La levadura de alto rendimiento de la pantalla sobreexpresión plásmido

El objetivo general de este procedimiento es transformar las células de levadura con una biblioteca de matriz de ADN plasmático. Esto se logra cultivando primero una cantidad adecuada de células de levadura. A continuación, las células de levadura se tratan con acetato de litio para hacerlas competentes para la transformación del ADN.

A continuación, transforma las células e competentes mezclándolas con el ADN. El paso final del procedimiento es seleccionar y analizar los transformadores. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran los efectos del ADN plasmático en los fenotipos de levadura a través de ensayos de detección de levadura y/o microscopía.

La principal ventaja de esta técnica sobre los protocolos existentes, como las transformaciones estándar de levadura, es que permite la transformación de un gran número de plásmidos diferentes en células de levadura de forma automatizada. Este protocolo de transformación de levadura de alto rendimiento está diseñado para 10 placas de 96 pocillos, pero se puede ampliar o reducir en consecuencia. Para experimentos a mayor escala, la clave del éxito es mantener todas las placas y reactivos organizados.

Una vez que el experimento esté en marcha para evitar confusiones, se utilizará un controlador de líquido de placa rápida biobot en este protocolo Para comenzar la alícuota, de cinco a 10 microlitros de ADN plasmático de una biblioteca de plásmidos de levadura en cada pocillo de la ronda. Placas inferiores de 96 pocillos. Coloque las placas de 96 pocillos descubiertas dentro de una campana de extracción de aguas de banco limpia durante la noche para que se sequen.

A continuación, inocule 200 mililitros de péptido de levadura dextrosa o medio YPD con una cepa de consulta en un matraz Lin Meyer con deflector de 500 mililitros e incube durante la noche a 30 grados centígrados con agitación a la mañana siguiente. Diluya la cepa de consulta a un OD 600 de 0,1 en dos litros de medio YPD para un crecimiento óptimo. Cultive cultivos de hasta un litro en frascos separados con deflectores de 2,8 litros.

Agite los matraces durante cuatro a seis horas a 30 grados centígrados hasta que los cultivos alcancen un diámetro exterior de 600 de 0,8 a 1,0. Cuando el cultivo de levadura haya alcanzado un OD 600 de 0,8 a 1,0, recoja las células por centrifugación. Llene cuatro tubos cónicos desechables de 225 mililitros con cultivo y haga girar 3000 RPM durante cinco minutos en una centrífuga de mesa.

Vierta el sobrenadante S de cada tubo. Agregue más cultivo a los mismos tubos y vuelva a centrifugar, repitiendo según sea necesario hasta que se recolecten todas las células. Lavar cada pellet de celda en 50 mililitros de agua destilada en autoclave y pasar Resus por vórtice.

Combine las celdas en un tubo cónico de doscientos veinticinco mililitros y gire a 3000 RPM durante cinco minutos. Después de eliminar el sobrenadante S, lave las células con cien mililitros de solución de acetato de litio. Gire nuevamente a 3000 RPM durante cinco minutos.

Retire el SNA y vuelva a suspender el pellet de celda en 70 mililitros de solución de acetato de litio. Vórtice a alta velocidad durante unos 30 segundos hasta que el pellet se resuspenda por completo. Incubar agitando a 30 grados centígrados durante 30 minutos.

A continuación, agregue etanol beta me capto a 0,1 molar e incube agitando a 30 grados centígrados durante otros 30 minutos. Después de la incubación de 30 minutos, agregue dos mililitros de ADN de esperma de salmón hervido y enfriado a la mezcla de células. Vierta la mezcla de células en una placa de pocillo único que se pueda esterilizar en autoclave y, a continuación, elimine cualquier precipitado que se forme, ya que puede interferir con el pipeteo posterior.

Utilizando la placa rápida del biobot se alícuota 50 microlitros de mezcla celular a cada pocillo de los cuatro previamente preparados. Las placas de 96 pocillos que contienen ADN plasmático no se mezclan. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitar mientras se incuban las células.

Prepare 200 mililitros de solución de acetato de litio PEG DMSO. Combine 160 mililitros de 50%PEG 33, 50 20 mililitros de DMSO y 20 mililitros de acetato de litio de un molar. Es importante que esta solución se prepare justo antes de su uso.

Agregue 125 microlitros de solución DMSO de acetato de litio PEG a cada uno. Mezclar bien aspirando y dispensando la suspensión celular ocho veces. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitar.

A continuación, haga un choque térmico de las células a 42 grados centígrados durante 15 minutos En una incubadora seca, no apile las placas después del choque térmico, gire las placas con adaptadores de centrífuga para acomodar las placas de 96 pocillos. Después de la centrifugación, retire la solución de PEG invirtiendo las placas sobre un cubo de residuos. A continuación, seca los platos invertidos con toallas de papel.

Para eliminar el líquido residual, las celdas permanecerán en el fondo de los pozos. Enjuague las celdas agregando 200 microlitros de medio mínimo a cada una. Bueno, vuelve a girar los platos.

Retire el sobrenadante invirtiéndolo sobre un cubo de basura y secándolo con toallas de papel. Agregue 200 microlitros de medio mínimo a cada pocillo con una placa rápida para incubar a 30 grados centígrados durante dos días sin agitar. Después de dos días, deberían comenzar a formarse pequeñas colonias de células en la parte inferior de cada una de las transformadas con éxito.

Bueno, para prepararse para el ensayo de Sputting, primero dispense 200 microlitros de medios mínimos a base de OSE en cada pocillo de un nuevo piso. Placa inferior de 96 pocillos. Próximo. Mezcle cada pocillo de la placa de transformación aspirando y dispensando la suspensión celular ocho veces con una placa rápida.

Inocular cada pocillo de la placa de rafinosa con cinco microlitros de mezcla celular de la placa de transformación, incubar a 30 grados centígrados durante un día. Al día siguiente. Debe haber pequeñas colonias en la parte inferior de cada uno.

Realice bien el ensayo de detección en la campana, esterilice un perno 96, un replicador o un frogger mediante llamas. Mezcle las colonias con un frogger y luego localice las colonias en placas de medios selectivos. Después de manchar, deje que las placas se sequen en la campana durante cinco a 10 minutos.

Incubar las placas a 30 grados centígrados durante dos o tres días. A continuación se muestran los resultados representativos de un cribado de sobreexpresión de plásmido de levadura para identificar supresores y potenciadores de TDP 43.Toxicidad. TDP 43 es una proteína humana que se ha implicado en la patogénesis de una esclerosis lateral miotrófica o enfermedad de Lou Gehrig, expresando TDP 43 en células de levadura que da lugar a agregación y citotoxicidad.

Estas placas muestran colonias con un plásmido T DP 43 inducible por galactosa integrado que también se han transformado con plásmidos de la biblioteca de expresión de ORF del gen flex. Las colonias aquí parecen de color rojo porque la cepa tiene una mutación que resulta en la acumulación de un pigmento rojo. La placa de la izquierda contiene glucosa, que reprime la expresión de T DP 43 o los plásmidos del gen flex.

La placa de la derecha contiene galactosa, que induce la expresión de TDP 43 y O Fs en los plásmidos del gen flex. La punta de flecha verde indica una colonia transformada con un plásmido que suprime la toxicidad de TDP 43 como lo indica un crecimiento más rápido y colonias más densas. La punta de flecha roja indica una colonia transformada con un plásmido que aumenta la toxicidad de TDP 43 como lo indican las colonias de crecimiento más lento y menos densas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transformar una biblioteca de ADN de plasma de células.