Definido y escalable Generación de células hepatocitos como las de las células madre pluripotentes
2 de marzo de 2017
El método presentado aquí describe un sistema de diferenciación -ready prácticas de fabricación escalable y bueno (GMP) para generar células hepatocitos como las humanas a partir de células madre pluripotentes. Sirve como un sistema rentable y estandarizado para generar células hepatocitos humanos para la investigación, como el hígado humano básico y aplicado.
El objetivo general de este protocolo es producir células similares a los hepatocitos humanos a partir de células madre pluripotentes utilizando matrices de laminina recombinantes en condiciones definidas. Este método permite al usuario personalizar hepatocitos humanos funcionales para estudiar la biología del hígado en la placa. La principal ventaja de esta técnica es que su naturaleza definida permite la producción masiva de hepatocitos con un alto grado de reproducibilidad experimental. Para comenzar el experimento, descongele 100 microgramos por mililitro de laminina-521 recombinante, o LN-521, a cuatro grados Celsius.Diluya el LN-521 descongelado en 1xDBPS helado con calcio y magnesio para hacer una solución de cinco microgramos por mililitro. Agregue un mililitro de la solución de LN-521 de cinco microgramos por mililitro para cubrir un pocillo de una placa de seis pocillos, y balancee la placa para esparcirla uniformemente en el pocillo. A continuación, incube las placas en una incubadora de cultivo celular de 37 grados Celsius al 5% de CO2 durante al menos dos horas para uso urgente. Lleve la placa recubierta de la incubadora a la campana de cultivo de tejidos. Aspire cuidadosamente la solución de recubrimiento LN-521 sin dañar la superficie recubierta. A continuación, añada inmediatamente un mililitro de mTeSR precalentado
Descripción general
Este protocolo describe un método para generar células similares a hepatocitos humanos a partir de células madre pluripotentes utilizando matrices de laminina recombinante. Proporciona un sistema escalable y listo para la fabricación conforme a las Buenas Prácticas de Manufactura (GMP) para producir hepatocitos funcionales destinados a la investigación hepática.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Diferenciación celular
- Biología de células madre
- Investigación hepática
Antecedentes
- Las células similares a hepatocitos humanos son fundamentales para estudiar la biología hepática.
- Las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en diversos tipos celulares.
- Las matrices de laminina recombinante favorecen la adhesión y el crecimiento celular.
- Los métodos estandarizados mejoran la reproducibilidad en la investigación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rentable para producir células similares a hepatocitos.
- Permitir la producción masiva de hepatocitos funcionales.
- Facilitar la investigación en biología hepática y modelado de enfermedades.
Métodos Utilizados
- Descongelación y dilución de laminina recombinante-521.
- Recubrimiento de placas de cultivo celular con solución de laminina.
- Incubación de las placas para favorecer la adhesión celular.
- Añadir mTeSR precalentado para el cultivo celular.
Resultados principales
- Generación exitosa de células similares a hepatocitos humanos.
- Alta reproducibilidad en la producción de células.
- Características funcionales de las células similares a hepatocitos confirmadas.
- Sistema escalable adecuado para diversas aplicaciones de investigación.
Conclusiones
- El método proporciona un enfoque confiable para la producción de hepatocitos.
- Apoya tanto la investigación básica como la aplicada del hígado.
- Estudios futuros pueden aprovechar este sistema para pruebas de fármacos y modelado de enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los sistemas de diferenciación definidos reducen la variabilidad entre lotes en la producción de células similares a hepatocitos, mejorando la reproducibilidad de los modelos hepáticos preclínicos. Los procesos escalables y compatibles con las buenas prácticas de fabricación (GMP) permiten un suministro constante para pruebas de metabolismo y toxicidad de fármacos. Esto aborda un cuello de botella clave en la traducción de hepatocitos derivados de células madre a aplicaciones industriales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de vías hepáticas utilizando modelos celulares escalables y fisiológicamente relevantes.
- Valor operativo: Las matrices definidas de laminina minimizan la variabilidad, mejorando la consistencia del ensayo entre experimentos.
- Valor predictivo: La alta reproducibilidad respalda estudios confiables de interacción con el blanco y del mecanismo de acción.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Produce células similares a hepatocitos con función metabólica estable para la selección de compuestos.
- Valor operativo: Condiciones definidas libres de suero permiten la estandarización entre laboratorios y sitios de producción.
- Escalabilidad: Compatible con líneas de CEP humanas para investigación y con fines GMP, para un suministro escalable de células.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Las células exhiben un fenotipo y función similares a los hepatocitos primarios, mejorando la fidelidad del modelo de enfermedad.
- Valor operativo: El sistema definido reduce la variación entre lotes, apoyando estudios para habilitar el inicio de ensayos clínicos (IND).
- Continuidad traslacional: Conecta la diferenciación de células madre con la validación preclínica de terapéuticos dirigidos al hígado.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad de descubrimiento a preclínico al proporcionar una fuente escalable de hepatocitos funcionales para aplicaciones posteriores.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis en biología hepática mediante una diferenciación definida y reproducible.
- Selección: Permite la producción estandarizada de células similares a hepatocitos para la evaluación consistente de compuestos.
- Análisis: Genera resultados funcionales cuantificables (por ejemplo, albúmina, urea) para el análisis comparativo de condiciones.
- Investigación Traducional: Proporciona continuidad desde la diferenciación hasta modelos preclínicos de enfermedades hepáticas y respuesta a fármacos.
- Reutilización Empresarial: Una plataforma definida y escalable facilita la reutilización entre proyectos y sitios, reduciendo la carga de reoptimización.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: La confianza predictiva en la función de los hepatocitos reduce la ambigüedad mecanicista en los ensayos relacionados con el hígado.
- Valor operativo: Los componentes definidos y el proceso libre de suero mejoran la reproducibilidad y la escalabilidad.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más acertadas de avance/no avance al reducir la variabilidad biológica en los datos preclínicos.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de candidatos dirigidos al hígado mediante sistemas de modelos confiables.
Consideraciones de Implementación
- Experiencia en cultivo de células madre y protocolos de diferenciación.
- Acceso a matrices de laminina recombinante y medios de diferenciación definidos.
- Normalización de procedimientos de recubrimiento e incubación entre equipos.
- Consideraciones de adaptación para diferentes líneas de hPSC y formatos de ampliación.
- Las limitaciones incluyen la maduración funcional en comparación con los hepatocitos primarios, como se indica en la fuente.
