Técnicas para inducir la senescencia celular y cuantificar

El objetivo general de estas técnicas es proporcionar una caja de herramientas que permita la inducción, el seguimiento y la cuantificación de la senescencia celular. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave sobre la identificación y cuantificación de la senescencia celular y los factores biológicos que regulan el envejecimiento celular y de los organismos. La principal ventaja de estas técnicas es que abarcan una variedad de métodos para monitorear la senescencia celular en diferentes modelos, tejidos y tipos de células.

Comience por colocar las células proliferativas de paso temprano de interés a una densidad dispersa en el plato apropiado para el análisis. Y cultive las células durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos. Cuando las células estén confluentes en un 50-60%, aspire el medio de crecimiento y lave las células con PBS dos veces.

Después del segundo lavado, cubra las células con una capa delgada de PBS. Y exponer las células a una sola dosis de 10 grados de irradiación gamma. Reemplace el PBS con medio de crecimiento.

Y devolver las células a la incubadora. Cambio del medio cada 48 a 72 horas con monitoreo diario de cambios morfológicos bajo un microscopio óptico. De siete a 10 días después de la irradiación, descongele todos los reactivos de un kit comercial de ensayo de beta-galactosidasa asociado a la senescencia en un baño de agua a 37 grados Celsius.

Cuando todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente, prepare las soluciones fijadoras y de tinción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Y lave suavemente cada pozo con PBS a temperatura ambiente. Tenga cuidado de enjuagar las células con cuidado, ya que las células de senescencia no se adhieren bien y se pueden eliminar fácilmente durante los lavados.

Fije las celdas de cada pocillo con un mililitro de solución fijadora por pocillo durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Seguido de dos lavados de dos mililitros con PBS por pocillo. A continuación, agregue un mililitro de solución de tinción de beta-galactosidasa a cada pocillo y cubra la placa con papel de aluminio para un cultivo de 24 a 48 horas en una incubadora a 37 grados Celsius sin dióxido de carbono.

Revise las celdas a las 24 horas. Cuando las células estén suficientemente teñidas, reemplace la solución de beta-gal con PBS fresco y examine los cultivos en un microscopio óptico con una cámara conectada a un objetivo de 10x o superior. Las células beta-galactosidasa asociadas a la senescencia aparecerán de color azul.

A continuación, obtenga al menos cinco imágenes que no se superpongan por pocillo. Y cuente manualmente el número total de células beta-galactosidasa positivas asociadas a la senescencia y el número total de células por imagen para calcular el porcentaje de células beta-galactosidasa asociadas a la senescencia por pocillo. 10 días después de la irradiación gamma, lavar las células tres veces con PBS.

Después del último lavado, reemplace el PBS con 2,5 mililitros de medio libre de suero, suplementado con antibióticos por plato de seis centímetros y devuelva las células a la incubadora de cultivo de tejidos durante la noche. A la mañana siguiente, transfiera el medio a un tubo cónico con hielo. Y lavar las celdas dos veces con PBS fresco.

A continuación, tripsinízate y cuenta las células. A continuación, centrifuga el sobrenadante recogido de la placa de cultivo celular. Y luego filtrarlo a través de un colador de jeringa de 0,45 micrómetros y congelar el medio en alícuotas de 500 microlitros a 80 grados centígrados hasta su análisis por ELISA.

El aumento de la senescencia asociado a la tinción de beta-gal se produce con senescencia replicativa e inducida por daños en el ADN. Obsérvese la forma plana agrandada de las células senescentes en comparación con la apariencia fusiforme de los fibroblastos en proliferación. En este experimento, se fijaron las células senescentes jóvenes o replicativas en proliferación, tal y como se describe en el protocolo escrito.

Y teñido con un anticuerpo contra un biomarcador de roturas de doble cadena de ADN y DAPI. Con un aumento aparente en el número de fosi de rotura de doble cadena de ADN observada en las células senescentes. El análisis de RT-qPCR de los factores del fenotipo secretor asociados a la senescencia revela que al menos algunos factores están regulados al alza después de la senescencia inducida por la irradiación gamma en fibroblastos diploides humanos de paso bajo a nivel de ARNm.

Lo que se confirma aún más mediante ELISA de los sobrenadantes de cultivo celular irradiados con rayos gamma. Una vez dominado, la inducción del daño en el ADN y la tinción de SA beta-gal se pueden completar en aproximadamente 30 minutos de tiempo de práctica. Los medios de condición para cuantificar los niveles de proteína SASP se pueden preparar en unos 30 minutos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que deben monitorearlos en los cambios morfológicos en los cultivos celulares antes de proceder a la cuantificación de marcadores senescentes. Después de su desarrollo, estas técnicas allanaron el camino para que los investigadores en los campos del envejecimiento y el cáncer exploraran la senescencia en una variedad de tejidos, cultivos celulares y organismos modelo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir, monitorear y cuantificar la senescencia celular.