Muestreo no invasivo de revestimiento mucoso líquido para la cuantificación In Vivo de la vía aérea superior mediador inmune niveles

Este protocolo describe una técnica no invasiva para la toma de muestras del líquido guarnición mucosa de las vías aéreas superiores. Puede ser utilizado para realizar la cuantificación de en vivo los niveles de mediadores de la proteína, tales como citoquinas y quimioquinas, en sujetos de todas las edades.

El objetivo general de este método de muestreo de líquido del revestimiento de la mucosa es estudiar la firma inmunitaria local de las vías respiratorias sin necesidad de procedimientos de estimulación. Este método le permite estudiar preguntas clave en el área de las enfermedades respiratorias pediátricas como infecciones, asma y alergias. Las ventajas del método son que se pueden medir niveles muy bajos de mediadores inmunitarios en la mucosa de las vías respiratorias no estimulada in vivo.

La demostración del procedimiento será realizada por el Dr. Wolsk. Para la recolección de muestras de neonatos, primero corte al menos dos tiras de tres por 15 milímetros de láminas de filtro de poliéster hidroxilado fibroso. A continuación, coloque al neonato en una cama y tome nota de cualquier síntoma de infección de las vías respiratorias.

Luego, use fórceps para insertar un pedazo de papel de filtro de aproximadamente un centímetro en la parte anterior del cornete inferior de cada fosa nasal del bebé y administre agua azucarada al neonato para mayor comodidad según sea necesario. Tome nota de cualquier estornudo, llanto persistente o epistaxis que ocurra durante el período de muestreo. Después de dos minutos de absorción, transfiera los papeles de filtro a un tubo etiquetado para su almacenamiento inmediato a 80 grados centígrados negativos.

La demostración del procedimiento experimental estará a cargo de Lisbeth Rosholm, técnica de mi laboratorio. Para la cuantificación del mediador inmunitario de las vías respiratorias, coloque hasta 10 muestras de almacenamiento a 80 grados centígrados negativos en hielo y registre sus números de identificación. Cuando las muestras se hayan descongelado, sumerja los dos papeles de filtro por sujeto en 150 microlitros de tampón recién preparado por papel de filtro, complementado con una tableta completa de inhibidor de proteasa por cada 25 mililitros de solución tampón.

Transfiera las muestras a un agitador de placas a 400 rpm durante cinco minutos. Transfiera el tampón y los papeles de filtro a las tazas de los filtros de tubo de acetato de celulosa individuales. Centrifugar las muestras para recoger el extracto nasal filtrado en la parte inferior de los tubos de microcentrífuga.

Luego, retire las tazas y coloque los tubos en hielo. A continuación, transfiera 150 alícuotas de microlitros del extracto nasal a pocillos individuales de placas de almacenamiento de baja unión a proteínas y almacene las placas a menos 80 grados centígrados hasta el análisis. A continuación, se midió la concentración de los mediadores inmunitarios nasales de interés mediante una matriz multiplexada basada en electroquimioluminiscencia de alta sensibilidad de acuerdo con los protocolos de ensayo estándar.

En este análisis representativo de 620 neonatos, la mayoría de los mediadores inmunitarios medidos demostraron un bajo nivel de detección. Los niveles de IFN gamma estaban por debajo del límite inferior de detección en casi la mitad de las muestras, mientras que los niveles de TNF alfa, CCL4 y TGF beta estaban por debajo del límite inferior de detección en menos del 1% de las muestras. Se evidenció una fuerte multicolinealidad para los 20 niveles de mediadores detectados, como se ilustra en el mapa de calor.

En los neonatos asintomáticos infectados por picornavirus, se observó un perfil regulado al alza comprometido principalmente de mediadores inmunes tipo 1, lo que sugiere un papel desencadenante inmunológico de las bacterias y virus colonizadores en la primera parte de la vida. También se determinó una asociación entre la presencia de hermanos en el hogar al nacer y una respuesta inmune mucosa específica tipo 17 dirigida a la mucosa tipo 17, con evidencia de correlación de este fenómeno con un efecto de preparación inmune en el útero que se correlaciona inversamente con el tiempo transcurrido desde el último parto. Además, los niños nacidos de madres que recibieron suplementos altos en comparación con placebo se caracterizaron por una regulación positiva en mediadores inmunológicos específicos, lo que sugiere que la vitamina D promueve una respuesta inmune antibacteriana independiente de la inducida por virus, bacterias, hermanos o atopia materna.

Este método de micromuestreo también se puede utilizar a través de un broncoscopio, lo que permite estudiar los mediadores inmunes en las vías respiratorias inferiores. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo medir los mediadores en la mucosa de las vías respiratorias no estimuladas in vivo en neonatos y niños mayores.