Muestreo no invasivo de revestimiento mucoso líquido para la cuantificación In Vivo de la vía aérea superior mediador inmune niveles
7 de agosto de 2017
Este protocolo describe una técnica no invasiva para la toma de muestras del líquido guarnición mucosa de las vías aéreas superiores. Puede ser utilizado para realizar la cuantificación de en vivo los niveles de mediadores de la proteína, tales como citoquinas y quimioquinas, en sujetos de todas las edades.
El objetivo general de este método de muestreo de líquido del revestimiento de la mucosa es estudiar la firma inmunitaria local de las vías respiratorias sin necesidad de procedimientos de estimulación. Este método le permite estudiar preguntas clave en el área de las enfermedades respiratorias pediátricas como infecciones, asma y alergias. Las ventajas del método son que se pueden medir niveles muy bajos de mediadores inmunitarios en la mucosa de las vías respiratorias no estimulada in vivo.
La demostración del procedimiento será realizada por el Dr. Wolsk. Para la recolección de muestras de neonatos, primero corte al menos dos tiras de tres por 15 milímetros de láminas de filtro de poliéster hidroxilado fibroso. A continuación, coloque al neonato en una cama y tome nota de cualquier síntoma de infección de las vías respiratorias.
Luego, use fórceps para insertar un pedazo de papel de filtro de aproximadamente un centímetro en la parte anterior del cornete inferior de cada fosa nasal del bebé y administre agua azucarada al neonato para mayor comodidad según sea necesario. Tome nota de cualquier estornudo, llanto persistente o epistaxis que ocurra durante el período de muestreo. Después de dos minutos de absorción, transfiera los papeles de filtro a un tubo etiquetado para su almacenamiento inmediato a 80 grados centígrados negativos.
La demostración del procedimiento experimental estará a cargo de Lisbeth Rosholm, técnica de mi laboratorio. Para la cuantificación del mediador inmunitario de las vías respiratorias, coloque hasta 10 muestras de almacenamiento a 80 grados centígrados negativos en hielo y registre sus números de identificación. Cuando las muestras se hayan descongelado, sumerja los dos papeles de filtro por sujeto en 150 microlitros de tampón recién preparado por papel de filtro, complementado con una tableta completa de inhibidor de proteasa por cada 25 mililitros de solución tampón.
Transfiera las muestras a un agitador de placas a 400 rpm durante cinco minutos. Transfiera el tampón y los papeles de filtro a las tazas de los filtros de tubo de acetato de celulosa individuales. Centrifugar las muestras para recoger el extracto nasal filtrado en la parte inferior de los tubos de microcentrífuga.
Luego, retire las tazas y coloque los tubos en hielo. A continuación, transfiera 150 alícuotas de microlitros del extracto nasal a pocillos individuales de placas de almacenamiento de baja unión a proteínas y almacene las placas a menos 80 grados centígrados hasta el análisis. A continuación, se midió la concentración de los mediadores inmunitarios nasales de interés mediante una matriz multiplexada basada en electroquimioluminiscencia de alta sensibilidad de acuerdo con los protocolos de ensayo estándar.
En este análisis representativo de 620 neonatos, la mayoría de los mediadores inmunitarios medidos demostraron un bajo nivel de detección. Los niveles de IFN gamma estaban por debajo del límite inferior de detección en casi la mitad de las muestras, mientras que los niveles de TNF alfa, CCL4 y TGF beta estaban por debajo del límite inferior de detección en menos del 1% de las muestras. Se evidenció una fuerte multicolinealidad para los 20 niveles de mediadores detectados, como se ilustra en el mapa de calor.
En los neonatos asintomáticos infectados por picornavirus, se observó un perfil regulado al alza comprometido principalmente de mediadores inmunes tipo 1, lo que sugiere un papel desencadenante inmunológico de las bacterias y virus colonizadores en la primera parte de la vida. También se determinó una asociación entre la presencia de hermanos en el hogar al nacer y una respuesta inmune mucosa específica tipo 17 dirigida a la mucosa tipo 17, con evidencia de correlación de este fenómeno con un efecto de preparación inmune en el útero que se correlaciona inversamente con el tiempo transcurrido desde el último parto. Además, los niños nacidos de madres que recibieron suplementos altos en comparación con placebo se caracterizaron por una regulación positiva en mediadores inmunológicos específicos, lo que sugiere que la vitamina D promueve una respuesta inmune antibacteriana independiente de la inducida por virus, bacterias, hermanos o atopia materna.
Este método de micromuestreo también se puede utilizar a través de un broncoscopio, lo que permite estudiar los mediadores inmunes en las vías respiratorias inferiores. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo medir los mediadores en la mucosa de las vías respiratorias no estimuladas in vivo en neonatos y niños mayores.
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Información general
Este protocolo describe una técnica no invasiva para la toma de muestras de fluido de revestimiento mucoso sin alterar de las vías respiratorias superiores. Permite la cuantificación de niveles in vivo de mediadores de proteínas, como citocinas y quimiocinas, en sujetos de todas las edades.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Enfermedades respiratorias
- Inmunología
- Pediatría
Antecedentes
- Este método estudia la firma inmune local de la vía aérea sin procedimientos de estimulación.
- Es aplicable a enfermedades respiratorias pediátricas como infecciones, asma y alergia.
- La técnica permite la medición de bajos niveles de mediadores inmunes en la mucosa de la vía aérea no estimulada in vivo.
- La demostración del procedimiento es realizada por el Dr. Wolsk.
Propósito del estudio
- Investigar la respuesta inmune en la mucosa de la vía aérea.
- Proporcionar información sobre las condiciones respiratorias pediátricas.
- Facilitar técnicas de muestreo no invasivas para la investigación.
Métodos utilizados
- Recolección de fluido de revestimiento mucoso de las vías respiratorias superiores.
- Uso de láminas de filtro de poliéster hidroxilado fibroso para la recolección de muestras.
- Observación de síntomas de infección de la vía aérea en neonatos.
- Cuantificación de citocinas y quimiocinas en las muestras recolectadas.
Principales resultados
- Recolección exitosa de fluido de revestimiento mucoso sin procedimientos invasivos.
- Capacidad para medir mediadores inmunes in vivo.
- Perspectivas sobre el perfil inmune de pacientes pediátricos.
- Posibles aplicaciones en la comprensión de enfermedades respiratorias.
Conclusiones
- El método de muestreo no invasivo es efectivo para estudiar la inmunidad de la vía aérea.
- Esta técnica puede mejorar la investigación en salud respiratoria pediátrica.
- Estudios futuros pueden ampliar los hallazgos relacionados con los mediadores inmunes.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This noninvasive mucosal lining fluid sampling method enables direct quantification of in vivo immune mediators in the upper airway mucosa without stimulation, providing a physiologically relevant readout of airway immune activity. The technique supports early-life immune profiling and longitudinal monitoring, facilitating mechanistic de-risking in respiratory therapeutic development by linking genetic and environmental exposures to immune phenotypes. Its application in neonatal and pediatric cohorts offers predictive value for endotyping and monitoring disease progression, particularly in asthma, allergy, and infectious disease contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring baseline and induced levels of immune mediators in unstimulated mucosal tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible, minimally invasive matrix for functional target validation in pediatric populations.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through correlation of mediator profiles with clinical phenotypes such as asymptomatic viral infection and sibling exposure effects.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates eluted protein samples compatible with high-sensitivity electrochemiluminescence multiplex arrays for quantitative immune profiling.
- Standardization: Uses consistent filter paper absorption and elution protocols to ensure reproducible recovery of analytes across subjects and timepoints.
- Scalability: Demonstrated feasibility in large neonatal cohorts (n=620), supporting high-throughput screening applications in epidemiologic and interventional studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables longitudinal sampling from birth through childhood, linking early-life immune signatures to later respiratory disease outcomes.
- Biomarker Alignment: Detects upregulation of type 1 and type 17 immune mediators in asymptomatic picornavirus-infected neonates, suggesting utility in identifying immune endotypes.
- Mechanistic De-risking: Reveals associations between maternal vitamin D supplementation and antibacterial immune responses, supporting target prioritization for immunomodulatory interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase by enabling direct measurement of immune mediators in vivo, informing target selection and pathway elucidation prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune pathway activation in mucosal tissue without ex vivo manipulation or stimulation artifacts.
- Screening: Produces standardized eluates suitable for multiplex immunoassay readouts, facilitating comparative analysis across treatment or exposure groups.
- Analytics: Generates quantitative mediator levels that allow statistical assessment of collinearity, immune network activity, and phenotype associations.
- Translational Research: Connects neonatal immune profiles to childhood respiratory symptoms and environmental exposures, supporting risk-stratified advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Represents a platform-compatible sampling technique applicable across respiratory disease models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by capturing endogenous immune activity in the native mucosal microenvironment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized collection, elution, and storage procedures, minimizing pre-analytical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking immunomodulatory mechanisms to early-life immune signatures, reducing late-stage biological risk in respiratory programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on demonstrated effects on mucosal immune pathways in relevant, longitudinal human models.
Implementation Considerations
- Requires training in neonatal airway anatomy and gentle sampling technique to ensure subject comfort and sample integrity.
- Dependent on access to ultrafilter tubes, plate shakers, and electrochemiluminescence immunoassay infrastructure for analyte detection.
- Necessitates standardized buffer preparation with protease inhibitors to prevent mediator degradation during extraction.
- Requires adaptation of sampling duration or filter size when applied to older children or alternative mucosal sites.
- Limited by analyte abundance, with some mediators frequently below detection limit, necessitating assay sensitivity optimization for low-expression targets.
