Preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión
July 27th, 2018
Se presenta un instrumento y métodos para la preparación de volúmenes nanoliter-tamaño de la muestra para microscopía electrónica de transmisión. No se requieren, evitando las consecuencias perjudiciales que esto puede tener para las proteínas, significativamente reducir la pérdida de muestra y que permite el análisis de lisado de proteómica visual única célula pasos papel-blotting.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de la estructura, como la preparación de proteínas sensibles, donde se dispone de una cantidad limitada de proteína. La principal ventaja de esta técnica es que, en comparación con los métodos estándar de preparación de muestras, solo se requieren cantidades mínimas de muestra y que no se requiere un paso brusco de transferencia de papel. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el análisis de células individuales mediante proteómica visual, o el diagnóstico de enfermedades relacionadas con proteínas.
La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando teníamos la tecnología disponible para resolver estructuras de alta resolución con solo unas 100.000 partículas individuales. Para comenzar, prepare la muestra como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, ensamble la taza de etano, el soporte de la caja criogénica y la araña.
Y llene el recipiente criógeno hasta el borde con nitrógeno líquido. Después de unos minutos, la taza estará fría y libre de nitrógeno líquido. Luego abra la botella de gas etano y deje que el gas fluya lentamente hacia la taza de etano.
Deje que la taza se llene con etano líquido hasta que el nivel esté dos o tres milímetros por debajo de la parte superior. Esto tomará unos minutos y requiere unos cinco mililitros de etano líquido. Retire la araña, coloque la tapa de poliestireno en la parte superior y coloque el contenedor criogénico en el montaje en el crioescritor.
Sujete la rejilla EM descargada por brillo con las pinzas del crioescritor, anude las pinzas en el electroimán y atornille el micromanipulador para alinear la rejilla plana en el escenario, con el lado de la película de carbono hacia arriba. De vuelta en el software, haga doble clic en grid_save. A continuación, ajuste la posición del microcapilar, de modo que la punta quede aproximadamente 10 micrómetros por encima de la superficie de la rejilla.
Asegúrese de que el microcapilar pueda moverse libremente a través de la rejilla, sin tocarlo en ninguna parte. Y si es necesario, extraer el microcapilar unos micrómetros. A continuación, llévelo a su posición de nuevo al centro de la cuadrícula y guarde la nueva posición como cuadrícula.
Mueva el microcapilar de regreso a la posición inicial. A continuación, enjuague el microcapilar con unas pocas decenas de nanolitros de líquido del sistema y use un pañuelo sin pelusa para eliminar las gotas del microcapilar. Con todo ya preparado, inicie el script de macros.
El macro primero se mueve a la posición y dispensa cinco nanolitros de líquido del sistema para eliminar las burbujas de aire en la punta, y luego se mueve a la posición de las muestras. A continuación, aspira 65 nanolitros de muestra y, a continuación, vuelve a infundir cinco nanolitros en el tubo de muestra. Esto tiene en cuenta la holgura del sistema y permite la escritura sincronizada.
Después de que se mueve a la posición de la cuadrícula, inicia un patrón de escritura, lo que hará que el microcapilar se mueva a través de la cuadrícula y dispense simultáneamente 45 nanolitros de muestra. A continuación, mueve el microcapilar de vuelta al centro de la rejilla, lo baja otros 10 micrómetros y retira el exceso de líquido de la muestra. Finalmente, el macro retira el microcapilar y apaga el electroimán, lo que inicia el mecanismo de congelación por inmersión.
Una vez liberado del imán, suelte con cuidado el adaptador magnético del émbolo y transfiera rápidamente la rejilla de la copa de etano al contenedor criogénico, que contiene la caja criogénica, colocando la rejilla en una ranura libre. Para comenzar, prepare las células como se describe en el protocolo de texto adjunto y monte el portaobjetos de óxido de indio y estaño en el inserto del microscopio. Use dos tornillos para fijar la corredera en el inserto de aluminio y para asegurar el contacto eléctrico entre el recubrimiento de óxido de indio y estaño de la corredera y el marco de aluminio conectado a tierra eléctricamente.
A continuación, retire el medio de cultivo celular del pocillo y lave las células dos veces con 300 microlitros de tampón de electroporación. Después del último lavado, mantenga las celdas en el tampón de electroporación. A continuación, coloque el inserto de aluminio que sostiene el portaobjetos de óxido de indio y estaño en la etapa de la incubadora de células vivas, en la configuración.
Usando el microscopio, ubique el cultivo celular y elija un área sin células. Acérquese a la punta del microcapilar en la superficie del portaobjetos y tóquela suavemente. A continuación, retire la punta en 100 micrómetros y guarde la posición como celdas.
Ahora abandone rápidamente el cultivo celular y enjuague la punta del microcapilar con unas pocas decenas de nanolitros de líquido del sistema, luego vuelva a colocarlo en el cultivo celular. Dispense unos pocos nanolitros durante la inmersión en el pozo PDMS para asegurarse de que no queden burbujas de aire atrapadas en la punta. Haga doble clic en la posición de la celda y acérquese suavemente a la superficie del portaobjetos de óxido de indio y estaño y, al contacto, retraiga la punta 10 micrómetros.
En este punto, seleccione una celda cercana para la lisis y coloque la punta del microcapilar sobre la celda objetivo. A continuación, inicie el script de macros para la lisis de una sola célula.
Una vez iniciado, el script solicitará una posición a la que se debe mover el microcapilar después de que una célula se haya lisado con éxito. Introduzca la posición deseada, por ejemplo, la cuadrícula, para la cuadrícula EM. A continuación, la macro procederá sin intervención del usuario y comenzará moviendo la etapa del microscopio en el cultivo celular 100 micrómetros hacia la izquierda, donde toma una instantánea de la célula objetivo.
A continuación, 15 nanolitros de agua bidestilada se dispensan del tubo microcapilar, desplazando y diluyendo el tampón con alto contenido de sal, aplicando presión osmótica a la célula. A continuación, la etapa se mueve hacia atrás para volver a colocar la punta sobre la celda objetivo. Allí, se aplica una ráfaga de voltaje predefinida y, después de 500 milisegundos, el sistema de bombeo comienza a aspirar tres nanolitros de muestra a un caudal de dos microlitros por minuto.
Finalmente, la etapa se mueve nuevamente hacia la izquierda, lo que permite inspeccionar la celda. Aparecerá una ventana en la que se solicitará la entrada del usuario. Si la celda se ha realizado correctamente, escriba sí para tomar una instantánea de la célula lisada.
Posteriormente, el microcapilar se desplaza a la endolocalización, sumergido en el líquido del depósito. Deje el microcapilar sumergido durante ocho a 12 minutos, dependiendo de la geometría de la boquilla. A continuación, dispense cinco nanolitros del lisado celular acondicionado en la rejilla.
Retire el microcapilar y deje que la muestra condicionada se seque lentamente en una etapa de punto de rocío. Finalmente, retire la rejilla del escenario y guárdela a temperatura ambiente en una caja de rejilla. Aquí se muestran imágenes criogénicas típicas de muestras congeladas utilizando la configuración de CryoWriter descrita.
En la vista general de la cuadrícula, se puede ver claramente la periferia del hielo vítreo. Al examinar más de cerca una ranura de la rejilla con la película de carbono agujereada que contiene hielo vítreo, se pueden encontrar agujeros blancos, lo que indica que no todos los agujeros se llenaron con tampón de muestra. En una de las muestras que contiene agujeros de carbono, se puede ver claramente con detalle la cola de un bacteriófago.
Usando el CryoWriter configurado para realizar proteómica visual de una sola célula, se pueden ver cosas como proteínas individuales, por ejemplo, actina filamentosa y parches de membrana con proteínas adjuntas. La imagen que se puede ver en el panel 6b está teñida negativamente con una tinción negativa del 2%, basada en un compuesto de organotungsteno. El panel c muestra un lisado unicelular preparado para crioelectroelectromagnética. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar rejillas de tinción negativa o criomielíticas, a partir de volúmenes totales de nanolitros de muestras de proteínas o extractos de una sola célula.
No olvide que trabajar con etano y nitrógeno líquidos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de gafas de seguridad y una bata de laboratorio, al realizar este procedimiento.
Visión general
Este artículo presenta un método novedoso para preparar volúmenes de muestra de nanolitros para microscopía electrónica de transmisión sin necesidad de pasos de secado con papel. Esta técnica reduce significativamente la pérdida de muestra y permite el análisis de lisados de células individuales para proteómica visual.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología estructural
- Proteómica
- Análisis de células individuales
Antecedentes
- Los métodos tradicionales de preparación de muestras a menudo requieren grandes cantidades de muestra.
- El secado con papel puede afectar adversamente a las proteínas sensibles.
- Este método permite el análisis de cantidades limitadas de proteínas.
- Las estructuras de alta resolución pueden resolverse con muestra mínima.
Propósito del estudio
- Desarrollar una técnica que minimice la pérdida de muestra durante la preparación.
- Facilitar el análisis de lisados de células individuales.
- Mejorar el diagnóstico de enfermedades relacionadas con proteínas a través de la proteómica visual.
Métodos utilizados
- Preparación de muestras en un contenedor criogénico.
- Uso de un microcapilar para la distribución precisa de la muestra.
- Implementación de un macro script para el manejo automatizado de muestras.
- Aplicación de presión osmótica para la lisis celular.
Principales resultados
- El método prepara exitosamente volúmenes de nanolitros sin pérdida de muestra.
- Los lisados de células individuales pueden analizarse efectivamente.
- La imagen de proteínas de alta resolución es alcanzable.
- La técnica muestra promesa para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con proteínas.
Conclusiones
- Este método innovador mejora el estudio de proteínas sensibles.
- Abre nuevas vías para el análisis de células individuales en proteómica.
- La ausencia de secado con papel mejora la integridad de la muestra.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical bottleneck in structural biology by enabling high-resolution protein analysis from nanoliter sample volumes, directly supporting target validation when protein availability is limited. By eliminating paper blotting and reducing sample loss, it enhances sample integrity and reproducibility—key factors for reliable assay development and mechanistic de-risking in early discovery. The capability to integrate with single-cell lysis opens pathways for visual proteomics, expanding the utility of cryo-EM in phenotypic screening and biomarker discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables structural characterization of low-abundance or sensitive protein targets that are difficult to isolate in sufficient quantities using conventional methods.
- Operational Value: Reduces sample consumption from microgram to nanogram scales, conserving precious material for downstream assays and minimizing waste in precious target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports confident target de-risking by providing high-fidelity structural data from minimal input, improving go/no-go decisions in lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces vitrified samples suitable for single-particle cryo-EM, enabling quantitative structural readouts that can inform binding affinity and conformational dynamics in assay development.
- Operational Value: Uses a dispensing system with sub-nanoliter precision, ensuring reproducible sample deposition across grids and supporting assay standardization.
- Scalability: The macro-driven automation allows consistent processing of multiple samples, facilitating medium-throughput screening campaigns when integrated with robotic sample handling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables structural follow-up of biomarkers identified in phenotypic screens, linking target engagement to atomic-level mechanism.
- Mechanistic De-risking: Facilitates visualization of protein complexes, post-translational modifications, or mutation effects in disease-relevant systems without requiring large-scale protein production.
- Quantitative Readiness: The method’s ability to prepare “lossless” total sample supports accurate quantification of complex mixtures, aiding in biomarker validation and pharmacokinetic studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through structural insight and enabling progression to lead identification by reducing biological uncertainty in protein targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing high-resolution structural data on protein targets, clarifying binding sites and mechanistic function from limited samples.
- Screening: Delivers assay-ready grids with standardized sample thickness and ice quality, improving reliability in downstream screening and hit validation.
- Analytics: Generates quantitative structural outputs such as particle distribution, ice thickness, and molecular occupancy, enabling objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by allowing structural analysis of disease variants or biomarker candidates derived from patient samples or single-cell lysates.
- Enterprise Reuse: The automated macro script and temperature-controlled platform create a reusable infrastructure for structural proteomics across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target structure and function, reducing ambiguity in mechanistic interpretation.
- Operational Value: Eliminates variability introduced by manual blotting, improving reproducibility and throughput in grid preparation.
- Strategic Value: Lowers the barrier to studying challenging targets, enabling broader exploration of the proteome and reducing reliance on overexpression systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing structural evidence early in the discovery pipeline, de-risking investment in high-value targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM sample preparation, microfluidic handling, and macro-based automation systems.
- Dependent on specialized instrumentation including a cryogen container, ethane plunge system, temperature-controlled stage, and precision microcapillary dispenser.
- Necessitates standardization of environmental controls (humidity, temperature) to ensure consistent sample vitrification across runs.
- Adaptation to different sample types (e.g., membrane proteins, complexes) may require optimization of buffer conditions and blotting alternatives.
- Practical limitations include the need for hazardous material handling (liquid ethane, nitrogen) and initial setup complexity, though operational simplicity improves post-training.
