Detección de ligandos estrogénica en productos de Cuidado Personal con una pantalla de estrógeno levadura optimizado para el laboratorio de enseñanza de pregrado

El objetivo general de este procedimiento es utilizar una prueba de detección de estrógeno de levadura para cuantificar los agonistas del receptor de estrógeno humano extraídos de los productos de cuidado personal. Este método puede ayudar a responder preguntas heits en el campo de la toxicología, la alteración endocrina y la ecofisiología porque detecta y cuantifica los estrógenos ambientales en el agua, los alimentos y los productos de cuidado personal. Las principales ventajas de esta técnica in vitro son que es barata y ampliamente utilizada y proporciona una excelente plataforma para la enseñanza de técnicas de laboratorio.

La detección de estrógenos ambientales es fundamental porque pueden cambiar la señalización hormonal, particularmente durante el desarrollo fetal y los períodos de transición fisiológica como la pubertad. Las partes más difíciles de este método son los cálculos y el análisis de datos, que hemos simplificado mediante el desarrollo de una aplicación fácil de usar. Además, el pipeteo preciso es esencial.

Este protocolo comienza con la fabricación de reactivos. Prepare los medios de glucosa y galactosa, los controles de vehículos de etanol al 50% y los estándares de estradiol que se utilizarán el primer día del ensayo, así como el tampón LacZ, el ditiotreitol y el carbonato de sodio para el segundo día. Esterilizar los medios de glucosa y galactosa mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros.

Se pueden probar hasta 23 productos de cuidado personal diferentes o PCP y controles de extracción por triplicado en una sola placa de 96 pocillos. Los PCP incluyen jabón, crema para el cabello, champú, protector solar, maquillaje, crema de afeitar y loción. A los efectos de la filmación, se prepararán muestras de solo ocho PCP.

Combine un gramo de cada muestra con 10 mililitros de etanol anhidro en un tubo cónico de 15 mililitros. Además, prepare un control de extracción negativo que consista en 11 mililitros de etanol anhidro en un tubo cónico de 15 mililitros. Homogeneizar el contenido de cada tubo cónico durante 30 minutos mediante una combinación de agitación manual y vórtice.

Centrifugar los tubos cónicos a la velocidad máxima permitida en una centrífuga de cubo durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante de cada tubo a través de un colador de celdas de 40 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Luego transfiera el contenido de cada tubo de 50 mililitros a un frasco de centelleo de vidrio.

Deje que el etanol se evapore por completo dejando los viales abiertos en una campana ventilada durante una semana. Proteja las muestras de secado de la luz para evitar la degradación de los componentes sensibles a la luz. Cuando las muestras estén secas, reconstituya cada muestra en un mililitro de etanol al 50% y luego en vórtice para homogeneizar.

Dos noches o aproximadamente 42 horas antes de preparar la prueba de detección de estrógenos de levadura o las placas YES, utilice una técnica estéril para subcultivar la levadura añadiendo 0,1 mililitros de cada cultivo de levadura activa a 10 mililitros de medios de glucosa esterilizados con filtro en un matraz Erlenmeyer estéril. Incubar a 30 grados centígrados y continuar incubando cultivos originales como cepas. Dos días después, en el primer día de la prueba YES, utilice una técnica estéril para diluir los cultivos de levadura en suspensión y filtrar los medios de galactosa esterilizados en un vaso de precipitados estéril.

Confirme la densidad óptica pipeteando 120 microlitros de cada muestra de levadura por triplicado junto con blancos de medios de galactosa por triplicado en una placa de poliestireno transparente. Utilice un espectrofotómetro de placas para verificar que el cultivo de levadura diluida tenga una densidad óptica neta de 0,065 más o menos 0,005 a una longitud de onda de 610 nanómetros. Determine el OD610 neto de la levadura restando el OD610 de los blancos de medios de galactosa.

Usando una pipeta repetida con una punta de jeringa estéril, agregue la suspensión de levadura diluida a los pocillos de una microplaca estéril de polipropileno de 96 pocillos de acuerdo con este diseño de placa. Durante el pipeteo, mantenga la levadura fuente suspendida agitando continuamente el vaso de precipitados o mezclándola con la pipeta. Por último, agregue 120 microlitros de medios de galactosa esterilizados con filtro a los pocillos H10 a H12, indicados en verde en el diseño de la placa, para que sirvan como controles de medios que tendrán en cuenta los absorbentes aportados solo por el medio.

Prepare placas separadas para cada combinación de cepa de levadura y sustrato calorimétrico que se analizará. A continuación, construya una curva estándar en cada placa por dilución en serie de acuerdo con el diseño de la placa. Utilice una pipeta de un solo canal con puntas estériles para agregar cinco microlitros de estradiol estándar a los pocillos A2, A2 y A3. Utilice una pipeta multicanal para mezclar el contenido de los pocillos mediante pipeteo y, a continuación, transfiera 205 microlitros de los pocillos A1 a A3 a los pocillos B1 a B3. Repita la transferencia de 205 microlitros a través de la fila G. Una vez completada la dilución en serie, deseche 205 microlitros de los pocillos G1 a G3.At final de este paso, todos los pocillos estándar deben contener 120 microlitros.

Agregue cinco microlitros de etanol al 50% a cada pozo de control del vehículo que contenga la suspensión de levadura, los pocillos H1, H2 y H3, indicados en azul en este diseño de placa. El siguiente paso es agregar triplicados de cinco microlitros de muestras o controles de extracción negativos a los pocillos que contienen la suspensión de levadura, indicados en púrpura en el diseño de la placa. Observe qué muestras o controles de extracción se colocan en qué pozos.

Para llevar un registro de qué pozos tienen muestras y cuáles no, comience con una caja nueva de puntas y use puntas de las mismas ubicaciones en la caja que las ubicaciones de los pozos correspondientes en la placa. Mezcle el contenido de los pozos de muestra, control de extracción y control de vehículos mediante pipeteo. Ajuste los volúmenes de estos pozos a 120 microlitros quitando 205 microlitros de cada uno.

Selle cada placa con una película porosa adhesiva estéril, etiquétela e incube a 30 grados centígrados durante 17 horas. Después de las 17 horas de incubación, retire las placas de la incubadora. Si los platos no se pueden procesar de inmediato, envuélvalos en una envoltura de plástico y refrigere los platos envueltos a cuatro grados centígrados durante seis días.

Cuando esté listo para procesar los platos, desenvuélvalos. Utilice una pipeta multicanal para mezclar el contenido de cada fila de pocillos y, a continuación, transfiera 50 microlitros de suspensión de levadura de cada pocillo al pocillo correspondiente de una microplaca de poliestireno transparente de 96 pocillos. Etiquete la nueva placa.

Para evitar la contaminación cruzada de los pocillos, utilice nuevas puntas de pipeta para cada pocillo, pero no es necesario que las puntas sean estériles. En una campana extractora, agregue 20 microlitros de un DTT molar a 20 mililitros de tampón LacZ descongelado a temperatura ambiente para obtener una concentración final de un DTT milimolar. Mezcle bien el tampón LacZ.

Usando un pipeteador de repetición, agregue 200 microlitros de tampón LacZ que contenga DTT y ONPG o CPRG a todos los pocillos de la placa de poliestireno, e inmediatamente mida y registre la densidad óptica a 610 nanómetros de todos los pocillos usando un lector de placas. Repita según sea necesario para platos adicionales. Cubra las placas con una tapa e incube a 30 grados centígrados durante los tiempos indicados.

Cuando se complete la incubación, retire las placas de la incubadora. Use un pipeteador repetido para agregar 100 microlitros de carbonato de sodio a cada pocillo para mantener la reacción de beta-galactosidasa. Mida y registre la densidad óptica a 405 nanómetros para ONPG o 574 nanómetros para CPRG de todos los pocillos utilizando un espectrofotómetro de placas.

El cálculo de los valores de LacZ se puede realizar mediante una aplicación automatizada que requiere la instalación de Java. Para comenzar, abra la aplicación automatizada LacZ descrita en el apéndice uno. Pegue las lecturas de densidad óptica a 405 nanómetros para ONPG o 574 nanómetros para CPRG de todos los pocillos utilizando un diseño de placa idéntico al que se muestra en la figura uno.

Introduzca la cantidad de tiempo y horas de incubación para que el ensayo produzca color y haga clic en Siguiente. Pegue las lecturas de densidad óptica a 610 nanómetros para todos los pocillos. Haga clic en Enviar para mostrar los resultados de LacZ.

Los resultados de LacZ se pueden copiar mediante comandos de teclado y pegar en una hoja de cálculo u otros archivos, según sea necesario. Comience este análisis abriendo la aplicación de análisis de datos de ensayo YES en línea. Cargue un archivo de datos CSV con el formato descrito en la primera pestaña.

Digitalice la curva patrón de estradiol en la segunda pestaña y estime los parámetros de regresión. Vea los resultados del modelo de regresión en la tercera pestaña y, a continuación, busque los valores del eje x interpolados correspondientes a los valores LacZ de las muestras de la cuarta pestaña. Haga clic en la quinta pestaña para ver los valores de equivalente de estrógeno o EEQ de las muestras.

Por último, estandarice los valores de EEQ a la masa de la muestra original como se describe en el protocolo de texto. Se muestran ejemplos de curvas estándar después de una incubación de 17 horas de levadura con 17 betaestradiol. Por las razones discutidas en el manuscrito, CPRG es a menudo una mejor opción de sustrato que ONPG.

De acuerdo con observaciones previas, los ensayos con ER Beta que expresa levadura fueron más de un orden de magnitud más sensibles que los ensayos con ER Alfa que expresan levadura. Por lo tanto, la actividad estrogénica se detectó con mayor frecuencia con la levadura que expresa beta del RE. Un objetivo adicional del estudio fue evaluar los tiempos de duración de la incubación que son compatibles con el horario de un curso de laboratorio de pregrado.

Cuando se introdujo un período de refrigeración de seis días después de la incubación de 17 horas, las curvas estándar de las placas refrigeradas fueron comparables a las de las placas no refrigeradas. Los errores estándar de los parámetros estimados utilizando modelos de regresión logística de cuatro parámetros fueron menores para las placas refrigeradas que para las placas no refrigeradas. Por lo tanto, refrigerar las placas durante seis días reduce el error y mejora la precisión de las estimaciones de EEQ.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos sesiones de tres a cuatro horas. Al intentar el procedimiento, es importante recordar emplear una técnica estéril para todos los pasos realizados antes del período de incubación de 17 horas, pipetear con cuidado y precisión, y seguir el diseño de la placa que se presenta en la figura uno. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos en animales in vivo, para investigar mecanismos adicionales de acción estrogénica y efectos en todo el organismo.

Después de su desarrollo, la prueba de detección de estrógenos en levadura se aceptó como una medida de bajo costo para medir ligandos estrogénicos en muestras ambientales como alimentos, tejidos vegetales y productos de cuidado personal. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar extracciones simples de productos de cuidado personal, cultivar levadura, preparar curvas de dilución estándar, ejecutar el ensayo YES en una placa de 96 pocillos y completar los cálculos asociados. Y no olvide que trabajar con estradiol puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y otros equipos de protección personal, así como garantizar la eliminación adecuada mientras se realiza este procedimiento.