El campo local microscopía de fluorescencia: Imágenes señales celulares en los corazones intactos

El objetivo general de esta técnica de imagen de microscopía de fluorescencia de campo local es utilizar sondas moleculares para medir los niveles de calcio intracelular, o potenciales de membrana de regiones cardíacas de difícil acceso a nivel de todo el corazón. Este método puede ayudarnos a responder preguntas cardiovasculares clave relacionadas con el paro cardíaco y la isquemia. La principal ventaja de esta técnica es que las propiedades cardíacas se miden a partir de eventos celulares en el órgano intacto donde las células continúan acopladas eléctrica, mecánica y metabólicamente.

Primero, prepare el aparato Langendorff horizontal. Cargue la solución Tyrode recién preparada en las jeringas de 60 mililitros y agregue todos los tubos asociados de la configuración. Una vez lleno, elimina todas las burbujas de aire.

A continuación, equilibre la solución cargada con gas oxígeno puro suministrado por una piedra difusora de plástico sumergida. A continuación, coloque una sutura quirúrgica no absorbible alrededor de una aguja. Esto servirá como una cánula para retroperfundir el corazón cuando esté conectado al aparato.

A continuación, se recoge el corazón después de inyectar heparina y eutanasia al animal. Primero, limpie el cofre con etanol. La demostración es con un ratón, pero el mismo procedimiento funciona para la recolección del corazón del periquito.

A continuación, con unas tijeras de disección, haz una incisión en la parte inferior del abdomen y luego corta los lados hacia el cuello. Luego, corte con cuidado el diafragma, evitando el corazón. Ahora, retira el tejido cortado y sujétalo con alfileres.

A continuación, extraiga los pulmones y los tejidos circundantes para exponer el corazón. Una vez expuesto, use pinzas para sacar el corazón sin apretarlo. Sepárelo del animal cortando la aorta y deje la mayor cantidad posible de aorta unida al corazón.

Luego, cargue el corazón en un pequeño bote de pesaje con un mililitro de solución de Tyrode. Bajo un microscopio de disección, extraiga rápidamente la sangre y el tejido graso que rodea el corazón con pinzas y tijeras. Con una sutura quirúrgica no reabsorbible y una aguja, fije la aorta a la conexión horizontal del aparato de Langendorff.

Asegura el nudo con dos pinzas finas. A continuación, comience la retroperfusión abriendo la válvula para liberar la solución de Tyrode. Limpie el tejido circundante y succione los residuos para mantener limpia la cámara horizontal mientras el corazón se estabiliza durante 10 minutos.

Haz que el tinte sea fresco. Para Rhod-2 AM, agregue 20 microlitros de 20% Pluronic y DMSO al paquete de tinte de 50 microgramos del fabricante. Mezclar por pipeteo, evitando burbujas.

Luego, transfiera el tinte licuado a un frasco de vidrio transparente y agregue un mililitro de solución de Tyrode. Disuelve completamente el tinte en esta mezcla utilizando de 15 a 20 minutos de sonicación. A continuación, perfunda el tinte preparado con una bomba peristáltica a temperatura ambiente.

Primero, cargue el tinte en la cámara de tinte y luego, sujete todas las líneas de tubos conectadas al colector y mantenga las abrazaderas por encima del colector para evitar el reflujo. A continuación, encienda la bomba y cierre inmediatamente la válvula de tres vías debajo de la jeringa de 60 mililitros. Coloque el pequeño tubo conectado al extremo de succión de la bomba junto al corazón para recircular el tinte después de que se haya perfundido.

Tome una aguja de calibre pequeño y aplíquela a través del ápice para aliviar la presión. Luego, deja que el corazón se impregne con el tinte durante 30 minutos. Durante este tiempo, es muy importante evaluar el nivel del tinte para que no entren burbujas en el tejido, lo que causaría isquemia y daño tisular.

Después de perfundir el tinte, retroperfunde el corazón con la solución Tyrode. Retire la abrazadera sobre el colector. Abra la válvula y luego deje que el corazón se estabilice durante 10 minutos.

Durante la retroperfusión, llene la cámara horizontal con solución Tyrode y encienda la unidad Peltier para llevar la temperatura del baño a 37 grados centígrados. Para preparar la luz de fibra óptica para el experimento, primero coloque la fibra óptica dentro de una pipeta de dos mililitros. Y, a continuación, conecte la pipeta a un micromanipulador.

Utilice el micromanipulador para presionar ligeramente la fibra óptica contra la superficie del ventrículo lateral. A continuación, programe un generador de ondas para que proporcione un pulso cuadrado con un ancho de un milisegundo. Y configure un estimulador cardíaco para que se sincronice externamente y se conecte al generador de ondas.

En cada una de las dos salidas del estimulador, conecte un cable con una aguja de acupuntura soldada en el extremo. Coloque dos agujas de acupuntura en el ápice del corazón, a unos tres milímetros de distancia. Solo una vez colocadas las agujas, se pone en marcha el estimulador, evitando así descargas accidentales.

Ahora, para registrar la señal epicárdica, ajuste la frecuencia de adquisición en el software a 10 kilohercios. Para recoger la señal endocárdica, siga el mismo procedimiento, pero use una aguja de calibre 23 para hacer un orificio en el ventrículo lateral cerca del tabique. Y luego, usando un micromanipulador, coloque la segunda fibra óptica en el endocardio.

Para acceder a la función transmural se comparó la morfología de los potenciales de acción registrados desde el endocardio y el epicardio. Los registros de fluorescencia se realizaron después de tratar el corazón con di-8-ANEPPS utilizando la técnica CLFFM. El potencial de acción fue más lento en el endocardio, particularmente en la fase uno.

La duración del potencial de acción se describió como el tiempo que tarda el potencial de acción en repolarizarse hasta cierto punto. Cuando las duraciones se normalizaron y se desplazaron para superponerse en la fase cero, se pudieron comparar. De hecho, hubo una diferencia significativa durante la primera fase.

A continuación, se utilizó Rhod-2 AM para monitorizar el calcio intracelular. Con el fin de comparar las diferencias regionales en el calcio intracelular, se evaluó la cinética de la transitoriedad del calcio. En comparación, el tiempo hasta el pico de la fugacidad fue aproximadamente dos milisegundos más largo en el endocardio.

En general, la transitoriedad del calcio desde el endocardio tuvo una cinética significativamente más lenta que el epicardio. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para registrar la transitoriedad y los potenciales de acción del calcio intracelular en regiones de difícil acceso en el corazón. La parte de Langendorff de la configuración hace que sea muy práctico perfundir diferentes productos químicos en el corazón y evaluar los efectos sobre las propiedades cardíacas.