Analizando Synaptic Modulación de Drosophila melanogaster Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

El objetivo general de este procedimiento experimental es comprender la dinámica sináptica en una sola neurona bajo diferentes condiciones de activación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la plasticidad sináptica, como revelar cambios en la composición molecular de las sinapsis tras la maduración de la actividad de la neurona. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis semiautomatizado de múltiples aspectos de las sinapsis, incluyendo su número, distribución y el nivel de enriquecimiento de los componentes moleculares después de las sinapsis.

Para este experimento, recoja las moscas en viales normales dentro de las seis horas posteriores a la eclosión. Cargue los viales de recolección en una rejilla de acrílico transparente. En una incubadora pequeña configurada a 25 grados centígrados, coloque el estante a una distancia precisa de un panel LED donde la exposición a la luz sea de un promedio de 1000 lux.

Luego, vuela trasera durante uno a tres días usando una de las siguientes condiciones, ya sea oscuridad constante, 12 horas de luz seguidas de 12 horas de oscuridad o luz constante. Más tarde, disecciona y tiñe los cerebros utilizando técnicas estándar. Para montar los cerebros de mosca, cargue una micropipeta con medio de montaje y deposite dos gotas de 2 microlitros en el centro de un portaobjetos de microscopio a unos 2 cm de distancia.

Coloque un cubreobjetos en cada gota y la ranura entre aproximadamente 0,2 mm. A continuación, deposite 15 microlitros de medio de montaje sobre los deslizamientos de la cubierta y en el espacio. Bajo un microscopio de disección, deposite el cerebro en el espacio de la micropipeta.

Y luego coloque los cerebros, con el lado ventral hacia arriba. Finalmente, coloque un cubreobjetos y séllelo a lo largo de los bordes con esmalte de uñas transparente. A continuación, se pueden obtener imágenes de los cerebros utilizando técnicas estándar para reconstituir imágenes en 3D.

En este caso, la luminiscencia de GFP se documenta en células con expresión activa de Brp utilizando el método de estrella. También en este ejemplo, los axones de los fotorreceptores R7 y R8 se inmunoanalizaron con anticiaoptina, que se observó utilizando anticuerpos secundarios marcados con RFP. Para cuantificar el número, la distribución y el nivel de deslocalización de la Brp GFP puncta, primero se cargaron imágenes 3D reconstituidas del cerebro hechas a partir de pilas de imágenes.

Los puntos Brp se muestran en blanco. Ahora, encuentra la región de interés. En este caso, los terminales del axón R8 se localizan siguiendo el adelgazamiento de los axones positivos de anticiaoptina en el punto de entrada a la capa de médula M3.

En cada terminal de axón R8 identifique los puntos Brp GFP utilizando el módulo de detección puntual. Seleccione Agregar nuevos puntos y, a continuación, seleccione segmentar solo la región de interés en la configuración del algoritmo. Una vez definida la región de análisis, establezca el canal de origen en Brp GFP y, a continuación, establezca el diámetro XY estimado en 0,35 micras.

Y luego, marque la sustracción de fondo en la detección puntual. A continuación, seleccione calidad como tipo de filtro y los puntos se filtrarán automáticamente. Complete este paso haciendo clic en finalizar.

Repita el método de detección puntual para todos los axones R8 del conjunto de datos. La siguiente región a identificar es el citoplasma del axón. En primer lugar, genere objetos de superficie con la función de superficie.

A continuación, seleccione Agregar nuevas superficies y, en la configuración del algoritmo, alternar solo la región de interés del segmento. Ahora, seleccione manualmente la región de interés. A continuación, establezca los perímetros de cálculo.

Para encontrar el canal fotorreceptor como fuente, seleccione la opción suave. Para el umbral, seleccione intensidad absoluta. Habilite la opción dividir objetos táctiles.

Establezca el diámetro de los puntos de asiento en 0,5 micras y utilice la configuración de filtro predeterminada para la calidad y el número de vóxeles. A continuación, el filtro se aplica automáticamente. Ahora, ve a editar y eliminar los trozos de superficie generados fuera de la región de interés.

En este caso, los otros axones. Después de repetir la detección de la región axonal para todos los axones R8 del conjunto de datos, todos los axones Brp puncta y R8 se identifican como un conjunto de objetos puntuales. Y las regiones citoplasmáticas correspondientes se identifican como objetos de superficie.

Ahora, proceda definiendo manualmente la orientación y el espacio de cada axón. Esto es importante para la cuantificación posterior de la densidad de Brp GFP a lo largo de cada neurona en el neurópilo de médula. Para ello, primero defina sus puntos de inicio y finalización.

Seleccione Agregar nuevos puntos de medición y, a continuación, seleccione Editar seguido de Seleccionar superficie del objeto para trabajar con la parte superior de los objetos de superficie. Para definir los puntos de inicio, coloque puntos de medición en todos los objetos de superficie de los axones R en la capa M1. Coloque estos puntos en un orden sistemático y reproducible.

A continuación, defina los puntos finales. Seleccione agregar nuevos puntos de medición, editar y volver a la superficie del objeto. Luego, repitiendo el mismo orden sistemático, coloque los puntos de medición en la parte inferior de los axones R en la capa M3.

Para cuantificar la intensidad de fondo de Brp, analice las regiones citoplasmáticas de dos axones R7. Seleccione agregar nuevas superficies y defina manualmente la región de un axón R7 como se hizo para los axones R8. Use configuraciones idénticas, excepto que no active la opción habilitar objetos táctiles divididos.

Deja esto fuera. A continuación, agregue un objeto de puntos ficticios dentro de una región de axón R7 definida. Seleccione Agregar nuevas manchas, seleccione omitir la creación automática y edite manualmente.

A continuación, seleccione el centro del objeto y haga clic en el objeto de superficie para colocar el objeto de puntos ficticios dentro del axón R7. Ahora, repita los pasos de detección de superficies y puntos para un segundo axón R7. Y luego defina los puntos terminales inicial y final de los axones R7 como se hace con los axones R8.

Para este análisis, asegúrese de tener instalado el software correcto. Abra el dataset que contiene los datos puntuales, los datos de superficies y dos objetos de punto de medición, cada uno de los cuales contiene el mismo número de puntos de medición. Inspeccione los datos.

Ambos objetos de punto de medición deben tener el mismo número de puntos de medición para que los cálculos funcionen. Una vez que se hayan definido los puntos, las regiones de los axones y los puntos de inicio y finalización, inicie el complemento. En primer lugar, compruebe los metadatos, en particular, el tamaño del vóxel.

Abra las propiedades de la imagen desde la edición y, a continuación, compruebe las 3 dimensiones del vóxel y las micras en Coordenadas en Geometría. A continuación, seleccione un canal para el análisis de intensidad. En este caso, se selecciona el canal que muestra Brp GFP.

A continuación, defina el nombre de archivo para los resultados. A continuación, defina el número de bins como 10 y establezca la longitud del axón en 100%Luego defina las regiones de los puntos estableciendo el radio del punto en 0,35 micras y la región citoplasmática circundante en 50 micras. Por último, ejecute el comando de detección de sinapsis y, posteriormente, analice estadísticamente la salida.

Siguiendo los protocolos descritos, se analizaron los puntos Brp GFP en las sinapsis R8 de moscas expuestas a oscuridad constante, luz constante o un ciclo normal de luz/oscuridad. El número de Brp puncta se redujo significativamente en los fotorreceptores R8 de moscas mantenidas en luz constante. La distribución de los puntos se calculó utilizando un complemento personalizado.

Las sinapsis R8 se distribuyeron a lo largo de todo el eje axonal desde la capa M1 hasta la capa M3, pero su densidad fue mayor en las capas M1 y M3. Del mismo modo, se calcularon los niveles de deslocalización de los puntos. Se mantuvieron sin cambios en todas las condiciones, sin embargo, los niveles de deslocalización de Brp GFP difirieron de otros reporteros, como Brp-short-cherry que se desactiva claramente bajo luz constante.

Es posible que haya un procesamiento inadecuado del fragmento corto de Brp después de desensamblarlo de la AZ. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar las propiedades plásticas sinápticas en una sola neurona. Tales propiedades plásticas incluyen el número de sinapsis, su distribución y la etiqueta de enriquecimiento de un componente molecular específico después de las sinapsis.