Muestreo no invasivo de revestimiento mucoso líquido para la cuantificación In Vivo de la vía aérea superior mediador inmune niveles
7 de agosto de 2017
Este protocolo describe una técnica no invasiva para la toma de muestras del líquido guarnición mucosa de las vías aéreas superiores. Puede ser utilizado para realizar la cuantificación de en vivo los niveles de mediadores de la proteína, tales como citoquinas y quimioquinas, en sujetos de todas las edades.
El objetivo general de este método de muestreo de líquido del revestimiento de la mucosa es estudiar la firma inmunitaria local de las vías respiratorias sin necesidad de procedimientos de estimulación. Este método le permite estudiar preguntas clave en el área de las enfermedades respiratorias pediátricas como infecciones, asma y alergias. Las ventajas del método son que se pueden medir niveles muy bajos de mediadores inmunitarios en la mucosa de las vías respiratorias no estimulada in vivo.
La demostración del procedimiento será realizada por el Dr. Wolsk. Para la recolección de muestras de neonatos, primero corte al menos dos tiras de tres por 15 milímetros de láminas de filtro de poliéster hidroxilado fibroso. A continuación, coloque al neonato en una cama y tome nota de cualquier síntoma de infección de las vías respiratorias.
Luego, use fórceps para insertar un pedazo de papel de filtro de aproximadamente un centímetro en la parte anterior del cornete inferior de cada fosa nasal del bebé y administre agua azucarada al neonato para mayor comodidad según sea necesario. Tome nota de cualquier estornudo, llanto persistente o epistaxis que ocurra durante el período de muestreo. Después de dos minutos de absorción, transfiera los papeles de filtro a un tubo etiquetado para su almacenamiento inmediato a 80 grados centígrados negativos.
La demostración del procedimiento experimental estará a cargo de Lisbeth Rosholm, técnica de mi laboratorio. Para la cuantificación del mediador inmunitario de las vías respiratorias, coloque hasta 10 muestras de almacenamiento a 80 grados centígrados negativos en hielo y registre sus números de identificación. Cuando las muestras se hayan descongelado, sumerja los dos papeles de filtro por sujeto en 150 microlitros de tampón recién preparado por papel de filtro, complementado con una tableta completa de inhibidor de proteasa por cada 25 mililitros de solución tampón.
Transfiera las muestras a un agitador de placas a 400 rpm durante cinco minutos. Transfiera el tampón y los papeles de filtro a las tazas de los filtros de tubo de acetato de celulosa individuales. Centrifugar las muestras para recoger el extracto nasal filtrado en la parte inferior de los tubos de microcentrífuga.
Luego, retire las tazas y coloque los tubos en hielo. A continuación, transfiera 150 alícuotas de microlitros del extracto nasal a pocillos individuales de placas de almacenamiento de baja unión a proteínas y almacene las placas a menos 80 grados centígrados hasta el análisis. A continuación, se midió la concentración de los mediadores inmunitarios nasales de interés mediante una matriz multiplexada basada en electroquimioluminiscencia de alta sensibilidad de acuerdo con los protocolos de ensayo estándar.
En este análisis representativo de 620 neonatos, la mayoría de los mediadores inmunitarios medidos demostraron un bajo nivel de detección. Los niveles de IFN gamma estaban por debajo del límite inferior de detección en casi la mitad de las muestras, mientras que los niveles de TNF alfa, CCL4 y TGF beta estaban por debajo del límite inferior de detección en menos del 1% de las muestras. Se evidenció una fuerte multicolinealidad para los 20 niveles de mediadores detectados, como se ilustra en el mapa de calor.
En los neonatos asintomáticos infectados por picornavirus, se observó un perfil regulado al alza comprometido principalmente de mediadores inmunes tipo 1, lo que sugiere un papel desencadenante inmunológico de las bacterias y virus colonizadores en la primera parte de la vida. También se determinó una asociación entre la presencia de hermanos en el hogar al nacer y una respuesta inmune mucosa específica tipo 17 dirigida a la mucosa tipo 17, con evidencia de correlación de este fenómeno con un efecto de preparación inmune en el útero que se correlaciona inversamente con el tiempo transcurrido desde el último parto. Además, los niños nacidos de madres que recibieron suplementos altos en comparación con placebo se caracterizaron por una regulación positiva en mediadores inmunológicos específicos, lo que sugiere que la vitamina D promueve una respuesta inmune antibacteriana independiente de la inducida por virus, bacterias, hermanos o atopia materna.
Este método de micromuestreo también se puede utilizar a través de un broncoscopio, lo que permite estudiar los mediadores inmunes en las vías respiratorias inferiores. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo medir los mediadores en la mucosa de las vías respiratorias no estimuladas in vivo en neonatos y niños mayores.
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Descripción general
Este protocolo describe una técnica no invasiva para obtener muestras de líquido de revestimiento mucoso no perturbado de las vías respiratorias superiores. Permite la cuantificación de niveles in vivo de mediadores proteicos, como citoquinas y quimiocinas, en sujetos de todas las edades.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Enfermedades respiratorias
- Inmunología
- Pediatría
Antecedentes
- Este método estudia la firma inmunitaria local de la vía aérea sin procedimientos de estimulación.
- Es aplicable a enfermedades respiratorias pediátricas como infecciones, asma y alergia.
- La técnica permite la medición de bajos niveles de mediadores inmunitarios en la mucosa de la vía aérea no estimulada in vivo.
- La demostración del procedimiento es realizada por el Dr. Wolsk.
Objetivo del estudio
- Investigar la respuesta inmunitaria en la mucosa de las vías respiratorias.
- Proporcionar información sobre las afecciones respiratorias pediátricas.
- Facilitar técnicas de muestreo no invasivas para la investigación.
Métodos Utilizados
- Recolección de líquido del revestimiento mucoso de las vías respiratorias superiores.
- Uso de láminas de filtro de poliéster hidroxilado fibroso para la recolección de muestras.
- Observación de síntomas de infección de las vías respiratorias en neonatos.
- Cuantificación de citocinas y quimioquinas en las muestras recolectadas.
Resultados principales
- Recolección exitosa de líquido de revestimiento mucoso sin procedimientos invasivos.
- Capacidad para medir mediadores inmunitarios in vivo.
- Conocimientos sobre el perfil inmunológico de pacientes pediátricos.
- Aplicaciones potenciales en la comprensión de enfermedades respiratorias.
Conclusiones
- El método de muestreo no invasivo es efectivo para estudiar la inmunidad de las vías respiratorias.
- Esta técnica puede mejorar la investigación sobre la salud respiratoria pediátrica.
- Estudios futuros podrían ampliar los hallazgos relacionados con los mediadores inmunitarios.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método de muestreo no invasivo del líquido de revestimiento mucoso permite la cuantificación directa de mediadores inmunitarios in vivo en la mucosa de las vías respiratorias superiores sin estimulación, proporcionando una lectura fisiológicamente relevante de la actividad inmunitaria de las vías respiratorias. La técnica permite el perfilado inmunológico en la primera infancia y el monitoreo longitudinal, facilitando la reducción de riesgos mecanicistas en el desarrollo de terapias respiratorias al vincular exposiciones genéticas y ambientales con fenotipos inmunitarios. Su aplicación en cohortes neonatales y pediátricas ofrece valor predictivo para la endotipificación y el seguimiento de la progresión de enfermedades, particularmente en contextos de asma, alergia y enfermedades infecciosas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la medición de niveles basales e inducidos de mediadores inmunitarios en tejido mucoso no estimulado.
- Valor operativo: Proporciona una matriz reproducible y mínimamente invasiva para la validación funcional de objetivos en poblaciones pediátricas.
- Valor predictivo: Apoya la reducción del riesgo biológico mediante la correlación de perfiles de mediadores con fenotipos clínicos como infección viral asintomática y efectos de exposición entre hermanos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayo: Genera muestras de proteínas eluidas compatibles con matrices multiplex de electroquimioluminiscencia de alta sensibilidad para perfiles inmunes cuantitativos.
- Normalización: Utiliza protocolos consistentes de absorción y elución en papel de filtro para garantizar una recuperación reproducible de analitos entre sujetos y puntos temporales.
- Escalabilidad: Demuestra viabilidad en grandes cohortes neonatales (n=620), apoyando aplicaciones de cribado de alto rendimiento en estudios epidemiológicos e intervencionistas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad traslacional: Permite el muestreo longitudinal desde el nacimiento hasta la infancia, vinculando las firmas inmunitarias tempranas con los resultados posteriores de enfermedades respiratorias.
- Alineación de biomarcadores: Detecta la sobreexpresión de mediadores inmunitarios de tipo 1 y tipo 17 en neonatos infectados asintomáticos por picornavirus, lo que sugiere su utilidad para identificar endotipos inmunitarios.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Revela asociaciones entre la suplementación materna con vitamina D y las respuestas inmunitarias antibacterianas, apoyando la priorización de objetivos para intervenciones inmunomoduladoras.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la fase de biología del descubrimiento al permitir la medición directa de mediadores inmunitarios in vivo, lo que aporta información para la selección de dianas y la elucidación de vías antes de la identificación del compuesto líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la activación de vías inmunitarias en tejidos mucosos sin manipulación ex vivo ni artefactos de estimulación.
- Selección: Produce eluidos estandarizados adecuados para lecturas de inmunoensayos múltiples, facilitando el análisis comparativo entre grupos de tratamiento o exposición.
- Análisis: Genera niveles cuantitativos de mediadores que permiten la evaluación estadística de colinealidad, actividad de redes inmunitarias y asociaciones con fenotipos.
- Investigación Traducional: Relaciona los perfiles inmunitarios neonatales con síntomas respiratorios en la infancia y exposiciones ambientales, apoyando decisiones de avance estratificadas por riesgo.
- Reutilización Empresarial: Representa una técnica de muestreo compatible con plataformas, aplicable en diversos modelos de enfermedades respiratorias y modalidades terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de dianas al capturar la actividad inmune endógena en el microentorno mucosal nativo.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante procedimientos estandarizados de recolección, elución y almacenamiento, minimizando la variabilidad preanalítica.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance al vincular mecanismos inmunomoduladores con firmas inmunes en etapas tempranas de la vida, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas de los programas respiratorios.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en efectos demostrados sobre las vías inmunes mucosales en modelos humanos longitudinales y pertinentes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere capacitación en la anatomía de la vía aérea neonatal y en técnicas de muestreo suaves para garantizar la comodidad del sujeto y la integridad de la muestra.
- Depende del acceso a tubos con filtro ultrafino, agitadores de placas e infraestructura para inmunoensayos por electroquimioluminiscencia para la detección de analitos.
- Necesita la preparación estandarizada de tampones con inhibidores de proteasas para prevenir la degradación de mediadores durante la extracción.
- Requiere adaptar la duración del muestreo o el tamaño del filtro cuando se aplica a niños mayores o a sitios mucosos alternativos.
- Limitado por la abundancia de analitos, ya que algunos mediadores se encuentran frecuentemente por debajo del límite de detección, lo que exige la optimización de la sensibilidad del ensayo para dianas de baja expresión.
