El campo local microscopía de fluorescencia: Imágenes señales celulares en los corazones intactos
8 de marzo de 2017
En el corazón, los eventos moleculares coordinan la función eléctrica y contráctil del órgano. Un conjunto de técnicas de microscopía de fluorescencia de campo locales que aquí se presenta permite el registro de las variables celulares en los corazones intactos. La identificación de los mecanismos que definen la función cardíaca es fundamental para entender cómo el corazón trabaja en situaciones patológicas.
El objetivo general de esta técnica de imagen de microscopía de fluorescencia de campo local es utilizar sondas moleculares para medir los niveles de calcio intracelular, o potenciales de membrana de regiones cardíacas de difícil acceso a nivel de todo el corazón. Este método puede ayudarnos a responder preguntas cardiovasculares clave relacionadas con el paro cardíaco y la isquemia. La principal ventaja de esta técnica es que las propiedades cardíacas se miden a partir de eventos celulares en el órgano intacto donde las células continúan acopladas eléctrica, mecánica y metabólicamente.
Primero, prepare el aparato Langendorff horizontal. Cargue la solución Tyrode recién preparada en las jeringas de 60 mililitros y agregue todos los tubos asociados de la configuración. Una vez lleno, elimina todas las burbujas de aire.
A continuación, equilibre la solución cargada con gas oxígeno puro suministrado por una piedra difusora de plástico sumergida. A continuación, coloque una sutura quirúrgica no absorbible alrededor de una aguja. Esto servirá como una cánula para retroperfundir el corazón cuando esté conectado al aparato.
A continuación, se recoge el corazón después de inyectar heparina y eutanasia al animal. Primero, limpie el cofre con etanol. La demostración es con un ratón, pero el mismo procedimiento funciona para la recolección del corazón del periquito.
A continuación, con unas tijeras de disección, haz una incisión en la parte inferior del abdomen y luego corta los lados hacia el cuello. Luego, corte con cuidado el diafragma, evitando el corazón. Ahora, retira el tejido cortado y sujétalo con alfileres.
A continuación, extraiga los pulmones y los tejidos circundantes para exponer el corazón. Una vez expuesto, use pinzas para sacar el corazón sin apretarlo. Sepárelo del animal cortando la aorta y deje la mayor cantidad posible de aorta unida al corazón.
Luego, cargue el corazón en un pequeño bote de pesaje con un mililitro de solución de Tyrode. Bajo un microscopio de disección, extraiga rápidamente la sangre y el tejido graso que rodea el corazón con pinzas y tijeras. Con una sutura quirúrgica no reabsorbible y una aguja, fije la aorta a la conexión horizontal del aparato de Langendorff.
Asegura el nudo con dos pinzas finas. A continuación, comience la retroperfusión abriendo la válvula para liberar la solución de Tyrode. Limpie el tejido circundante y succione los residuos para mantener limpia la cámara horizontal mientras el corazón se estabiliza durante 10 minutos.
Haz que el tinte sea fresco. Para Rhod-2 AM, agregue 20 microlitros de 20% Pluronic y DMSO al paquete de tinte de 50 microgramos del fabricante. Mezclar por pipeteo, evitando burbujas.
Luego, transfiera el tinte licuado a un frasco de vidrio transparente y agregue un mililitro de solución de Tyrode. Disuelve completamente el tinte en esta mezcla utilizando de 15 a 20 minutos de sonicación. A continuación, perfunda el tinte preparado con una bomba peristáltica a temperatura ambiente.
Primero, cargue el tinte en la cámara de tinte y luego, sujete todas las líneas de tubos conectadas al colector y mantenga las abrazaderas por encima del colector para evitar el reflujo. A continuación, encienda la bomba y cierre inmediatamente la válvula de tres vías debajo de la jeringa de 60 mililitros. Coloque el pequeño tubo conectado al extremo de succión de la bomba junto al corazón para recircular el tinte después de que se haya perfundido.
Tome una aguja de calibre pequeño y aplíquela a través del ápice para aliviar la presión. Luego, deja que el corazón se impregne con el tinte durante 30 minutos. Durante este tiempo, es muy importante evaluar el nivel del tinte para que no entren burbujas en el tejido, lo que causaría isquemia y daño tisular.
Después de perfundir el tinte, retroperfunde el corazón con la solución Tyrode. Retire la abrazadera sobre el colector. Abra la válvula y luego deje que el corazón se estabilice durante 10 minutos.
Durante la retroperfusión, llene la cámara horizontal con solución Tyrode y encienda la unidad Peltier para llevar la temperatura del baño a 37 grados centígrados. Para preparar la luz de fibra óptica para el experimento, primero coloque la fibra óptica dentro de una pipeta de dos mililitros. Y, a continuación, conecte la pipeta a un micromanipulador.
Utilice el micromanipulador para presionar ligeramente la fibra óptica contra la superficie del ventrículo lateral. A continuación, programe un generador de ondas para que proporcione un pulso cuadrado con un ancho de un milisegundo. Y configure un estimulador cardíaco para que se sincronice externamente y se conecte al generador de ondas.
En cada una de las dos salidas del estimulador, conecte un cable con una aguja de acupuntura soldada en el extremo. Coloque dos agujas de acupuntura en el ápice del corazón, a unos tres milímetros de distancia. Solo una vez colocadas las agujas, se pone en marcha el estimulador, evitando así descargas accidentales.
Ahora, para registrar la señal epicárdica, ajuste la frecuencia de adquisición en el software a 10 kilohercios. Para recoger la señal endocárdica, siga el mismo procedimiento, pero use una aguja de calibre 23 para hacer un orificio en el ventrículo lateral cerca del tabique. Y luego, usando un micromanipulador, coloque la segunda fibra óptica en el endocardio.
Para acceder a la función transmural se comparó la morfología de los potenciales de acción registrados desde el endocardio y el epicardio. Los registros de fluorescencia se realizaron después de tratar el corazón con di-8-ANEPPS utilizando la técnica CLFFM. El potencial de acción fue más lento en el endocardio, particularmente en la fase uno.
La duración del potencial de acción se describió como el tiempo que tarda el potencial de acción en repolarizarse hasta cierto punto. Cuando las duraciones se normalizaron y se desplazaron para superponerse en la fase cero, se pudieron comparar. De hecho, hubo una diferencia significativa durante la primera fase.
A continuación, se utilizó Rhod-2 AM para monitorizar el calcio intracelular. Con el fin de comparar las diferencias regionales en el calcio intracelular, se evaluó la cinética de la transitoriedad del calcio. En comparación, el tiempo hasta el pico de la fugacidad fue aproximadamente dos milisegundos más largo en el endocardio.
En general, la transitoriedad del calcio desde el endocardio tuvo una cinética significativamente más lenta que el epicardio. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para registrar la transitoriedad y los potenciales de acción del calcio intracelular en regiones de difícil acceso en el corazón. La parte de Langendorff de la configuración hace que sea muy práctico perfundir diferentes productos químicos en el corazón y evaluar los efectos sobre las propiedades cardíacas.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este artículo presenta una técnica de microscopía de fluorescencia de campo local para medir los niveles de calcio intracelular y los potenciales de membrana en el corazón. Este método permite investigar la función cardíaca en órganos intactos, lo cual es fundamental para comprender afecciones como el paro cardíaco y la isquemia.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Fisiología cardiovascular
- Microscopía de fluorescencia
- Técnicas de imagen celular
Antecedentes
- Comprender la función cardíaca es esencial para abordar las enfermedades del corazón.
- Los métodos tradicionales pueden no acceder eficazmente a todas las regiones del corazón.
- La microscopía de fluorescencia de campo local ofrece un enfoque novedoso para estudiar las células cardíacas.
- Esta técnica mantiene la integridad del acoplamiento celular en el corazón.
Objetivo del estudio
- Medir el calcio intracelular y los potenciales de membrana en el corazón.
- Explorar los mecanismos de la función cardíaca bajo condiciones patológicas.
- Proporcionar información sobre eventos cardiovasculares como el paro cardíaco y la isquemia.
Métodos Utilizados
- Preparación del aparato Langendorff horizontal.
- Carga de la solución de Tyrode en las jeringas.
- Eliminación de burbujas de aire del sistema.
- Uso de sondas moleculares para las mediciones.
Resultados principales
- Medición exitosa de variables celulares en corazones intactos.
- Demuestra la eficacia de la técnica para acceder a regiones de difícil alcance.
- Información obtenida sobre las propiedades eléctricas y mecánicas de las células cardíacas.
- Aplicaciones potenciales en la comprensión de las patologías cardíacas.
Conclusiones
- La técnica de microscopía de fluorescencia de campo local es valiosa para la investigación cardíaca.
- Este método mejora nuestra comprensión del funcionamiento del corazón en la salud y la enfermedad.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para obtener mayores conocimientos sobre la salud cardiovascular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía de fluorescencia de campo local permite la medición del calcio intracelular y los potenciales de membrana en corazones intactos, preservando el acoplamiento celular esencial para comprender la isquemia y las arritmias. Este enfoque apoya la validación de objetivos al proporcionar datos fisiológicamente relevantes de tejido acoplado eléctrica y mecánicamente, mejorando la confianza predictiva en modelos preclínicos. La técnica facilita la reducción de riesgos mecanicistas al vincular señales moleculares con la función del órgano completo en la investigación de enfermedades cardiovasculares.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la medición de transitorios de calcio y potenciales de acción en miocardio intacto bajo acoplamiento fisiológico.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas en sistemas relevantes para la enfermedad donde los modelos de células aisladas no logran capturar la dinámica a nivel tisular.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al identificar compuestos que normalizan la cinética del calcio intracelular en regiones endocárdicas y epicárdicas.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Preparación para el ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para pruebas posteriores mediante el establecimiento de señales de fluorescencia basales en corazones perfundidos.
- Salida cuantitativa: Genera mediciones reproducibles de la cinética de los transitorios de calcio y de la duración del potencial de acción para la evaluación del efecto de compuestos.
- Reutilización de la plataforma: Permite la escalabilidad en modelos de roedores mediante la perfusión Langendorff, posibilitando la adquisición consistente de señales en cascadas de cribado cardiovascular.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela mecanismos de isquemia y arritmia mediante el monitoreo de diferencias regionales en el manejo del calcio y la repolarización en corazones intactos.
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al mantener el acoplamiento electrotonico y metabólico durante la intervención farmacológica.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Orienta los criterios de avance mediante cambios cuantificables en la morfología del potencial de acción y en la transitoriedad del calcio en tejido enfermo frente al tratado.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento cardiovascular, desde la interrogación inicial del blanco hasta la validación preclínica, y apoya la identificación de compuestos activos al proporcionar datos de señalización contextualizados fisiológicamente.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la medición del calcio específico por compartimentos (citoplasmático frente al retículo sarcoplasmático) y del potencial de membrana en tejido intacto.
- Selección: Proporciona preparaciones listas para ensayos con lecturas de fluorescencia estables para evaluar los efectos de compuestos sobre la electrofisiología cardíaca y el manejo del calcio.
- Análisis: Ofrece variables dependientes cuantitativas, incluyendo el tiempo hasta el pico de transitoriedad de calcio, la duración del potencial de acción y métricas de repolarización por fase, para comparaciones entre grupos.
- Investigación Traducional: Conecta mediciones moleculares con la función del órgano completo, permitiendo la alineación de biomarcadores en modelos preclínicos de disfunción cardíaca.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar la toxicidad cardiovascular en distintas áreas terapéuticas mediante detección de fluorescencia estandarizada basada en Langendorff.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al correlacionar señales subcelulares con la fisiología intacta del órgano en modelos de enfermedades cardiovasculares.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante la carga estandarizada de colorantes, la perfusión y la colocación de fibras ópticas en el sistema Langendorff.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o descarte al identificar tempranamente deficiencias en la actividad electrofisiológica y en el manejo del calcio antes del fracaso costoso en etapas avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en la cinética normalizada del potencial de acción y de los transitorios de calcio en corazones enfermos frente a corazones rescatados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección cardíaca, perfusión Langendorff y preparación de colorantes fluorescentes (por ejemplo, Rhod-2 AM, di-8-ANEPPS).
- Depende de un sistema de microscopía de fibra óptica, generadores de ondas para estimulación y sistemas de adquisición de alta frecuencia (10 kHz).
- Necesita una estandarización transversal entre los equipos de fisiología, imagen y farmacología para garantizar la consistencia de las señales.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes especies (ratón, periquito) y regiones ventriculares (epicardio, endocardio) al medir gradientes transmurales.
- Está limitado por la eficiencia de carga del colorante y los artefactos de movimiento durante la perfusión, que deben controlarse para evitar isquemia o corrupción de la señal.
