizada de la cryoWriter. El objetivo final es desarrollar un gasoducto microfluídico integrado para proteína ultra rápido aislamiento y cryo-EM red preparación que requiere menos de dos horas en total. Además, como lo demuestra la figura 6, la pequeña cantidad y volumen de material necesario para la preparación de la muestra y el acondicionado casi sin pérdidas y procedimiento de preparación de red consigue utilizando el cryoWriter, que permiten estudiar la proteína complejos de células individuales. Juntos, el método de inmuno-precipitación miniaturizados y la cryoWriter establecer los cimientos de un nuevo método de proteómica llamado "célula visual proteómica", como recientemente hemos demostrado por experimentos de choque térmico24. Algoritmos de análisis de datos para el análisis de imágenes de la "proteómica visual" se están probando.

Hardware y software para el análisis estructural de complejos de proteínas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) ha avanzado enormemente en los últimos años. Las mejoras allanaron el camino a una «revolución de resolución»1,2 y cambiaron fundamentalmente la investigación estructural. La revolución comenzó con la llegada del cryo-Electrón microscopia (cryo-EM)3,4, permitiendo la preparación de muestras biológicas bajo cerca de condiciones fisiológicas mientras que disminuye la sensibilidad de la radiación y la prevención de evaporación de la muestra en el alto vacío del microscopio electrónico de transmisión5. En los años siguientes, el progreso tecnológico incremental aumenta gradualmente la resolución alcanzable. Entre estas innovaciones fueron el uso de armas de emisión de campo6,7y, más recientemente, mejorado los algoritmos de análisis de datos, tales como métodos de máxima verosimilitud8,9. Directo del electrón detector cámaras10,11,12,13, proyección de imagen de modo de película y acompañamiento software desarrollos14,15, 16 , 17, proporcionada el avance final necesario para lograr la resolución atómica de muestras biológicas por análisis de partículas individuales (para una revisión véase Cheng, Grigorieff, et al. 18). la importancia de cryo-EM fue recientemente reconocida por la concesión del Premio Nobel de química a tres de los pioneros.
Para imagen de una muestra biológica por TEM, el método usado para cargar la cuadrícula de la EM con la muestra (en lo sucesivo como "preparación de la red") debe asegurarse de que la capa resultante de la muestra (i) es lo suficientemente delgada (&lt; 100 nm) evitar el gran ruido por inelástica o multiplicar dispersos electrones, (ii) soporta el alto vacío del microscopio electrónico, y (iii) protege las biomoléculas de daño de la radiación. Se utilizan dos métodos principales para cumplir con estos requisitos previos: Tinción negativa(NS)19,20 procedimientos (figura 1A) absorber la muestra a una película de carbón fino, incrustar las biomoléculas en heavy metal amorfo y luego Deje que el conjunto se seque en el aire. Esto es sencillo y rápido, y las rejillas cargadas de EM (en lo sucesivo como "redes de muestra") son fáciles de almacenar y puede conservarse durante largos períodos de tiempo (generalmente años). En TEM, las preparaciones exhiben alto contraste debido al NS y toleran dosis más altas del electrón que cryo-preparaciones, pero la resolución se limita a aproximadamente 20 procedimientos Å. Cryo-EM (figura 1B) emplean carbón perforado apoya. Una capa delgada de la solución de la muestra se atraviesa a través de los agujeros y la red de la EM se sumerge en un cryogen, etano generalmente licuado, para enfriarla rápidamente por debajo de-150 ° C. El resultado es un amorfo, vitrificados, 50 a 100 nm de espesor película de la solución en los orificios de soporte. Esta película delgada, amorfa resiste el alto vacío en el microscopio electrónico y, en el caso ideal, conserva estructuras biológicas en su estado nativo. El procedimiento permite muestras biológicas ser fotografiada en alta resolución. Sin embargo, la cuadrícula muestra debe mantenerse a temperaturas por debajo-150 ° C en todo momento para evitar la desvitrificación. Puede ser reflejada con dosis de electrones relativamente alta debido a la baja temperatura, pero el contraste y la relación señal a ruido sin embargo es baja. Por lo tanto, técnicas de promediación son empleadas para aumentar el contraste y, siempre y cuando la muestra es reflejada desde diferentes ángulos, se puede reconstruir alta resolución mapa tridimensional (3D). Los más utilizados y exitoso método de reconstrucción 3D a partir de ahora es la sola partícula. Para una revisión reciente, véase Cheng en otros18.
Tinción negativa de TEM (NS-EM) es importante para la detección y control de calidad, cuando se necesita alto contraste o sólo una cantidad limitada de muestra está disponible (adsorción a la película de carbón generalmente concentra la muestra). Sola partícula cryo-EM es el método estándar de oro si reconstrucciones 3D de alta resolución de la estructura de la proteína están destinadas.
<img alt="Diagrama de técnicas de micromanipulación; Incluye deposición de gotas, extracción de nanoestructuras y transferencia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: principios de TEM red preparación y comparación entre el clásico (panel A, B) y un enfoque de microfluidos (panel C, D). A) preparación de red NS-EM clásica: sobre 3 μl de la muestra se pipetea a mano sobre una rejilla de EM recubierta por una película de carbono continua (en lo sucesivo como una 'red de NS-EM') (i). Después de la incubación para aprox. 10 s, papel de filtro se utiliza para secar lejos el exceso de líquido de la parte (ii), dejando las biomoléculas adsorbidas en una película fina de agua. Posteriormente, la proteína es incubada en una solución de sal de metales pesados, por ejemplo, acetato de uranilo 2%, durante 20 s (iii) y otra vez el líquido se quita frotando de un lado con papel de filtro (iv). Finalmente, la red de la EM se deja para secar en el aire. B) preparación de rejilla clásica cryo-EM: acerca de 3 μl de la muestra se pipetea a una mano en una película de carbón perforado. Para formar una película fina de la muestra, se retira el exceso de líquido por un papel borrar cara de uno o ambos lados (ii). Finalmente, la red se sumerge rápidamente en etano líquido para vitrificar (iii). C) preparación de red NS-EM mediante la configuración de cryoWriter: volumen A 5 nL se aspira desde la población de la muestra utilizando un microcapillary (i). Para la muestra de acondicionamiento, la punta de microcapillary se sumerge en la solución de acondicionamiento, por ejemplo, acetato de amonio 2%. Iones y moléculas pequeñas se intercambian por difusión (ii). Tenga en cuenta que las dimensiones de la microcapillary garantizar que todo el proceso es por difusión. Proteínas tienen mucho menor constantes de difusión de los iones de sal y no se pierdan significativamente24. Finalmente, la muestra se suministra a la red y deja secar (iii). D) principios de preparación de red cryo-EM mediante el método basado en la cryoWriter: EM un recubiertos por una película de carbón perforado se coloca en la superficie de una plataforma de control de temperatura y sostenido por pinzas. La temperatura de la plataforma es controlada en un desvío de la temperatura de punto de rocío del ambiente de red. La red se mueve en relación con la microcapillary que contiene la muestra y el microcapillary se baja hasta unos pocos micrómetros por encima de la red. Posteriormente, se dispensan unos nanolitros de muestra de él mientras el escenario se mueve en un patrón espiral; exceso de líquido es nuevamente aspirado (i). Después de red EM cebado, se retira el microcapillary y la red sigue siendo en la plataforma controlado de temperatura (posteriormente conocida como etapa de punto de rocío (DP)) por un corto tiempo permitir que una cantidad controlada de la muestra se evapore. Para inmersión de congelación, la rejilla es rápidamente retirada de los escenarios usando las pinzas (ii), girada 90 ° en posición vertical y sumergida en un baño de criógeno (iii) (en lo sucesivo como mecanismo de selección y el descenso). <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Desafortunadamente, los métodos de preparación de red utilizados para NS y cryo-EM no han mejorado significativamente desde que se inventó. Inconvenientes actuales son el consumo de alto (aprox. 3 μl de proteína 1 mg/mL) y perdida de la gran cantidad (&gt; 99%) de la muestra (figura 1A, B). Además, el método clásico utilizado para preparar las rejillas para cryo-EM es un áspero procedimiento para proteínas: en primer lugar, se trata de un extenso frente papel-blotting paso (figura 1B, ii), y, en segundo lugar, se expone la proteína a la interfaz aire-agua para una cantidad significativa de tiempo21. Aquí, se presenta un método alternativo para el acondicionamiento previo de la muestra, preparación de la red de muestra y procesamiento posterior (rejilla de secado o vitrificación) NS-EM (figura 1C) o cryo-EM (figura 1D). La configuración de construcción interna, llamada "cryoWriter", utiliza miniatura muestra manejo de principios de la tecnología y microfluídicos para aspirar, condición y dispensar la muestra, papel evitando borrar completamente y proporcionar métodos alternativos a las muestras finas para Cryo-EM. Significativamente reduce el consumo de muestra y mejora el control de usuario sobre preparación de la muestra en su conjunto. Además, el método permite aplicaciones experimentales novedosas; como la preparación de componentes biológicos aislados de células individuales en un enfoque llamado "célula proteómica visual"22,23,24,25.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Manejo de líquidos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punta microcapilar</td><td>Nuevo objetivo</td><td>FS360-100-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 &micro; m ID de la punta, 100 y micro; m ID , pk. 20</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FS360-150-30-N-20</td><td>Puntas de sílice 30 y micro; m ID de la punta, 150 y micro; m ID , pk. 20</td></tr><tr><td>Manguito conductor</td><td>Nuevo Objetivo</td><td>CONGAS-1&nbsp;</td><td>Elastómero conductor para contacto de alta tensión, 12" de largo</td></tr><tr><td>Tubo de sílice fundida</td><td>BGB-Analytik</td><td>TSP-150375</td><td>TSP Tubo FS estándar, 150 y micro; m ID, 363 y micro; m OD, 5 metros</td></tr><tr><td>Conector PressFit</td><td>BGB-Analytik</td><td>2525LD</td><td>Deact. Conector PressFit de 0,25 a 0,25 mm de diámetro interior, pk. 25&nbsp;</td></tr><tr><td>Jeringa 10 y micro; l</td><td>BGB-Analytik</td><td>HA-80001</td><td>Hamilton 1701 LT - Punta Luer (aguja no incluida)&nbsp;</td></tr><tr><td>Controlador de bomba de jeringa</td><td>Cetoni</td><td>A3921000093</td><td>controlador neMESYS</td></tr><tr><td>Unidad de dosificación de bomba de jeringa</td><td>Cetoni A3921000095</td><td></td><td>unidad de dosificación neMESYS</td></tr><tr><td><fuerte>Sensor de punto de rocío</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Meltec</td><td>UFT75-AT Sensor de</td><td>humedad/temperatura, cálculo del punto de rocío, USB y DLL integrado</td></tr><tr><td>Temperatura sensor</td><td>Sensorshop24.ch</td><td>LS7-PT1000-1.0-3L sensor de</td><td>temperatura de montaje en superficie Pt1000</td></tr><tr><td>Controlador Peltier</td><td>Cooltronic</td><td>TC2812&nbsp;</td><td>Regulador de temperatura PID para la activación de sistemas accionados por Peltier con salida de tensión constante</td></tr><tr><td>Elemento Peltier</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-127-14-15-S Bloque de</td> refrigeración por agua de <td>40x40 mm</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td>-</td><td>Bloque de refrigeración por agua para elemento peltier de 40x40 mm, base de cobre</td></tr><tr><td>Bomba de agua</td><td>Digitec.ch</td><td></td><td>294877 XSPC X20 750 Bomba de depósito dual de 5,25 bahías Bloque</td></tr><tr><td>de intercambiador de calor de agua</td> V4 negro<td>-</td><td>-Bloque de</td> <td>intercambiador de calor de agua con 2 ventiladores para enfriar el agua circulante</td></tr><tr><td>Enfriadores de agua pequeños</td><td>PCHC.ch</td><td>223050</td><td>Alphacool MCX ram edición cobre 2 piezas</td></tr><tr><td>Elementos peltier pequeños</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-031-10-15-S</td><td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &deg; C, 2 piezas</td></tr><tr><td><fuerte>Mecánica</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etapa lineal eje z</td><td>Dyneos AG</td><td>M-404.2PD</td><td>Platina de traslación de precisión de alta carga, rango de recorrido de 50 mm, motor de CC</td></tr><tr><td>Controlador de etapa</td><td>Dyneos AG</td><td>C-863</td><td>Mercury Servocontrolador</td></tr><tr><td>de mercurio etapa de eje XY</td><td>Prior Scientific H117EIL5 Etapa</td><td></td><td>motorizada para Zeiss Axiovert 200 Microscopio invertido</td></tr><tr><td>Imanes permanentes pequeños</td><td>Supermagnete</td><td>S-05-08-N</td><td>Varilla magnética y barra diagonal; 5 mm, altura 8,47 mm, neodimio, N45, niquelado, pk. 10</td></tr><tr><td>Electroimán pequeño</td><td>Schramme</td><td>EG1025A02/110</td><td>Electroimán 24V 220 N 150 N 2,5 W</td></tr><tr><td>Controlador electroimán</td><td>Conrad.ch</td><td>MST-1630.001 7</td><td>Control de electroimán Placa PCB</td></tr><tr><td>Concentrador</td> <td>de solenoideDistrelec.ch</td><td>HD8286-R-F-24V100%</td><td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td></tr><tr><td>Mini pinzas</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>0302-M5S-PS</td><td>Dumont Tipo 5 mini, puntas súper delgadas</td></tr><tr><td>Varias piezas optomecánicas</td><td>Thorlabs</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Varias piezas mecánicas</td><td>Taller Biozentrum, Universidad de Basilea-Placas</td><td></td> <td>adaptadoras diseñadas a medida, soportes, etc. ver archivos CAD adjuntos</td></tr><tr><td>Optics</diodo láser fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>CPS780S</td><td>módulo de diodo láser de 780 nm Fotodetector de 2,5 mW</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>PDA100A-EC Detector de</td><td>ganancia conmutable de silicio, 320-1100 nm, 2,4 MHz BW, 100 mm2</td></tr><tr><td>EM grids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DURASIN FILM TEM</td><td></td> <td>emsdiasum.comDTF-03523</td><td>30 nm DuraSiN&trade; membranas de nitruro de silicio para TEM, paquete de 5</td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffers / Neg. stain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537&nbsp; SIGMA</td><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato</td></tr><tr><td>NanoVan 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Tinción negativa a base de vanadio</td></tr><tr><td>NanoW 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Tinción negativa a base de tungsteno</td></tr><tr><td><fuerte>Software</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>openBEB</td><td></td><td></td><td>El marco openBEB 2 está disponible a pedido, la versión 3 será descargable</td></tr><tr><td>Control CryoWriter software (complemento openBEB)</td><td></td><td>Disponible a pedido, es posible que se apliquen tarifas adicionales para el software de controlador de terceros.</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Debido a recientes avances tecnológicos, microscopia del cryo-electrón (cryo-EM) se está convirtiendo en un método estándar para el análisis estructural de complejos de la proteína a resolución atómica. Sin embargo, técnicas de aislamiento de proteínas y métodos de preparación de la muestra de EM siguen siendo un cuello de botella. Un número relativamente pequeño (100.000 a un par de millones) de partículas individuales de la proteína necesitan ser reflejada para el análisis de alta resolución de proteínas por la sola partícula enfoque EM, que hace la miniatura muestra manejo de técnicas y principios de microfluidos factible.
Se presenta un método miniaturizado, sin borrar los papeles EM red preparación para acondicionamiento previo de la muestra, EM grid cebado y procesamiento posterior que sólo consume nanoliter-volúmenes de muestra. El método utiliza un sistema de dosificación con precisión sub-nanoliter, absorción de líquidos de control y cebado de EM grid, una plataforma para controlar la temperatura de la red determinando la humedad relativa por encima de la rejilla de EM y un pick-y-caída-mecanismo para la muestra vitrificación. Para cryo-EM, se coloca una rejilla de EM en la etapa de control de temperatura y la muestra es aspirada en un tubo capilar. La punta del capilar se coloca cerca de la superficie de la rejilla, la rejilla está cargada con la muestra y exceso es nuevamente aspirada en el microcapillary. Posteriormente, la película muestra es estabilizada y un poco enrarecida por la evaporación controlada del agua regulada por la compensación de la temperatura de la plataforma respecto al punto de rocío. En un momento dado se activa el mecanismo de selección y penetración, transferir rápidamente la red EM preparada en etano líquido para vitrificación de muestra. Como alternativa, métodos de acondicionamiento de muestra están disponibles para preparar volúmenes nanoliter-tamaño de la muestra para tinción negativa (NS) EM.
Las metodologías en gran medida reducen el consumo de muestra y evitar los enfoques potencialmente dañinos a las proteínas, tales como la transferencia de papel de filtro utilizado en los métodos convencionales. Además, la minúscula cantidad de muestra necesaria permite nuevas estrategias experimentales, como muestra rápida acondicionado, combinación con lisis celular solo para "proteómica visual", o "lossless" preparación de la muestra total para el análisis cuantitativo de muestras complejas.

Se presenta un instrumento y métodos para la preparación de volúmenes nanoliter-tamaño de la muestra para microscopía electrónica de transmisión. No se requieren, evitando las consecuencias perjudiciales que esto puede tener para las proteínas, significativamente reducir la pérdida de muestra y que permite el análisis de lisado de proteómica visual única célula pasos papel-blotting.

Preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de la estructura, como la preparación de proteínas sensibles, donde se dispone de una cantidad limitada de proteína. La principal ventaja de esta técnica es que, en comparación con los métodos estándar de preparación de muestras, solo se requieren cantidades mínimas de muestra y que no se requiere un paso brusco de transferencia de papel. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el análisis de células individuales mediante proteómica visual, o el diagnóstico de enfermedades relacionadas con proteínas.La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando teníamos la tecnología disponible para resolver estructuras de alta resolución con solo unas 100.000 partículas individuales. Para comenzar, prepare la muestra como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, ensamble la taza de etano, el soporte de la caja criogénica y la araña.Y llene el recipiente criógeno hasta el borde con nitrógeno líquido. Después de unos minutos, la taza estará fría y libre de nitrógeno líquido. Luego abra la botella de gas etano y deje que el gas fluya lentamente hacia la taza de etano.Deje que la taza se llene con etano líquido hasta que el nivel esté dos o tres milímetros por debajo de la parte superior. Esto tomará unos minutos y requiere unos cinco mililitros de etano líquido. Retire la araña, coloque la tapa de poliestireno en la parte superior y coloque el contenedor criogénico en el montaje en el crioescritor.Sujete la rejilla EM descargada por brillo con las pinzas del crioescritor, anude las pinzas en el electroimán y atornille el micromanipulador para alinear la rejilla plana en el escenario, con el lado de la película de carbono hacia arriba. De vuelta en el software, haga doble clic en grid_save. A continuación, ajuste la posición del microcapilar, de modo que la punta quede aproximadamente 10 micrómetros por encima de la superficie de la rejilla.Asegúrese de que el microcapilar pueda moverse libremente a través de la rejilla, sin tocarlo en ninguna parte. Y si es necesario, extraer el microcapilar unos micrómetros. A continuación, llévelo a su posición de nuevo al centro de la cuadrícula y guarde la nueva posición como cuadrícula.Mueva el microcapilar de regreso a la posición inicial. A continuación, enjuague el microcapilar con unas pocas decenas de nanolitros de líquido del sistema y use un pañuelo sin pelusa para eliminar las gotas del microcapilar. Con todo ya preparado, inicie el script de macros.El macro primero se mueve a la posición y dispensa cinco nanolitros de líquido del sistema para eliminar las burbujas de aire en la punta, y luego se mueve a la posición de las muestras. A continuación, aspira 65 nanolitros de muestra y, a continuación, vuelve a infundir cinco nanolitros en el tubo de muestra. Esto tiene en cuenta la holgura del sistema y permite la escritura sincronizada.Después de que se mueve a la posición de la cuadrícula, inicia un patrón de escritura, lo que hará que el microcapilar se mueva a través de la cuadrícula y dispense simultáneamente 45 nanolitros de muestra. A continuación, mueve el microcapilar de vuelta al centro de la rejilla, lo baja otros 10 micrómetros y retira el exceso de líquido de la muestra. Finalmente, el macro retira el microcapilar y apaga el electroimán, lo que inicia el mecanismo de congelación por inmersión.Una vez liberado del imán, suelte con cuidado el adaptador magnético del émbolo y transfiera rápidamente la rejilla de la copa de etano al contenedor criogénico, que contiene la caja criogénica, colocando la rejilla en una ranura libre. Para comenzar, prepare las células como se describe en el protocolo de texto adjunto y monte el portaobjetos de óxido de indio y estaño en el inserto del microscopio. Use dos tornillos para fijar la corredera en el inserto de aluminio y para asegurar el contacto eléctrico entre el recubrimiento de óxido de indio y estaño de la corredera y el marco de aluminio conectado a tierra eléctricamente.A continuación, retire el medio de cultivo celular del pocillo y lave las células dos veces con 300 microlitros de tampón de electroporación. Después del último lavado, mantenga las celdas en el tampón de electroporación. A continuación, coloque el inserto de aluminio que sostiene el portaobjetos de óxido de indio y estaño en la etapa de la incubadora de células vivas, en la configuración.Usando el microscopio, ubique el cultivo celular y elija un área sin células. Acérquese a la punta del microcapilar en la superficie del portaobjetos y tóquela suavemente. A continuación, retire la punta en 100 micrómetros y guarde la posición como celdas.Ahora abandone rápidamente el cultivo celular y enjuague la punta del microcapilar con unas pocas decenas de nanolitros de líquido del sistema, luego vuelva a colocarlo en el cultivo celular. Dispense unos pocos nanolitros durante la inmersión en el pozo PDMS para asegurarse de que no queden burbujas de aire atrapadas en la punta. Haga doble clic en la posición de la celda y acérquese suavemente a la superficie del portaobjetos de óxido de indio y estaño y, al contacto, retraiga la punta 10 micrómetros.En este punto, seleccione una celda cercana para la lisis y coloque la punta del microcapilar sobre la celda objetivo. A continuación, inicie el script de macros para la lisis de una sola célula.Una vez iniciado, el script solicitará una posición a la que se debe mover el microcapilar después de que una célula se haya lisado con éxito. Introduzca la posición deseada, por ejemplo, la cuadrícula, para la cuadrícula EM. A continuación, la macro procederá sin intervención del usuario y comenzará moviendo la etapa del microscopio en el cultivo celular 100 micrómetros hacia la izquierda, donde toma una instantánea de la célula objetivo.A continuación, 15 nanolitros de agua bidestilada se dispensan del tubo microcapilar, desplazando y diluyendo el tampón con alto contenido de sal, aplicando presión osmótica a la célula. A continuación, la etapa se mueve hacia atrás para volver a colocar la punta sobre la celda objetivo. Allí, se aplica una ráfaga de voltaje predefinida y, después de 500 milisegundos, el sistema de bombeo comienza a aspirar tres nanolitros de muestra a un caudal de dos microlitros por minuto.Finalmente, la etapa se mueve nuevamente hacia la izquierda, lo que permite inspeccionar la celda. Aparecerá una ventana en la que se solicitará la entrada del usuario. Si la celda se ha realizado correctamente, escriba sí para tomar una instantánea de la célula lisada.Posteriormente, el microcapilar se desplaza a la endolocalización, sumergido en el líquido del depósito. Deje el microcapilar sumergido durante ocho a 12 minutos, dependiendo de la geometría de la boquilla. A continuación, dispense cinco nanolitros del lisado celular acondicionado en la rejilla.Retire el microcapilar y deje que la muestra condicionada se seque lentamente en una etapa de punto de rocío. Finalmente, retire la rejilla del escenario y guárdela a temperatura ambiente en una caja de rejilla. Aquí se muestran imágenes criogénicas típicas de muestras congeladas utilizando la configuración de CryoWriter descrita.En la vista general de la cuadrícula, se puede ver claramente la periferia del hielo vítreo. Al examinar más de cerca una ranura de la rejilla con la película de carbono agujereada que contiene hielo vítreo, se pueden encontrar agujeros blancos, lo que indica que no todos los agujeros se llenaron con tampón de muestra. En una de las muestras que contiene agujeros de carbono, se puede ver claramente con detalle la cola de un bacteriófago.Usando el CryoWriter configurado para realizar proteómica visual de una sola célula, se pueden ver cosas como proteínas individuales, por ejemplo, actina filamentosa y parches de membrana con proteínas adjuntas. La imagen que se puede ver en el panel 6b está teñida negativamente con una tinción negativa del 2%, basada en un compuesto de organotungsteno. El panel c muestra un lisado unicelular preparado para crioelectroelectromagnética. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar rejillas de tinción negativa o criomielíticas, a partir de volúmenes totales de nanolitros de muestras de proteínas o extractos de una sola célula.No olvide que trabajar con etano y nitrógeno líquidos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de gafas de seguridad y una bata de laboratorio, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Cryo microscopios electrónicos, ya sea de barrido (SEM) o transmisión (TEM), son ampliamente utilizados para la caracterización de las muestras biológicas o de otros materiales con un alto contenido de agua 1. Un SEM / haz de iones focalizados (FIB) se utiliza para identificar las características de interés en muestras y extraer una lámina delgada, transparente-de electrones para la transferencia a un crio-TEM.

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