Name: Técnicas para inducir la senescencia celular y cuantificar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprenda a inducir y cuantificar senescencia celular mediante marcadores específicos en cultivos de fibroblastos humanos. Estas técnicas permiten estudiar los factores biológicos que regulan el envejecimiento celular y organismal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudio fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional sobre el Envejecimiento. Los autores desean agradecer a Myriam Gorospe y Kotb Abdelmohsen útil para muchos debates sobre la senescencia y Kotb Abdelmohsen para también la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos también a los miembros de nuestro laboratorio, especialmente Douglas Dluzen para la lectura crítica del manuscrito.

<ol><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+when+bad+things+happen+to+good+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).</li>
<li>Dimri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Pospelova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudo-DNA+damage+response+in+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Pseudo-DNA damage response in senescent cells.</a> Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).</li>
<li>Narita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb-mediated+heterochromatin+formation+and+silencing+of+E2F+target+genes+during+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence.</a> Cell. 113 (6), 703-716 (2003).</li>
<li>Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signals+and+pathways+activating+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The signals and pathways activating cellular senescence.</a> Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%2C+tumor+suppression%2C+and+organismal+aging%3A+good+citizens%2C+bad+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors.</a> Cell. 120 (4), 513-522 (2005).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Tominaga-Yamanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+coordinately+represses+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype.</a> Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunction+Induces+Senescence+with+a+Distinct+Secretory+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype.</a> Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Hoare, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOTCH1+mediates+a+switch+between+two+distinct+secretomes+during+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence.</a> Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).</li>
<li>Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+senescence-associated+secretory+phenotype+%28SASP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP).</a> Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).</li>
<li>Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+microRNAs%3A+individual+gene+repressors%2C+global+translation+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers.</a> Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).</li>
<li>Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+control+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA control of cellular senescence.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).</li>
<li>Bhaumik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-146a%2Fb+negatively+modulate+the+senescence-associated+inflammatory+mediators+IL-6+and+IL-8%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8.</a> Aging. 1 (4), 402-411 (2009).</li>
<li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-SCARS%3A+distinct+nuclear+structures+that+sustain+damage-induced+senescence+growth+arrest+and+inflammatory+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion.</a> J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).</li>
<li>Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cell+and+organ+senescence+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Assessing cell and organ senescence biomarkers.</a> Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Rubio, M. A., Kim, S. -H., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Manipulation+of+Telomerase+Expression+and+Telomere+Length%3A+implications+for+the+ionizing+radiation+response+and+replicative+senescence+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells.</a> J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).</li>
<li>Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Senescent+Phenotype+from+Telomere+Shortening+in+Hydrogen+Peroxide-Treated+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts.</a> Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Cell+Senescence+in+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li>
<li>Nyunoya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+Smoke+Induces+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence.</a> J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).</li>
<li>Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Transforming+Growth+Factor-%CE%B2+Signaling+Delays+Cellular+Senescence+and+Preserves+the+Function+of+Endothelial+Cells+Derived+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells Transl Med. , (2016).</li>
<li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+induces+senescence+in+hepatocellular+carcinoma+cells+and+inhibits+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth.</a> Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).</li>
<li>Aird, K. M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+senescence-associated+heterochromatin+foci+%28SAHF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF).</a> Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).</li>
<li>Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+approach+for+monitoring+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An integrated approach for monitoring cell senescence.</a> Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+oncogene-induced+DNA+damage+response+and+heterochromatin+in+senescence+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer.</a> Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).</li>
<li>Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+cellular+senescence%3A+implications+for+immortalization+of+normal+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts.</a> Mol Cell Biol. 9 (7), 3088-3092 (1989).</li>
<li>Bursuker, I., Rhodes, J. M., Goldman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase--an+indicator+of+the+maturational+stage+of+mouse+and+human+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase--an indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes.</a> J Cell Physiol. 112 (3), 385-390 (1982).</li>
<li>Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase+staining+on+bone+marrow.+The+osteoclast+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall.</a> Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).</li>
<li>Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning+of+p16%28ink4a%29+expression+in+tumors%3A+functional+significance%2C+clinical+associations+and+future+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments.</a> Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Essential+Role+for+Senescent+Cells+in+Optimal+Wound+Healing+through+Secretion+of+PDGF-AA%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li>
<li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin-mediated+increase+in+DICER1+regulates+microRNA+expression+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence.</a> Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).</li>
<li>Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+as+a+Tool+to+Target+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin as a Tool to Target Aging.</a> Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).</li>
<li>Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin%3A+from+mechanisms+of+action+to+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin: from mechanisms of action to therapies.</a> Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).</li>
<li>Cahu, J., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+to+quantify+senescent+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A sensitive method to quantify senescent cancer cells.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+detection+of+senescence-associated+beta+galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase.</a> Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).</li>
<li>Redon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+detection+in+peripheral+blood+lymphocytes%2C+splenocytes%2C+bone+marrow%2C+xenografts%2C+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin.</a> Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Kennedy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+mouse+cells+fail+to+overtly+regulate+the+HIRA+histone+chaperone+and+do+not+form+robust+Senescence+Associated+Heterochromatin+Foci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci.</a> Cell Div. 5, 16(2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, hemos descrito métodos para replicativa y daño de ADN inducido por senescencia utilizando fibroblastos diploides humanos. Además, las técnicas para la cuantificación de proteínas y niveles de ARNm de varias proteínas de la senescencia asociado se incluyen, así como tinción para SA-β-gal y para el marcador de daño de ADN γ-H2AX. Estos protocolos pueden ser ampliamente utilizados para evaluar fenotipos senescentes tanto in vitro como in vivo, aunque existen muchas advertencias para la caracterizaci...

Hace más de medio siglo, Hayflick y sus colegas describen cómo las células no transformadas proliferen en cultivo, pero sólo durante un periodo finito de tiempo 1. el cultivo a largo plazo de fibroblastos humanos hizo que las células para detener la proliferación; sin embargo, eran metabólicamente activa, y esto fue llamado senescencia celular. La senescencia puede ser beneficioso para la inhibición de la tumorigénesis, pero también puede ser perjudicial, ya que se cree que contribuyen a la pérdida de capacidad de regeneración que se produce con el envejecimiento 2, 3. Las células senescentes se han demostrado que se acumulan en los tejidos como humanos 4 edad y han sido implicados en una serie de procesos biológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, reparación de tejidos, y la inflamación 2 relacionada con la edad. passaging continua de las células en cultivo induce senescencia replicativa, que se ha relacionadoa telómero desgaste y la inestabilidad genómica. Diversas tensiones de células, incluyendo daño en el ADN y oncogenes, también pueden causar la senescencia 3. La senescencia causado por factores distintos de desgaste de los telómeros se llama a menudo inducida por el estrés o la senescencia prematura y generalmente depende de la INK4A p16 / Rb ruta de la 5. Aunque la proliferación, las células no transformadas aparecen típicamente husillo en forma, las células senescentes pueden ser identificados como que tiene ciertas características, incluyendo una, gran morfología plana y aumento de la actividad β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal) (Figuras 1 y 2). Las células senescentes también se acumulan marcadores de daño de ADN, incluyendo γ-H2AX (Figura 3) 6, y, potencialmente, asociada a la senescencia heterocromatina focos (SAHF) (Figura 4) 7. Las células senescentes tienen mayores niveles de los reguladores del ciclo celular, incluyendo p<html> 16 (INK4A p16) y / o p21 y p53 (Figura 5) 8, 9. Además, datos recientes han demostrado que las células senescentes pueden tener efectos no autónomos mediante la secreción de una serie de citocinas y quimiocinas pro-inflamatoria llamada la asociada a la senescencia secretora fenotipo (SASP) 10. Aunque este fenómeno SASP puede variar de tipo celular a tipo celular, en general, se demuestra por un aumento de la interleucina-6 (IL-6), IL-8, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), crecimiento- α regulado oncogén (GRO-α), y GRO-β, entre otros (Figura 6). El estrés o daño particular que induce la senescencia también pueden influir en el fenotipo secretor 11, 12, 13. SASP puede ser detectado mediante la medición de los niveles de proteínas secretadas utilizando ELISAs o matrices citoquina / proteínas = &quot;xref&quot;&gt; 10, 14. Aunque los mecanismos post-transcripcionales pueden regular los niveles de proteína SASP 11, 15, 16, 17, los cambios en los niveles de mRNA también pueden detectarse en muchos casos. Estos cambios son generalmente más sensibles y más fácil de cuantificar que las mediciones de nivel de proteínas. Otros marcadores senescentes también pueden ser evaluados, incluyendo persistente daño en el ADN focos nucleares, denominados segmentos de ADN con alteraciones de la cromatina de refuerzo senescencia (DNA-cicatrices) 18, y diversos otros marcadores 3, 19, 20. A continuación, describimos técnicas comunes para la inducción de la senescencia en células en cultivo y también para la medición de varios marcadores de senescencia, incluyendo SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, y la proteína y ARNm de senescenciamoléculas NCE-asociado.

<table><tbody><tr><td>16% Tris-glicina geles</td><td>Invitrogen</td><td>XP00160BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol ChCl3</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 568 cabra anticuerpo anti-ratón</td><td>Invitrogen</td><td>A11031</td><td>dilución 1:300</td></tr><tr><td>Elevadores celulares</td><td>Corning Inc.</td><td>3008</td><td>Raspador de células</td></tr><tr><td>ECL anti-ratón anticuerpo ligado a HRP</td><td>Amersham</td><td>NA931V</td><td></td></tr><tr><td>ECL Plus Western Blotting</td><td>Substrate Pierce</td><td>32132</td><td>ECL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sondas moleculares</td><td>MP01306</td><td>stock 5 mg/mL en dH2O</td></tr><tr><td>Anticuerpo GAPDH</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32233</td><td>1:1.000 - 5.000 dilución</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Histona H3 dimetil K9 anticuerpo monoclonal</td><td>Abcam</td><td>1220</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>IL-6 humano Quantikine ensayo ELISA</td><td>R& D systems</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>Humano IL-8 Quantikine ELISA ensayo</td><td>R& D systems</td><td>D8000C</td><td></td></tr><tr><td>Human GROa Quantikine ELISA ensayo</td><td>R& Sistemas D</td><td>DRG00</td><td></td></tr><tr><td>N-N-dimetilformamida&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td>DMF</td></tr><tr><td>p16 anticuerpo monoclonal</td><td>BD Biosciences</td><td>51-1325gr</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>anticuerpo monoclonal p21</td><td>Millipore</td><td>05-345</td><td>dilución 1:750</td></tr><tr><td>anticuerpo monoclonal p53</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>1:500 clon de dilución DO-1</td></tr><tr><td>phospho-H2AX (Ser139) FITC anticuerpo conjugado</td><td>Cell Signaling</td><td>9719</td><td>1:2.000 dilución</td></tr><tr><td>POWER mezcla maestra de PCR verde SYBR&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Marcadores de peso molecular preteñidos</td><td>Biorad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade&nbsp;</td><td>Membrana de PVDF Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Senescencia &beta;-galactosidasa Kit de tinción</td><td>Señalización celular</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion/Life Tech</td><td>10296028</td><td></td></tr></tbody></table>

técnicas para inducir la senescencia celular y cuantificar

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

En respuesta a estrés celular o daño, las células proliferantes pueden inducir un programa específico que inicia un estado de detención del ciclo celular a largo plazo, denominado senescencia celular. La acumulación de células senescentes se produce con el envejecimiento del organismo y por medio de cultivo continuo in vitro. Las células senescentes influyen en muchos procesos biológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la reparación de tejidos y la regeneración, la supresión de tumores, y el envejecimiento. Características de las células senescentes incluyen, pero no se limitan a, aumento de la actividad β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal); INK4a p16, p53, y p21 niveles; mayores niveles de daño del ADN, incluyendo γ-H2AX; la formación de asociada a senescencia heterocromatina Foci (SAHF); y la adquisición de un fenotipo secretor asociada a la senescencia (SASP), un fenómeno que se caracteriza por la secreción de una serie de citoquinas pro-inflamatorias y moléculas de señalización. A continuación, describimos los protocolos para ambos replicativa ysenescencia daño en el DNA inducida en células cultivadas. Además, destacamos técnicas para controlar el fenotipo senescente utilizando varios marcadores asociados con la senescencia, incluyendo SA-β-gal, γ-H2AX y tinción SAHF, y para cuantificar los niveles de proteína y ARNm de reguladores del ciclo celular y factores de SASP. Estos métodos se pueden aplicar a la evaluación de la senescencia en varios modelos y tejidos.

Las figuras 2 - 6 muestran resultados representativos de tinción SA-β-gal; tinción de γ-H2AX y SAHF; evaluación de los niveles de proteína de p16 INK4a, p21, y p53; y el ARNm y los niveles de proteína de moléculas-senescentes asociado. Aumento de la tinción SA-β-gal se produce con replicativa y daño en el DNA inducido por senescencia. También, observar los cambios morfológicos que se producen con la senescencia. Las células se agrandan y plana en comparación c...

La senescencia celular, el estado irreversible de la detención del ciclo celular, puede ser inducida por diferentes tipos de estrés celular. A continuación, describimos protocolos para inducir senescencia y métodos celular para evaluar marcadores de senescencia.

Técnicas para inducir la senescencia celular y cuantificar

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

El objetivo general de estas técnicas es proporcionar una caja de herramientas que permita la inducción, el seguimiento y la cuantificación de la senescencia celular. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave sobre la identificación y cuantificación de la senescencia celular y los factores biológicos que regulan el envejecimiento celular y de los organismos. La principal ventaja de estas técnicas es que abarcan una variedad de métodos para monitorear la senescencia celular en diferentes modelos, tejidos y tipos de células.Comience por colocar las células proliferativas de paso temprano de interés a una densidad dispersa en el plato apropiado para el análisis. Y cultive las células durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos. Cuando las células estén confluentes en un 50-60%, aspire el medio de crecimiento y lave las células con PBS dos veces.Después del segundo lavado, cubra las células con una capa delgada de PBS. Y exponer las células a una sola dosis de 10 grados de irradiación gamma. Reemplace el PBS con medio de crecimiento.Y devolver las células a la incubadora. Cambio del medio cada 48 a 72 horas con monitoreo diario de cambios morfológicos bajo un

techniques-to-induce-and-quantify-cellular-senescence

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Si senescencia previene o promueve la tumorigénesis sigue siendo controvertido. Como los fármacos quimioterapéuticos pueden inducir a las células cancerosas a la senescencia, el estudio de la senescencia es esencial para proponer nuevas terapias. Sin embargo, el ensayo de β-galactosidasa estándar y ampliamente utilizado presenta importantes inconvenientes. Proponemos aquí un ensayo de citometría basada rápido y sensible para cuantificar el flujo de la senescencia.

Un método sensible para cuantificar las células cancerosas senescentes

Aquí presentamos un protocolo detallado para detectar ambos senescentes y células madre pluripotentes en el músculo esquelético por lesión mientras que inducen reprogramación en vivo . Este método es adecuado para evaluar el papel de la senescencia celular durante la regeneración del tejido y la reprogramación en vivo.

Evaluación de la senescencia inducida por la lesión y en Vivo de reprogramación en el músculo esquelético

Aquí, discutimos una serie de protocolos para la inducción y validación de senescencia celular en células cultivadas. Nos enfocamos en diferentes estímulos de inducción de senescencia y describir la cuantificación de los marcadores comunes asociados a senescencia. Proporcionamos detalles técnicos utilizando fibroblastos como modelo, pero los protocolos se adaptan a varios modelos de celulares.

Inducción y validación de senescencia celular en las células humanas primarias

ROS intracelular se ha demostrado para desempeñar un papel importante en la inducción de senescencia celular. Aquí, describimos un análisis sensible para cuantificar los niveles ROS durante la senescencia celular. También ofrecemos protocolos para evaluar el fenotipo secretor asociados a senescencia, que supuestamente contribuye a diferentes disfunciones relacionadas con la edad.

Una medida cuantitativa de especies reactivas de oxígeno y senescencia asociada a fenotipo secretor en fibroblastos humanos normales durante la senescencia inducida por el oncogén

La senescencia celular es el factor clave en el desarrollo de patologías crónicas relacionadas con la edad. La identificación de las terapias que se dirigen a las células senescentes son prometedoras para extender el envejecimiento saludable. Aquí, presentamos un nuevo ensayo para la identificación de senoterapéuticos basado en la medición de la actividad de senescencia asociada a la galactosidasa en células individuales.

Ensayo de cribado basado en sA-Galactosidasa para la identificación de medicamentos senoterapéuticos

Este protocolo describe el flujo de trabajo para el etiquetado metabólico de células senescentes y no en división con SILAC pulsado, análisis de espectrometría de masas no dirigido y un cálculo simplificado de las vidas medias de las proteínas.

Medición de las tasas de recambio de proteínas en células cultivadas senescentes y no divisorias con etiquetado metabólico y espectrometría de masas

Aquí presentamos un método basado en citometría de flujo para la visualización y cuantificación de múltiples marcadores asociados a la senescencia en células individuales.

Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Se presenta un protocolo para la cuantificación citométrica de flujo fluorescente de células cancerosas senescentes inducidas por fármacos de quimioterapia en cultivo celular o en modelos tumorales murinos. Los procedimientos opcionales incluyen la co-inmunotinción, la fijación de muestras para facilitar el análisis de lotes grandes o puntos de tiempo, y el enriquecimiento de células senescentes viables mediante clasificación citométrica de flujo.

Sonda de β-galactosidasa asociada a senescencia fluorescente de color rojo lejano para la identificación y el enriquecimiento de células tumorales senescentes mediante citometría de flujo

La inmunofluorescencia multiplexada permite el marcado secuencial de múltiples marcadores de anticuerpos dentro de una sola sección tisular para apoyar el análisis espacial de la arquitectura tisular y las poblaciones celulares. Aquí se presenta un flujo de trabajo para la detección multiplex de marcadores estructurales, estructural e inmunitarios asociados a la senescencia, que incluye preparación manual y automatizada de portaobjetos, imágenes iterativas y análisis de células individuales...

Ensayo de inmunofluorescencia multiplexado para la evaluación espacial de marcadores de senescencia in vivo

Este artículo presenta un protocolo LysoTracker de células vivas para medir la remodelación lisosomal durante la senescencia en fibroblastos humanos IMR-90.

Perfilado lisosomal con LysoTracker para la evaluación cuantitativa de la senescencia celular en fibroblastos humanos

Este método estudia cómo los fibroblastos cutáneos senescentes afectan a los sanos. La senescencia se induce mediante la exposición a UVB, y el medio condicionado se aplica a fibroblastos normales. Ayuda a evaluar compuestos bioactivos que actúan en la comunicación alterada célula a célula en el envejecimiento cutáneo.

Novedosa combinación de antioxidantes para restaurar una comunicación intercelular saludable en un modelo in vitro utilizando un medio condicionado de células senescentes

Aprenda a inducir y cuantificar senescencia celular mediante marcadores específicos en cultivos de fibroblastos humanos. Estas técnicas permiten estudiar los factores biológicos que regulan el envejecimiento celular y organismal.

Técnicas para inducir la senescencia celular y cuantificar

Explorar más videos