Absorción de fluidos nasales y bronquiales: precisión muestras de la Mucosa respiratoria humana y laboratorio de procesamiento de muestras

Hoy vamos a demostrar la técnica de nasosorción, una forma de muestreo de mucosa de precisión que utiliza una matriz absorbente sintética para absorber el líquido del revestimiento de la mucosa. El muestreador de nasosorción consta de un mango y SAM en un tubo criogénico estéril. Los SAM se componen de polímeros, ya sea fibras o espuma, y están especialmente seleccionados para ser suaves y absorbentes, con una rápida absorción para la recolección de muestras.

Los SAM también tienen una unión mínima a proteínas, para permitir la elución eficiente de las secreciones absorbidas. La nasosorción es una técnica muy suave y no invasiva que se puede realizar en pacientes de todas las edades, incluidos los bebés. Además, es posible el muestreo en serie, incluso cada pocos minutos.

Al realizar la nasosorción, primero debe lavarse las manos y ponerse guantes, preferiblemente frente al paciente. Primero se inspecciona la cavidad nasal. Recomendamos el uso de una linterna frontal y que el clínico use su pulgar no dominante para retraer la nariz del paciente para visualizar la cavidad nasal.

Por lo general, no se requiere un espéculo nasal. Si nos fijamos en la cavidad nasal, las fosas nasales no son redondas en sección transversal y van rectas hacia atrás. Por lo general, el cornete inferior se ve como una protuberancia, una hendidura en la pared lateral de la fosa nasal, con el tabique nasal formando la pared medial lisa y plana.

Queremos tomar una muestra de este cornete inferior ya que el epitelio subyacente es un epitelio ciliado simple del tracto respiratorio. Durante el muestreo, la SAM de nasosorción se pasa suavemente por el lumen, orientándolo para que quede plano contra el cornete inferior. A continuación, utilice el dedo índice para presionar el SAM sobre la mucosa nasal.

Esto puede causar un ligero cosquilleo con posible lagrimeo a medida que se absorbe el FML. Por lo general, utilizamos una absorción temporizada de 60 segundos. A continuación, el dispositivo de nasosorción se retira de la fosa nasal, se vuelve a colocar en el tubo criogénico y puede almacenarse inmediatamente en hielo y luego congelarse.

Alternativamente, puede proceder inmediatamente a eluir el FML. La nasosorción se está estudiando en una variedad de modelos de provocación de la mucosa nasal y también en diferentes enfermedades de las vías respiratorias. Sin embargo, este método relativamente nuevo todavía requiere una validación formal frente a otros métodos de muestreo respiratorio.

La técnica de broncosorción utiliza una matriz absorbente sintética para muestrear el líquido del revestimiento mucoso del bronquio. El método es realizado por personal especializado a través de un broncoscopio de fibra óptica. El dispositivo de broncosorción consiste en un catéter hueco externo con una guía central de plástico.

Este tiene un SAM en el extremo que se puede extruir al activar la pieza de mano. Al igual que la nasosorción, la tira SAM es suave y absorbente con una rápida absorción para la recolección de muestras. También tiene una unión mínima a proteínas para permitir la elución eficiente de las secreciones absorbidas.

Antes de colocar el dispositivo de broncosorción en el broncoscopio, es habitual comprobar que la SAM está extruyendo y retirándose hacia el catéter con facilidad. A continuación, demostraremos el método de broncosorción utilizando un simulador de broncoscopia. Primero se realiza una broncoscopia estándar, pasando el broncoscopio por la tráquea, hasta el bronquio principal derecho y hasta el nivel del bronquio intermedio justo proximal a la división de los lóbulos inferior derecho y medio derecho.

Una vez insertado en este nivel, se siguen cinco pasos. Uno, el catéter hacia abajo. Insertar el catéter de broncosorción a través del canal de operación del broncoscopio hasta que la punta blanca sea visible en la vía aérea hasta un máximo de un centímetro distal al extremo del broncoscopio.

Mantenga el broncoscopio y la punta del catéter en el centro de la luz de las vías respiratorias. Tenga cuidado de minimizar el contacto entre la punta del catéter y la mucosa bronquial para reducir el riesgo de daño a la mucosa. Dos, SAM fuera.

Presione el mango del dispositivo de broncosorción para que la tira de SAM se extruya en la luz de la vía aérea del lóbulo medio derecho o inferior derecho. Bajo visión directa, doble la punta del broncoscopio para asegurarse de que la SAM esté en contacto con el líquido del revestimiento de la mucosa en la pared de las vías respiratorias. Deje la tira de SAM dentro de las vías respiratorias, plana contra la pared mucosa durante 30 segundos cronometrados.

Tres, SAM adentro. Bajo visión directa, retraiga el SAM directamente en el catéter. A medida que se retrae, asegúrese de que la sonda SAM húmeda esté recta.

Si es necesario, el catéter y la punta del broncoscopio se pueden llevar hacia atrás para enderezar el SAM. Si hay dificultad para retraer el SAM, retire todo el dispositivo con el SAM extruido fuera de las vías respiratorias. Cuatro, catéter colocado.

Extraiga todo el catéter del canal de operación del broncoscopio. Cinco, cortar a SAM. El SAM se corta con tijeras estériles, se coloca en un tubo criogénico y debe colocarse inmediatamente en hielo antes de congelarlo o eluirlo directamente.

El siguiente videoclip muestra la extrusión de un SAM en las vías respiratorias de un paciente que se somete a una broncoscopia de investigación. La broncosorción se está estudiando actualmente en una variedad de enfermedades pulmonares diferentes. Esperamos que este método de muestreo preciso de la mucosa resulte útil en la evaluación diagnóstica y en la estratificación y monitorización de los pacientes.

Procesamiento de laboratorio después de la nasosorción y broncosorción. La elución del fluido de revestimiento de la mucosa a partir de la matriz absorbente sintética. Hoy vamos a demostrar los principios generales del procesamiento de muestras de laboratorio después de las técnicas no invasivas de muestreo de mucosas de nasosorción y broncosorción.

En particular, demostraremos cómo eluimos la muestra de líquido de revestimiento de la mucosa de la matriz absorbente sintética. En el punto de recolección, las muestras deben colocarse en hielo para su transporte al laboratorio. Las muestras se pueden procesar inmediatamente o se pueden colocar directamente en el congelador en su tubo de muestra original para su elución en una fecha posterior.

Si se realiza un procesamiento inmediato, la muestra puede transferirse en hielo al laboratorio en su tubo de muestra original. O bien, el SAM puede separarse y colocarse en un tampón de elución en el punto de recolección y luego transferirse en hielo al laboratorio. Las muestras pueden permanecer en hielo, ya sea en un tampón o dentro de su tubo de muestra durante varias horas antes del procesamiento.

Un paso de lavado antes de la centrifugación y la elución por centrifugación del SAM tiene como objetivo optimizar el rendimiento de la muestra. Para lograr esto, el SAM se inserta en un tubo Eppendorf junto con el insecto de extracción deseado. A continuación, la muestra se mezcla en un mezclador de vórtice durante 30 segundos para lavar la SAM de los fluidos y biomoléculas sueltos.

Para garantizar la recuperación completa de la muestra, la elución por centrifugación se realiza añadiendo el SAM húmedo a un inserto de centrifugado dentro del mismo tubo Eppendorf utilizado para el lavado. Se deben usar pinzas limpias para este procedimiento y deben cambiarse entre muestras para evitar la contaminación. Este método utiliza la centrifugación para extraer el fluido del SAM.

Centrifugamos muestras durante 20 minutos a 16.000 g en una centrífuga enfriada a cuatro grados centígrados. El bugger de elución utilizado será determinado por la aplicación deseada. Por lo general, utilizamos tampón de ensayo de aminoácidos que contiene proteínas o tampón de lisis de ARN.

Se pueden utilizar dos tipos de filtro de centrifugado. El primero contiene solo una malla de plástico que mantiene el SAM en su lugar, lo que permite la elución completa de los fluidos. Alternativamente, si se trabaja con materiales infecciosos, se pueden utilizar filtros de centrifugación con un tamaño de poro de 0,2 micrómetros.

Estos filtros descontaminarán las muestras infectadas y son adecuados para muestras con sospecha de infección microbacteriana. Si se requieren tales filtros, es importante incluir un paso de preincubación en el que se permita que el tampón proteico penetre a través del filtro antes de agregar la muestra. Este paso minimiza la unión de los mediadores al filtro por absorción de proteínas inespecíficas.

El siguiente es un ejemplo de método utilizado por nuestro laboratorio para el procesamiento de nasosorción y broncosorción de muestras que no requieren un paso de descontaminación, incluidos los patógenos de clase dos. En el primer paso, el SAM se coloca en un Eppendorf que contiene el tampón y el vórtice adecuados durante 30 segundos. Para la nasosorción solemos utilizar 300 microlitros de tampón y para la broncosorción 100 microlitros.

En el segundo paso, el SAM se retira con pinzas y se coloca en un vaso de filtro de malla de plástico junto con el tampón utilizado para lavar el SAM. En el tercer paso, el vaso de filtro de malla de plástico que contiene el SAM se devuelve al Eppendorf original. En el cuarto paso, el Eppendorf que contiene la copa de filtro, el tampón y el SAM se centrifuga durante 20 minutos a 16.000 g a cuatro grados centígrados.

Después de la centrifugación, se retira y se desecha el vaso filtrante que contiene el SAM. A continuación, el eluido puede ser alícuota y congelado para su análisis en un momento posterior. El muestreo de nasosorción se ha aplicado a varios entornos de investigación respiratoria clínica.

Esto incluye mediciones de mediadores inflamatorios durante la exposición a alérgenos nasales, como la prostaglandina D2 y la interleucina 5. Es importante destacar que, en estos entornos de modelos de desafío, el muestreo por nasosorción permite un perfil cinético frecuente de los niveles de mediadores, donde el muestreo se puede repetir cada pocos minutos. La nasosorción también se ha utilizado durante un desafío de infección por rinovirus en sujetos sanos y asmáticos alérgicos, donde la nasosorción se repitió diariamente durante el período de estudio.

El uso de la nasosorción en el estudio permitió una caracterización sensible de las respuestas del interferón a la infección por rinovirus. Por último, hemos utilizado el muestreo de nasosorción para estudiar a los lactantes con bronquiolitis. En este estudio, la infección por el virus respiratorio sincitial se asoció con niveles más altos de mediadores inflamatorios, como el interferón gamma.

Es importante destacar que el muestreo con nasosorción permite la inclusión de un grupo de control sano en los estudios en lactantes. La broncosorción también se utilizó en el estudio de provocación con rinovirus en sujetos sanos y asmáticos alérgicos. Este estudio demostró aumentos significativos en los mediadores inflamatorios interferón gamma, ITAC, IL-10 e IL-5 en las vías respiratorias inferiores durante la infección por rinovirus.

La inclusión de esta técnica en los estudios de la vía aérea inferior crea la posibilidad de medir los niveles de mediadores, que podrían ser indetectables por métodos convencionales como el lavado broncoalveolar. En conclusión, el líquido del revestimiento de la mucosa se puede obtener de forma no invasiva y tiene un potencial emocionante para medir las respuestas inflamatorias en la infección y la inflamación. Los métodos de elución deben adaptarse de acuerdo con la naturaleza de las muestras y los parámetros que se van a medir.

En particular, la FML se puede utilizar para medir las citocinas y quimiocinas de la mucosa, las infecciones virales, la carga viral, las infecciones bacterianas y fúngicas, el microbioma y los anticuerpos de la mucosa. Por último, los métodos de muestreo y elución de la mucosa requerirán un desarrollo personalizado y una validación cuidadosa para cada proyecto.