Name: La levadura de alto rendimiento de la pantalla sobreexpresión plásmido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprende a realizar transformación de alto rendimiento en Saccharomyces cerevisiae usando un robot de manipulación líquida. Este método permite identificar modificadores genéticos de fenotipos relacionados con enfermedades neurodegenerativas humanas de forma escalable.

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Este trabajo fue apoyado por una beca del Centro de Investigación Packard para la ELA en la Universidad Johns Hopkins (ADG), Premio a la Innovación Nuevo un director de los NIH 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), el Premio de la Fundación Rita Allen Académico. ADG es una beca Pew en las ciencias biomédicas, con el apoyo de The Pew Charitable Trusts.

1. Los preparativos para la transformación de la levadura Este protocolo está diseñado para diez placas de 96 pozos, pero se puede escalar hacia arriba o hacia abajo según corresponda. Hemos encontrado que este protocolo no funciona bien desde hace más de veinte placas de 96 pozos por cada ronda de la transformación. El procedimiento de transformación completa (desde el paso I.3) tendrá una duración aproximada de ocho horas. <ol><li> Alícuota de 5 10μL de ADN plásmido (100 ng / l) de la biblioteca de la levadura FLEXGene ORF en cada pocillo de un fondo redondo de 96 pocillos con el manejador de RapidPlate Biorobot líquido. Lugar descubierto placas de 96 pozos en la campana de humos durante la noche banco limpio para secar. Hemos encontrado eficacia similar de transformación con el CEN y plásmidos 2μ levadura. </li><li> Inocular 200 ml de levadura peptona dextrosa (YPD) los medios de comunicación (10 g / L de extracto de levadura, peptona 20 g / L, 20 g / l de glucosa) con la cepa de la consulta en un matraz Erlenmeyer de 500 ml desconcertado. Incubar toda la noche a 30 ° C con agitación (200 rpm). Si es necesario, los medios de comunicación selectiva también se puede utilizar para estos cultivos iniciadores. </li><li> A la mañana siguiente, se diluye el esfuerzo de consulta a OD 600 = 0,1 en 2 litros de YPD. Agitar durante 4-6 horas a 30 ° C (200 rpm) hasta que el cultivo llegue a OD 600 = 0,8 hasta 1,0. Para un óptimo crecimiento, crecen dos culturas separadas 1L en un recipiente de 2,8 L desconcertado. Si es necesario, los medios de comunicación selectiva también se puede utilizar en lugar de YPD. </li></ol> 2. La levadura de transformación <ol><li> Las células por centrifugación de la cosecha. Llenar cuatro tubos cónicos desechables 225ml con levadura de cerveza y giran a 3.000 rpm (~ 1800 xg) durante 5 minutos en centrífuga de mesa (Eppendorf 5810R). Elimínese el líquido sobrenadante y repetir hasta que todas las células se cosechan. </li><li> Lavar las células en 200 ml de autoclave destilada H 2 O. Resuspender el sedimento celular por agitación o agitación. Combine las células en un tubo cónico de 225 ml. Giran a 3.000 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Preparar la solución 0.1MLiOAc/1XTE (0,1 M LiOAc, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 en agua destilada en autoclave). Lavar las células en 100 ml 0.1MLiOAc/1XTE. Giran a 3.000 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 70 ml 0,1 M LiOAc/1xTE. Agitar y / o vórtice de asegurar pellet es completamente resuspendido. </li><li> Incubar con agitación a 30 ° C durante 30 minutos (200 rpm). </li><li> Añadir β-mercaptoetanol 0,1 M a. Incubar con agitación a 30 ° C durante 30 minutos (200 rpm). Nota: Este paso puede omitirse si la utilización de cepas de levadura que son sensibles a los β-mercaptoetanol. Hemos encontrado que este paso no es esencial para la transformación exitosa, sin embargo, no mejora la eficiencia de transformación. </li><li> Hervir 2 ml de ADN de esperma de salmón sonicado (10mg/ml) durante 15 minutos, y luego se enfría en hielo. </li><li> Añadir 2 ml de ADN de esperma de salmón cocido a la mezcla de la célula. Precaución: puede formarse un precipitado con la adición de ADN de esperma de salmón a la mezcla de células. El uso de un Pipetman y 200 l punta, retire con cuidado cualquier precipitado que se forma debido a que esto puede interferir con la pipeta abajo. </li><li> 50μL alícuota de la mezcla de células en cada pocillo de la placa de 96 pocillos con el Rapidplate BioRobot (también puede utilizar una pipeta multicanal). No se mezclan. </li><li> Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitación. </li><li> Preparar 200 ml de 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160ml de 50% de PEG-3350, DMSO 20 ml, 20 ml LiOAc 1M). Preparar la solución inmediatamente antes de su uso. </li><li> Añadir 125μL de PEG / LioAc / DMSO a cada pocillo. Mezclar por aspiración y dispensación de suspensión de células en ocho ocasiones con RapidPlate. </li><li> Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitación. </li><li> Choque térmico de las células a 42 ° C durante 15 minutos en un incubador seco. No apile los platos. Nota: Hemos encontrado que este paso de choque térmico no es esencial para la transformación exitosa. Para ciertas cepas de levaduras (por ejemplo, los mutantes sensibles a la temperatura), golpe de calor es perjudicial. Previamente hemos reducido el tiempo de golpe de calor a un minuto y han sido capaces de transformar con éxito una cepa de levadura albergar una mutación temperatura ypt1 sensibles que utilizan este protocolo. </li><li> Giro placas a 2500rpm (~ 1100 xg) durante 5 minutos, el uso de adaptadores de centrífuga para dar cabida a placas de 96 pozos. Eliminar la solución de PEG por las placas de inversión de más de cubo de residuos. Blot placa invertida sobre papel absorbente para eliminar el líquido residual (las células que permanecen en el fondo de los pozos). </li><li> Enjuague las células mediante la adición de 200μL de medio mínimo (por ejemplo, SD /-Ura) a cada pocillo con RapidPlate. </li><li> Giro placas a 2500rpm durante 5 minutos y retirar el sobrenadante por el cubo de residuos invertir más y en toallas de papel secante. </li><li> Añadir 200μL de medio mínimo (por ejemplo, SD /-Ura) a cada pocillo con RapidPlate. </li><li> Se incuba a 30 ° C durante 2 días sin agitación. Después de 2 días, pequeñas colonias de células se empiezan a formar en la parte inferior de cada transformado con éxito así. </li></ol> 3. Manchado ensayo <ol><li> Dispensar 200μL de rafinosa medios basados ​​en mínimos (por ejemplo, sraf /-Ura) en cada pocillo deun nuevo fondo plano placa de 96 pocillos. </li><li> Mezcle cada pocillo de la placa de transformación mediante la aspiración y dispensación de suspensión de células en ocho ocasiones con Rapidplate. </li><li> Inocular las placas con sraf 5μL de mezcla de células de la placa de la transformación. </li><li> Se incuba a 30 ° C durante un día. Pequeñas colonias deben estar presentes en la parte inferior de cada bien después de un día. </li><li> Colonias lugar en tarjetas SD /-Ura y SGal / Ura-placas en campana. Esterilizar de 96 perno replicador (Frogger) por fuego. Mezcla de colonias con Frogger antes de manchas en las placas de medios selectivos. Después de ver, permite secar las placas en campana durante 5-10 minutos. </li><li> Se incuba a 30 ° C durante 2-3 días. </li></ol> Placas de fotografía con cámara digital, y comparar visualmente el crecimiento de colonias en SGal / Ura-placas para encontrar colonias en las que la toxicidad se incrementa la tensión de consulta (un crecimiento más lento / colonias menos densas) o suprimida (un crecimiento más rápido / más densas colonias). 4. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2836/2836fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Levadura pantalla sobreexpresión plásmido para identificar supresores y potenciadores de la toxicidad TDP-43. TDP-43 es una proteína humana que ha sido implicada en la patogenia de la esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig). Agregados citoplasmáticos de TDP-43 acumulan en el cerebro y las neuronas de médula espinal de pacientes con ELA 17. Expresando TDP-43 en células de levadura resultados de la agregación y la citotoxicidad de 18 años. Hemos utilizado este modelo de sistema para definir los mecanismos de toxicidad de la TDP-43 19,20. Se muestran ejemplos representativo de platos de nuestra levadura TDP-43 pantalla modificador de toxicidad. Estas placas colonias con una pantalla integrada de galactosa-inducible TDP-43 plásmido y se transforman también con plásmidos de la biblioteca de expresión FLEXGene ORF. La placa de la izquierda contiene glucosa, que reprime la expresión de TDP-43 o los plásmidos FLEXGene. La placa de la derecha contiene galactosa, que induce la expresión de TDP-43 y el ORF en los plásmidos FLEXGene. La punta de flecha verde indica una colonia transformada con un plásmido que suprime la toxicidad de la TDP-43. La punta de flecha roja indica una colonia transformada con un plásmido que aumenta la toxicidad de la TDP-43.

<ol><li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nobel+Prize+and+beyond%3A+an+interview+with+Sir+Paul+Nurse.+Interview+by+Susan+R.+Owens%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens.</a> EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).</li>
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<li>Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314, 130-133 (2006).</li>
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<li>Elden, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466, 1069-1075 (2010).</li>
<li>Johnson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+intrinsically+aggregation-prone%2C+and+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutations+accelerate+aggregation+and+increase+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity.</a> J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).</li>
<li>Cooper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+Bread+to+Brains+and+Beyond%3A+Can+Yeast+Cells+Teach+Us+about+Neurodegenerative+Disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nat Genet. 41, 308-315 (2009).</li>
</ol>

Aquí se presenta un protocolo para llevar a cabo una pantalla de alto rendimiento de la sobreexpresión plásmido en la levadura. Este método permite la detección rápida e imparcial de modificadores genéticos de muchos fenotipos celulares distintos. Con este enfoque, un investigador puede filtrar una parte importante del genoma de la levadura en cuestión de semanas. Este enfoque no sesgado también permite la identificación de los modificadores, que pueden no haber sido predicho sobre la base de los resultados anteriores. ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> BioRobot RapidPlate </td><td> Qiagen </td><td> 9000490 </td></tr><tr><td> 96 perno replicador (Frogger) </td><td> V &amp; P Científico </td><td> VP404 </td></tr><tr><td> FLEXGene ORF biblioteca </td><td> Instituto de Proteómica de Harvard Medical School </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga de mesa </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td></tr><tr><td> Frasco de 500 ml desconcertado </td><td> Bellco </td><td> 2543-00500 </td></tr><tr><td> 2,8 litros de tres desconcertado Fernbach frasco </td><td> Bellco </td><td> 2551-02800 </td></tr><tr><td> 100μL Rapidplate puntas de pipeta </td><td> Axygen </td><td> ZT-100-RS </td></tr><tr><td> 200μL Rapidplate puntas de pipeta </td><td> Axygen </td><td> ZT-200-RS </td></tr></tbody></table>

la levadura de alto rendimiento de la pantalla sobreexpresión plásmido

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

La incipiente levadura, Saccharomyces cerevisiae, es un modelo de sistema de gran alcance para la definición de los mecanismos fundamentales de muchos procesos celulares importantes, incluidos los que tienen relación directa con la enfermedad humana. Debido a su corto tiempo de generación y bien caracterizado del genoma, una gran ventaja experimental del sistema de modelo de la levadura es la capacidad de realizar exámenes genéticos para identificar los genes y las vías que están involucrados en un proceso determinado. En los últimos treinta años, tales exámenes genéticos se han utilizado para dilucidar el ciclo celular, la vía secretora, y muchos aspectos más altamente conservadas de la biología de las células eucariotas 1-5. En los últimos años, varias bibliotecas genoma de cepas de levadura y plásmidos se han generado 6.10. Estas colecciones permiten ahora a la interrogación sistemática de la función genética utilizando la ganancia y la pérdida de la función de los enfoques 11-16. Aquí les ofrecemos un protocolo detallado para el uso de un protocolo de levadura de alto rendimiento de transformación con un robot de manejo de líquidos para llevar a cabo una pantalla sobreexpresión plásmido, vestida con una biblioteca de 5.500 plásmidos de levadura. Hemos estado utilizando estas pantallas para identificar modificadores genéticos de toxicidad asociados con la acumulación de la agregación de las proteínas humanas expuestas a la enfermedad neurodegenerativa. Los métodos que aquí se adaptan fácilmente al estudio de otros fenotipos celulares de interés.

Aquí se describe una pantalla de la sobreexpresión del plásmido en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Con una biblioteca dispuestos plásmido y un protocolo de transformación de alto rendimiento de la levadura con un robot de manejo de líquidos.

La levadura de alto rendimiento de la pantalla sobreexpresión plásmido

La levadura gemante, Saccharomyces cerevisiae, es un potente sistema modelo para definir los mecanismos fundamentales de muchos procesos celulares importantes, ...

El objetivo general de este procedimiento es transformar células de levadura con una biblioteca de matriz de ADN plasmídico. Esto se logra primero cultivando una cantidad adecuada de células de levadura. Luego, las células de levadura se tratan con acetato de litio para hacerlas competentes para la transformación de ADN.A continuación, transforme las células competentes e mezclándolas con ADN. El paso final del procedimiento consiste en seleccionar y analizar los transformantes. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren los efectos del ADN plasmídico sobre los fenotipos de levadura mediante ensayos de siembra en placas y/o microscopía.La principal ventaja de esta técnica frente a los protocolos existentes, como las transformaciones estándar de levaduras, es que permite la transformación de un gran número de plásmidos diferentes en células de levadura de forma automatizada. Este protocolo de transformación de levaduras de alto rendimiento está diseñado para 10 placas de 96 pocillos, pero puede escalarse hacia arriba o hacia abajo según sea necesario. Para experimentos a mayor escala, la clave del éxito consiste en mantener organizadas todas las placas y los reactivos.Una vez que el experimento esté en marcha para evitar confusiones, se utilizará un manipulador de líquidos en placas rápido Biobot en este protocolo. Para comenzar, alícuota de cinco a diez microlitros de ADN plasmídico de una biblioteca de plásmidos de levadura en matriz en cada pocillo de placas redondas de 96 pocillos con fondo. Coloque las placas de 96 pocillos descubiertas dentro de una campana de flujo laminar limpia durante la noche para secarlas.A continuación, inocule 200 mililitros de medio de peptona de levadura y dextrosa o medio YPD con una cepa de interés en un matraz Lin Meyer con aletas de 500 mililitros e incube durante la noche a 30 grados Celsius con agitación. A la mañana siguiente, diluya la cepa de interés hasta una DO600 de 0,1 en dos litros de medio YPD para un crecimiento óptimo. Incube cultivos de hasta un litro en matraces con aletas separados de 2,8 litros.Agite los frascos durante cuatro a seis horas a 30 grados Celsius hasta que los cultivos alcancen una DO 600 de 0,8 a 1,0. Cuando el cultivo de levadura haya alcanzado una DO 600 de 0,8 a 1,0, recolecte las células por centrifugación. Llene cuatro tubos cónicos desechables de 225 mililitros con cultivo y centrifugue a 3000 RPM durante cinco minutos en una centrífuga de mesa.Vierta el sobrenadante S de cada tubo. Añada más cultivo a los mismos tubos y centrifugue nuevamente, repitiendo según sea necesario hasta que todas las células sean recolectadas. Lave cada pellet celular con 50 mililitros de agua destilada autoclave y resuspenda mediante vortex. Combine las células en un tubo cónico de doscientos veinticinco mililitros y centrifugue a 3000 RPM durante cinco minutos. Después de eliminar el sobrenadante S, lave las células con cien mililitros de solución de acetato de litio. Vuelva a centrifugar a 3000 RPM durante cinco minutos.Retire el SNA y resuspenda el botón celular en 70 mililitros de solución de acetato de litio. Vortexee a alta velocidad durante aproximadamente 30 segundos hasta que el botón esté completamente resuspendido. Incube con agitación a 30 grados Celsius durante 30 minutos.A continuación, agregue etanol beta me capto hasta alcanzar una concentración de 0,1 molar e incube con agitación a 30 grados Celsius durante otros 30 minutos. Después de la incubación de 30 minutos, agregue dos mililitros de ADN de esperma de salmón hervido y enfriado a la mezcla celular. Vierta la mezcla celular en una placa de un solo pozo autoclavable y luego elimine cualquier precipitado que se forme, ya que esto podría interferir con las pipetaciones posteriores.Utilizando el biobot, reparta rápidamente 50 microlitros de la mezcla celular a cada pocillo de las cuatro placas de 96 pocillos previamente preparadas que contienen ADN plasmático; no mezcle. Incube las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitación mientras las células están incubando.Prepare 200 mililitros de solución de acetato de litio PEG DMSO. Combine 160 mililitros de PEG 33 al 50 %, 20 mililitros de DMSO y 20 mililitros de acetato de litio un molar. Es importante que esta solución se prepare inmediatamente antes de su uso.Añada 125 microlitros de solución de acetato de PEG y litio en DMSO a cada uno. Mezcle bien aspirando y dispensando la suspensión celular ocho veces. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitación.A continuación, someta las células a un choque térmico a 42 grados Celsius durante 15 minutos en un incubador seco. No apile las placas después del choque térmico; centrifugue las placas utilizando adaptadores de centrífuga para acomodar placas de 96 pocillos. Después de la centrifugación, elimine la solución de PEG invirtiendo las placas sobre un recipiente de desecho. Luego, seque las placas invertidas sobre toallas de papel.Para eliminar el líquido residual, las células permanecerán en el fondo de los pocillos. Lave las células añadiendo 200 microlitros de medio mínimo a cada uno. Vuelva a centrifugar las placas.Elimine el sobrenadante invirtiendo el recipiente sobre un cubo de desecho y absorbiendo con toallas de papel. Añada 200 microlitros de medio mínimo a cada pocillo con una placa rápida e incube a 30 grados Celsius durante dos días sin agitación. Después de dos días, deberían comenzar a formarse colonias pequeñas de células en el fondo de cada pocillo transformado con éxito.Para preparar el ensayo de Spatting, primero distribuya 200 microlitros de medio mínimo basado en OSE en cada pocillo de una nueva placa de fondo plano de 96 pocillos. A continuación, mezcle cada pocillo de la placa de transformación aspirando y dispensando la suspensión celular ocho veces con una placa rápida.Inocular cada pocillo de la placa con rafinosa con cinco microlitros de la mezcla celular procedente de la placa de transformación e incubar a 30 grados Celsius durante un día. Al día siguiente, deben estar presentes colonias pequeñas en el fondo de cada uno.Realizaremos el ensayo de siembra en la campana; esterilice un portaobjetos de 96 puntas, replicador o "frogger" mediante flambado. Mezcle las colonias con un "frogger" y luego siembre las colonias en placas con medio selectivo. Después de la siembra, deje secar las placas en la campana durante cinco a diez minutos.Incubar las placas a 30 grados Celsius durante dos a tres días. Aquí se muestran resultados representativos de una pantalla de sobreexpresión de plásmidos en levadura para identificar supresores y potenciadores de la toxicidad de TDP-43. TDP-43 es una proteína humana que se ha implicado en la patogénesis de la esclerosis lateral amiotrófica o enfermedad de Lou Gehrig. La expresión de TDP-43 en células de levadura provoca agregación y citotoxicidad.Estas placas muestran colonias con un plásmido integrado de T DP 43 inducible por galactosa que también han sido transformadas con plásmidos de la biblioteca de expresión ORF de genes flex. Las colonias aquí aparecen de color rojo porque la cepa tiene una mutación que provoca la acumulación de un pigmento rojo. La placa de la izquierda contiene glucosa, que reprime la expresión de T DP 43 o de los plásmidos de genes flex.La placa de la derecha contiene galactosa, que induce la expresión de TDP 43 y las OsF en los plásmidos del gen flex. La punta de flecha verde indica una colonia transformada con un plásmido que suprime la toxicidad de TDP 43, como lo indica un crecimiento más rápido y colonias más densas. La punta de flecha roja indica una colonia transformada con un plásmido que aumenta la toxicidad de TDP 43, como lo indica un crecimiento más lento y colonias menos densas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transformar una biblioteca de ADN plasmático de células evitadas.

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