Visualización Cuantitativa del Infiltrado de Leucocitos en un Modelo Murino de Miocarditis Fulminante por Microscopía de Hoja Ligera

El objetivo general de este protocolo es limpiar químicamente el corazón de un ratón, con una arritmia cardíaca inducida para la visualización de todo el órgano del infiltrado cardíaco leucocitario mediante microscopía de lámina de luz fluorescente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de órganos enteros sobre prótesis y estructuras a nivel de resolución celular. La principal ventaja de esta técnica es que permite tanto la cuantificación como la localización de la inflamación en órganos enteros.

Dar detalles sobre la prótesis neurológica. Tuvimos la idea de este método cuando necesitábamos urgentemente una herramienta de visualización para identificar las explicaciones celulares de la arritmia cardíaca en el módulo de depleción. Después de la exposición del corazón de un ratón de ocho a 10 semanas de edad, use un catéter de calibre 21 y penetre el ventrículo derecho.

Incidir la aorta para permitir el drenaje de la sangre y luego perfundir con cinco mililitros de PBS más EDTA, con una presión lenta y constante. Siga el PBS EDTA con cinco mililitros de paraformaldehído al 4%. Al final de la perfusión, use pinzas dentadas para agarrar suavemente el corazón fijo y tire del órgano ligeramente hacia arriba para cortar todas las conexiones de tejido.

Incluyendo las arterias y venas entrantes y salientes. Luego, almacene el corazón durante cuatro horas en PFA fresco al 4% para una mayor fijación. Para deshidratar el tejido, incubar el corazón en una serie ascendente de etanol, en tubos de reacción de polipropileno negro de cinco mililitros en la oscuridad, con rotación lenta constante en un rotador de tubos, para evitar la formación de burbujas de aire.

A continuación, limpie el tejido con una incubación de éter dibencílico al 98% con rotación constante durante la noche. Para realizar la microscopía de fluorescencia de lámina de luz, primero coloque los bloques de agarosa deshidratada en el soporte de muestra estándar, para mantener la muestra en su lugar. A continuación, transfiera la muestra al portamuestras.

A continuación, transfiera el portamuestras a una cubeta llena de éter de dibencilo del tamaño adecuado. Utilice los ajustes adecuados de filtro de excitación y emisión para detectar las señales de fluorescencia de interés. Por lo tanto, el posicionamiento y la fijación correctos de la muestra son fundamentales para minimizar los efectos de sombreado durante la obtención de imágenes.

Además, un espécimen suelto puede hacer que los artefactos se muevan, que son difíciles de iluminar durante el posprocesamiento. Después de requerir todas las imágenes, abra el software de análisis de procesamiento de imágenes 3D y 4D adecuado y seleccione superar. Elija archivo y abrir, y seleccione la carpeta que contiene los datos del primer canal adquirido para abrir las pilas de imágenes.

Seleccione editar y agregar canales para agregar los datos de canal fluorescente adquiridos adecuados. A continuación, haga clic en editar y seleccione las propiedades de la imagen para corregir las dimensiones del vóxel x, y y z. Ajuste de los parámetros en la ventana recién abierta.

Para ajustar las señales fluorescentes, primero abra el menú de edición y seleccione, mostrar ajuste de pantalla. Una nueva ventana muestra todos los canales abiertos. Para cambiar el canal de autofluorescencia a escala de grises, seleccione el canal de autofluorescencia, elija el estilo de pantalla blanco y haga clic en Aceptar.

A continuación, ajuste la vista eliminando la cuadrícula. A continuación, acérquese y anule la selección de un canal. A continuación, ajuste el valor del nivel de negro para excluir cualquier señal de fondo no deseada que no represente las estructuras de la muestra, la intensidad de la señal y el contraste.

Ajuste el canal estacionario del anticuerpo en relación con la señal del canal de autofluorescencia revisada. Al configurar el modo de canal, active para establecer la visualización de la señal de anticuerpos en una tabla de búsqueda de colores de mapa de calor. A continuación, seleccione el modo de fusión para visualizar las estructuras de los tejidos en detalle.

Para abrir virtualmente el órgano, antes de la exportación de la escena 3D, seleccione el icono de plano de recorte en la lista de objetos. Aparecerá un marco amarillo y un manipulador de husillo blanco en la vista de la imagen. Utilice el ratón para girar el husillo en el extremo más delgado, para cambiar la orientación del plano de recorte y mueva la parte central más gruesa del husillo para seleccionar la profundidad de recorte deseada.

A continuación, desmarque las casillas de verificación correspondientes para ocultar el marco y el manipulador y crear las instantáneas deseadas. La adquisición de una pila de imágenes completa, compuesta por dos señales de canales fluorescentes, provoca una representación artificial en 3D, en la que la distribución de leucocitos se muestra en una vista de mapa de calor. Las áreas fuertemente inflamadas del corazón de un animal tratado con toxina diftérica se pueden percibir por su apariencia rojiza y blanquecina.

Particularmente en las regiones del sistema de conducción cardíaca, como el haz ventricular auricular y las fibras de Purkinje. Por el contrario, los corazones de los animales tratados con PBS controlados no muestran este patrón de inflamación. Una vez dominada, esta técnica permite el análisis digital de un órgano diana, desde su extracción hasta su rendificación asistida por ordenador en cuatro o cinco días.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la emmenología exploraran los patrones de distribución celular en órganos completos de ratón. Esto puede envejecer en el análisis y el tratamiento de una variedad de prótesis de enfermedades fisiopatológicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar órganos de ratón completos para la microscopía de lámina de luz fluorescente y cómo generar y procesar pilas de datos 3D.