Name: Absorción de fluidos nasales y bronquiales: precisión muestras de la Mucosa respiratoria humana y laboratorio de procesamiento de muestras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Aprende las técnicas de nasosorción y broncosorción para muestreo de fluido mucoso en vías respiratorias usando matrices absorbentes sintéticas. Estos métodos no invasivos mejoran el diagnóstico de enfermedades respiratorias.

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Financiación: Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto Imperial para centro de investigación biomédica investigación de la salud (NIHR) (BRC), la unidad NIHR de investigación de protección de salud (HPRU) en las infecciones respiratorias en el Imperial College de Londres en asociación Salud pública de Inglaterra (PHE) y el centro de investigación traslacional NIHR Imperial seguridad del paciente. Las opiniones expresadas son las de los autores y no necesariamente del NHS, el NIHR, el Departamento de salud o salud pública de Inglaterra.

Las técnicas utilizadas en el protocolo siguiente han sido aprobadas por el Comité de ética de investigación de Londres Oeste (número de referencia 15/lO/0444).
1. nasal absorción (NA)
<ol><li>
Preparación antes del muestreo de NA
	<ol>
<li>Al llevar a cabo NA, primero Lávese las manos y colóquese guantes, preferiblemente frente al paciente.</li>
		<li>Inspeccionar la cavidad nasal mediante una linterna de cabeza y que el clínico utilice su pulgar no dominante para retraer la nariz del paciente para visualizar la cavidad nasal. Nota: Un espéculo nasal no es generalmente necesario.</li>
		<li>Visualizar la cavidad nasal y cornete nasal antes de muestreo inferior. Nota: Las narinas (orificios nasales) no son redondas en corte transversal y van directamente hacia atrás. Generalmente, el cornete nasal inferior puede ser visto como un abultamiento o hendidura en la pared lateral de la fosa nasal, con el tabique nasal formando la pared lisa, plano medial. Queremos una muestra de este inferior cornete nasal, ya que el epitelio subyacente es un simple epitelio ciliado del tracto respiratorio44.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Muestreo de NA
	<ol>
<li>Cuando se muestrea, pasar el SAM NA suavemente hasta el lumen de la fosa nasal, orientar para ser plana contra el cornete nasal inferior.</li>
		<li>Pedir el donante que utilice el dedo índice para presionar el SAM en la mucosa nasal. NA puede causar un leve picor, con posible lagrimeo, como la FML es absorbido. Nota: En los adultos, generalmente realizamos NA 60 s.</li>
		<li>Después de la absorción de la FML, retire el dispositivo de NA de la fosa nasal y ponga en el tubo original.</li>
		<li>Procesar las muestras inmediatamente en el laboratorio o congelarlas, como se detalla más adelante en este protocolo. Nota: NA se está estudiando en una variedad de modelos de desafío mucosa nasal y también en enfermedades de vías respiratorias diferentes. Sin embargo, se debe realizar validación frente a otros métodos de toma de muestras respiratorias para cada población de estudio y el paciente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bronquial absorción (BA)
<ol><li>
Preparación antes del muestreo de BA Nota: BA se realiza por personal especializado en una suite de broncoscopia.<ol>
<li>Antes de colocar el dispositivo de BA por el catéter, compruebe que el SAM está sacando y retirarse hacia el catéter.</li>
		<li>Antes de realizar BA en un paciente, llevar a cabo un simulacro BA en un simulador de broncoscopia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Muestreo de BA
	<ol>
<li>Pasar el broncoscopio en la tráquea y el bronquio principal derecho al nivel del bronquio intermedio, justo proximal a la división en los lóbulos inferiores derecho y medios derecho. Nota: Nosotros normalmente la muestra desde el bronquio intermedio, aunque se pueden degustar otros sitios dentro de la vía aérea. Cuando se observa el catéter y SAM, uno no puede ver la punta del broncoscopio. Observamos los siguientes sencillos pasos para BA, una vez que el broncoscopio ha alcanzado el sitio de muestreo deseado.</li>
		<li>CATÉTER hacia abajo: Insertar el catéter BA a través del canal operativo del broncoscopio hasta que la punta blanca es apenas visible en la vía aérea, hasta un máximo de 1 cm distal al extremo del broncoscopio. Mantener la punta del broncoscopio y el catéter en el centro del lumen de la vía aérea. Tenga cuidado minimizar el contacto entre la punta del catéter y la mucosa bronquial para reducir el riesgo de abrasión de la mucosa.</li>
		<li>SAM OUT: Oprima la manija del dispositivo BA para que el SAM se saca en el lumen de la vía aérea del lóbulo medio o inferior derecho. Bajo visión directa, doblar la punta del broncoscopio para asegurarse de que el SAM está haciendo contacto con la FML en la pared de las vías respiratorias. Deja el SAM dentro de la vía aérea, plana en la pared mucosa de 30 s.</li>
		<li>SAM IN: Mire a través del broncoscopio para asegurar que la sonda SAM húmeda es recta y no doblada hacia atrás sobre el extremo del catéter. Si es necesario, la punta del catéter y broncoscopio puede ser traída detrás para enderezar el SAM. Bajo visión directa, retraerse el SAM recto suavemente hacia el catéter. Nota: Si hay dificultad para retraer el SAM en el catéter, retirar todo el dispositivo con SAM sacó detrás de las vías respiratorias.</li>
		<li>CATÉTER para arriba: Retire el catéter de todo desde el canal operativo del broncoscopio.</li>
		<li>CORTE SAM: SAM se corta con una tijera estéril y luego se pone en un criotubo en hielo. Estas muestras se pueden procesar con métodos diferentes, como se detalla más adelante en este protocolo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. procesamiento de muestras de BA y NA
Nota: Hay muchas opciones para el procesamiento de laboratorio de las muestras resultantes de NA y BA. Estos protocolos pretenden almacenar muestras para su posterior uso y eluir la muestra MLF del SAM.
<ol><li>
Opciones para el manejo inmediato de las muestras NA y BA
	<ol>
<li>Opción 1: Almacenar el SAM húmedo en hielo por unas horas antes de la transformación posterior.</li>
		<li>Opción 2: Inmediatamente congelación NA SAMs de la colección del tubo. Asimismo, congelar a BA SAMs en viales criogénicos después del retiro, con tijeras, desde el dispositivo de muestreo.</li>
		<li>Opción 3: Coloque el SAM separado en tampón de elución (300 μL) antes de procesar directamente o profunda congelación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opciones del tampón de elución para muestras NA y BA Nota: La elección del tampón de elución depende de lo que va a ser analizados en la muestra de la FML y sugerimos cuatro alternativas principales:<ol>
<li>Utilizar un tampón de ensayo preparados adecuado para procedimientos de inmunoensayo. Dichos buffers deben contener una pequeña cantidad de detergente (0.05%) así como de proteína, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA) al 1%.</li>
		<li>Como alternativa, utilizar un búfer que contiene una mayor cantidad de detergente, por lo que se produce la lisis celular. Nota: Usamos tampones conteniendo Triton X o NP40 en concentración del 1%. Búferes de lisis celular permiten citoquinas intracelulares y extracelulares se eluyen del SAM, y generalmente resultan en niveles más altos de citoquinas y quimioquinas. Estas reservas también deben contener proteínas y se componen con BSA al 1%.</li>
		<li>Para las mediciones de RNA, como PCR cuantitativa de RNA viral o medición RNA del anfitrión, añadir tampón de extracción de RNA directamente a SAM húmeda. Nota: Tampones de extracción de ARN caotrópico contienen Guanidinio que desnaturaliza las proteínas. Una alternativa es añadir tampón de extracción de RNA al fluido MLF eluído contenido en tampón de lisis de inmunoensayo o celular.</li>
		<li>Utilice solventes orgánicos como el ácido trifluoroacético, para la extracción de lípidos y metabolitos, para evaluación por espectrometría de masas. Nota: Detalles de estos reactivos se incluyen en la sección de materiales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Técnica de elución
	<ol>
<li>Para cualquiera de las anteriores técnicas de elución, inserte el SAM en un tubo de microcentrífuga de 2 mL, junto con el tampón de extracción deseado.</li>
		<li>Vórtice mezcle la muestra durante 30 s para lavar el SAM de fluidos ligeramente acoplados y biomoléculas.</li>
		<li>Para asegurar la recuperación completa de la muestra, realizar elución centrífuga añadiendo el SAM húmedo a una columna mini filtro spin que inserta en el mismo tubo de microcentrífuga de 2 mL utilizado para lavarse. Nota: Pueden utilizarse dos tipos de mini columna de spin filtro. La primera contiene sólo una malla de plástico, que mantiene el SAM en su lugar, que permite la elución completa de fluidos. Por otra parte, si trabaja con materiales infecciosos, utilizar filtros de spin con un tamaño de poro de 0,22 μm. Estos filtros esterilización muestras y son adecuados para las muestras con sospecha de infección por micobacterias. Sin embargo, estos filtros deben ser previamente incubados con buffer, para minimizar el atascamiento de mediadores al filtro por interacciones no específicas.</li>
		<li>Utilizar pinzas esterilizadas para transferir el SAM húmedo al filtro de centrifugado. Cambio de pinzas entre muestras para evitar la contaminación.</li>
		<li>Centrifugar las muestras por 20 min a 16.000 x g en una centrífuga mini enfriado a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocolo de ejemplo Resumen
	<ol>
<li>En el laboratorio, etiquetar 2 mL tubos de microcentrífuga para toma de muestra y añadir el volumen deseado de tampón de elución (normalmente 300 μL de NA; 100 μl de BA). Sello de la tapa y coloque en hielo.</li>
		<li>Muestreo (inmediatamente o en el laboratorio) el SAM es extraído del mango con unas pinzas y colocan en el búfer que contiene el tubo de la colección (producido en el paso anterior). Asegurar la tapa del tubo de microcentrífuga está bien cerrada y transferir las muestras en hielo al laboratorio para su posterior procesamiento.</li>
		<li>Quitar los tubos que contiene tampón SAM y elución de su mezcla transferencia recipiente y agitar durante 30 s.</li>
		<li>Utilizando pinzas estériles, eliminar SAM y colocar en una columna de vuelta (con o sin filtro de acetato de celulosa de 0.22 μm).</li>
		<li>Recoger el tampón de elución del tubo de colección y retener.</li>
		<li>Coloque la columna de spin, con SAM, en el tubo de colección original (o uno nuevo si filtrado estéril de muestras) y añadir tampón de colección para hacer girar la columna. De esta manera, el líquido de lavado pasará a través de la columna de vuelta hacia el tubo de la colección, a fin de eluir la muestra del SAM.</li>
		<li>Centrifugue las muestras con tapas selladas (16.000 x g, 20 min, 4 ° C).</li>
		<li>Extraer las muestras de la centrifugadora y colocar en un estante.</li>
		<li>Abrir la tapa sellada de los tubos y quite la columna de vuelta con el SAM. Dispone de columna de SAM y exprimido en un recipiente de residuos adecuado.</li>
		<li>Cuidadosamente los tubos alícuota el efluente contenido dentro del tubo en etiquetado criogénico. Registrar el volumen de eluyente y el volumen en cada alícuota.</li>
		<li>Transferir los tubos criogénicos cerrados a un congelador de-80 ° C y conservar en posición vertical hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Resultados de técnicas de muestreo de las vías respiratorias existentes son considerados como altamente variable; técnicas de muestreo alternativos son necesarios para estandarizar la investigación dentro de este campo5. NA BA permiten muestreo de la FML de forma no invasiva y tienen un potencial interesante para medir la respuesta inmune en sanas y enfermas de vías respiratorias. Estas técnicas ofrecen numerosas ventajas potenciales sobre las técnicas existentes, incluyendo una mayor tolerabilidad, velocidad de muestreo, la capacidad para repetir con frecuencia muestreo, menor variabilidad inter-usuario y disminuyeron la dilución de mediadores inmunes5 . La duración de la absorción y la técnica de procesamiento utilizada debe ser optimizada para cada estudio y rigurosamente mantenida entre eventos de muestreo. Además, en el caso de BA, el sitio de muestreo dentro de la vía aérea debe cuidadosamente replicarse entre individuos.
NA y sobre todo BA, son todavía relativamente novedosas técnicas para la investigación clínica. Sin embargo, los beneficios de estas técnicas han resultado de su uso en numerosos estudios, incluyendo validación cuidadosa frente a técnicas alternativas5. Estos dispositivos están disponibles como dispositivos de marcado CE listo para uso generalizado en la investigación respiratoria. Mientras que la NA y BA generar mucho menores volúmenes de muestra de técnicas de muestreo alternativos, mayores concentraciones obtenidas pueden resultar en una mayor sensibilidad para mediadores inmunes de baja abundancia.
Dependiendo de las aplicaciones de bajada deseadas, se pueden congelar directamente muestras NA y BA para posterior tratamiento, mejorar la factibilidad del estudio en un entorno de investigación clínica. El protocolo para el manejo de la muestra también se puede adaptar a aplicaciones particulares aguas abajo. Las técnicas de proceso propuesto pueden ser utilizadas para la colección de proteína o mediadores inmunes lípidos o ácidos nucleicos, pero deben ser optimizadas para cada estudio. En particular, FML puede ser eluido con buffers diferentes. En primer lugar, puede utilizarse buffer de inmunoensayo para medir anticuerpos6,45, mucosa citocinas y quimiocinas. Buffers con mayores niveles de detergente pueden utilizarse también para garantizar se produce lisis celular, permitiendo la inclusión de intracelular citoquinas. Extracción de ARN caotrópico buffers deben utilizarse para la determinación de la infección viral, viral de la carga, anfitrión mRNA y el microbioma. Alternativamente, pueden utilizarse disolventes orgánicos para anti-lípidos y espectrometría de masas.
En conclusión, la absorción directa de la FML de superficies de la mucosa es una técnica apasionante con potencial uso en enfermedades mucosa respiratorias, gastrointestinal, urogenitales y otros. Sin embargo, estas técnicas prometedoras de absorción requerirá validación precisa de muestreo y elaboración técnica para los ensayos individuales (biomarcadores) en cada ajuste de la enfermedad. Además, estas técnicas de muestreo mucosa precisión novela requerirá validación contra las muestras convencionales, como de sangre, aliento y esputo. Con estas técnicas, FML puede utilizarse para medir microbios, citocinas, quimiocinas, prostanoides y anticuerpos.

Mayoría de las enfermedades respiratoria causa una respuesta inflamatoria, y hay una necesidad urgente para el muestreo de la superficie de la mucosa respiratoria en rinitis alérgica, infecciones virales y fúngicas, tuberculosis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, pulmonar fibrosis y pulmón cáncer 1. Aspirado nasofaríngeo (NPA), el lavado nasal y lavado broncoalveolar (BAL) son técnicas comunes para el muestreo de las vías respiratorias superiores e inferiores. Sin embargo, estas técnicas presentan problemas considerables como pobre tolerabilidad, dilución de mediadores inflamatorios y la incapacidad para repetir con frecuencia de muestreo2. Una alternativa para el muestreo de NPA es el uso de hisopos, o nailon floqueado, algodón, o rayón3,4, pero estos también tienen limitaciones, ya que provocan malestar y daño para el epitelio nasal y en algún atascamiento irreversible de casos de mediadores inflamatorios5. Estas técnicas generalmente no pueden ser repetidas en serie más de una hora, y técnicas alternativas pueden ser más eficaces para la detección de baja abundancia citoquinas y quimioquinas5,6. Además, la variabilidad de usuario asociada con estas técnicas puede generar inconsistencias en los datos, dando como resultado la exigencia de grandes cohortes de pacientes.
Alternativomente, técnicas de absorción utilizando esponjas naturales y sintéticos se han utilizado para recoger MLF de superficies de la mucosa. Esponjas oftálmicas compuesto de celulosa natural (e.g., Weck-cel) se han utilizado para muestra saliva, cervical y secreciones vaginales7. Además, esponjas sintéticas de alcohol polivinílico (PVA) y acetato de polivinilo hidroxilado (HPVA) han sido utilizados8. Siete diferentes materiales absorbentes han sido comparados para el muestreo de fluido oral antes de medir anticuerpos9, mientras que mini-esponjas de poliuretano han sido utilizados para recoger lágrimas humanas10.
Papel de filtro de celulosa natural de la planta del algodón ha sido ampliamente utilizado para absorber las secreciones nasales desde el libro pionero de Alam y colegas en 199211,12,13,14, 15,16,17. Discos de papel filtro se han producido desde tarjetas de filtro (por ejemplo, Shandon) y se han utilizado para medir histaminas y citoquinas después de controlado retos alergénicos nasal y con exposición de alergeno natural18,19 ,20,21. Sin embargo, diferentes lotes de papel de filtro varían en su grado de unión a proteínas y algunas no liberan citoquinas. Métodos utilizando una matriz absorbente sintético (SAM), por lo tanto han sido desarrollados2,22,23. Sam ahora se utilizan generalmente para obtener MLF nasal por na Estos materiales absorbentes son cómodos de usar y puede obtener FML incluso de narices inflamadas a intervalos frecuentes durante largos períodos de tiempo.
Absorción nasal es una forma de toma de muestras de mucosa precisión utilizando un SAM para el muestreo de la FML en la vía aérea superior. NA dispositivos se fabrican como dispositivos médicos-marcado CE de materiales de grado médico, con habitaciones limpias y libres de polvo y alérgenos. El sampler de NA consiste en una manija y SAM en un criotubo estéril. El SAM consiste en polímeros, típicamente de las fibras, pero también está disponible como espuma y estas son seleccionadas para ser suave y absorbente, con rápido drenaje para recolección de muestras. Sam tienen Unión a proteínas mínimo para permitir la elución eficiente de absorberlos secreciones. NA es una técnica muy suave, no invasiva que puede realizarse en los donantes de todas las edades. Además, serie muestra, incluso cada pocos minutos, es posible. NA ha sido validado contra la vía aérea superior existente5 de técnicas de muestreo y muestreo repetitivo ha permitido la generación de datos cinéticos siguiendo el reto de la vía aérea con alérgeno23,24,25, 26 de la endotoxina bacteriana y viral tipo TLR agonistas (Jha, a. et al., manuscrito en preparación). NA también se ha utilizado en los niños a investigar la historia natural de atopia27,28,29 y en bronquiolitis viral30.
Bronchoscopic microsampling (BMS) es un procedimiento para la recolección de la FML en la vía aérea inferior que ha sido desarrollada por Olympus31,32,33. Desafortunadamente, este sistema BMS está autorizada sólo en Japón. Olympus fuente dos sistemas BMS: uno con un poliéster hidroxilado fibroso (FHPE) sonda34,35,36,37, y con un algodón probe33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. un gran obstáculo ha sido que la sonda BMS utilizada en pacientes con asma causado contacto mucosa, sangrado, con la mitad de todas las muestras contaminadas con sangre. Los autores concluyeron que no era factible muestra MLF usando este sistema BMS de vías aéreas periféricas en pacientes de asma43.
Como alternativa, hemos desarrollado BA con un SAM suave que se puede realizar durante la investigación bronchoscopic de las vías respiratorias inferiores, incluyendo después de la infección experimental de sujetos asmáticos con rinovirus6. El dispositivo BA consta de: un catéter hueco externo, una pieza de mano que en la activación permite extruir el SAM y un alambre de guía plástico central que tiene el SAM en su extremo. NA, kits de BA están fabricados de materiales de grado médico, con habitaciones limpias y libres de polvo y alérgenos. Además, los dispositivos son CE marcado y reciben gamma irradiadas. La banda de SAM es suave, absorbente y tiene rápido wicking para recogida de muestras. También tiene Unión a proteínas mínimo para permitir la elución eficiente de absorberlos secreciones. El dispositivo puede caber por el canal de trabajo de un broncoscopio y se puede utilizar para rápidamente y exactamente la muestra FML en sitios específicos de interés dentro de la vía aérea. A diferencia de BAL o BMS, BA no resulta en sangrado contacto o malestar adicional del paciente posterior al procedimiento.
Debe prestar cuidadosa atención al procesamiento de las muestras NA y BA. Las muestras pueden estar directamente congelados y procesados en lotes o se pueden procesar inmediatamente. El tipo de procesamiento puede ser adaptado hacia ciertas aplicaciones posteriores, incluyendo inmunoensayos para citoquinas, quimiocinas e inmunoglobulinas o elutions de viral, bacteriana, y célula huésped asociado RNA. Presentamos la colección clínica y laboratorio de técnicas de procesamiento asociadas a NA y BA como una guía para los investigadores clínicos.

<table><tbody><tr><td>Nasosorción (adulto, 7 mm de ancho)</td><td>Hunt Developments</td><td>NSFL-FXI-11</td><td>Hay diferentes tamaños disponibles para diferentes grupos de pacientes/edades.</td></tr><tr><td>Broncosorption</td><td>Hunt Developments</td><td>BSFL-FXI-11</td><td>Tamaño mínimo del canal del broncoscopio 2 mm; Longitud máxima de trabajo 815 mm</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Costar&nbsp; Spin-X&nbsp; filtros de tubo de centrífuga (sin membrana)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS9301-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Costar&nbsp; Spin-X&nbsp; filtros de tubo de centrífuga (membrana de 0,22um)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8160-24EA</td><td>Para la esterilización de muestras con riesgo de infección.</td></tr><tr><td>Tampón de ensayo (elución)</td><td>Millipore</td><td>AB-33k</td><td>No figura en el sitio web de Millipore, pero está disponible a través de empresas de investigación o de suministros de laboratorio generales, como Cedarlane. Contiene 0,05% Tween-20 y 1% BSA.</td></tr><tr><td>NP-40 Tampón de lisis celular</td><td>Life Technologies FNN0021</td><td></td><td>Añadir albúmina sérica bovina al 1% (p/v). Puede recuperar niveles más altos de mediador absoluto.</td></tr><tr><td>Tampón RLT (extracción de ARN)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Permite la recuperación de ARN de muestras de nasosorción y broncosorción.</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031-100ML-M</td><td>Para la elución de muestras que se utilizarán en aplicaciones de HPLC</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 2,0 ml Costar</td><td></td><td>3213</td> Se <td>requieren tubos de 2 ml para los filtros de tubo Spin-X, los tubos tradicionales de 1,5 ml no se ajustan a estos.</td></tr></tbody></table>

absorción de fluidos nasales y bronquiales: precisión muestras de la mucosa respiratoria humana y laboratorio de procesamiento de muestras

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Los métodos de absorción nasal (NA) y absorción bronquial (BA) utilizan matrices absorbentes sintéticos (SAM) para absorber el líquido de la mucosa de revestimiento (MLF) del tracto respiratorio humano. NA es una técnica no invasiva que absorbe el líquido desde el cornete nasal inferior y causa mínimas molestias. NA ha rendido resultados reproducibles con la capacidad de repetir con frecuencia el muestreo de las vías respiratorias superiores.
En comparación, otros métodos de muestreo de la mucosa respiratoria, como aspiración nasofaríngea (NPA) y vajillas convencionales, son más invasivos y pueden resultar en una mayor variabilidad de los datos. Otros métodos tienen limitaciones, por ejemplo, biopsias y procedimientos bronquiales son invasivos, esputo contiene muchos muertos y muriendo las células y requiere licuefacción, condensado de aire espirado (EBC) contiene agua y saliva y lavado las muestras son diluidas y variable.
BA se puede realizar a través del canal de trabajo de un broncoscopio en la clínica. El muestreo es bien tolerado y puede llevarse a cabo en múltiples sitios en la vía aérea. BA los resultados en muestras MLF siendo menos diluida que las muestras del lavado (BAL) broncoalveolar.
Este artículo demuestra las técnicas de NA y BA, así como el procesamiento de laboratorio de las muestras resultantes, que puede ser adaptada al deseada biomarcador aguas abajo se mide. Estas técnicas de absorción son alternativas útiles para las técnicas convencionales de muestreo utilizadas en la investigación clínica respiratoria.

NA se ha utilizado en un número de estudios para la fácil y no invasiva medir inflamación mucosa. Después de la administración del alergeno a la nariz, se observan niveles de prostaglandina-D2 (PGD2) que suben y bajan en minutos (figura 1), en consonancia con la degranulación de mastocitos (Thwaites et al., manuscrito en preparación). Además, los mediadores de la inflamación de tipo II, como IL-5 (figura 2, reimprimido con permiso de 24), pueden medirse en las horas siguientes alérgenos nasal reto23,24. En la infección experimental de asmáticos alérgicos y controles sanos, NA se utilizó para medir un grupo de mediadores, incluyendo el interferón-gamma (IFN-γ), en el transcurso de 7 días (figura 3, reimprimido con permiso de 6). Además, en la infección natural virus sincitial respiratorio (VSR) de los recién nacidos, NA demostrado RSV para asociarse con niveles elevados de citoquinas inflamatorias, tales como IFN-γ, en relación con la RSV no lactantes con bronquiolitis y controles sanos ( Figura 4, reimpreso con permiso de 30). Curiosamente, esta discriminación entre RSV y bronchiolitis de RSV no no fue significativa en muestras NPA tiempo comparable (figura 4).
BA también fue utilizado durante la infección experimental de asmáticos alérgicos con rinovirus. En el día 4 de infección por rinovirus, los niveles de IFN-γ, CXCL11, IL-10 e IL-5 fueron elevados desde el inicio (figura 5; A, B, C y D, respectivamente). Además, esta técnica demostró niveles elevados de IL-5 en el inferior de las vías respiratorias de asmáticos alérgicos durante la infección por rinovirus, en comparación con controles sanos (figura 5) (figura 5 reimprimido con permiso de 6).
Se obtuvieron estos resultados representativos de muestras eluidas utilizando tampón de ensayo que contenga 0.05% Tween-20 y 1% BSA (véase Tabla de materiales).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig1.jpg"> Figura 1 : Rápida generación y separación de prostaglandina-D2 después de desafío alergénico nasal. Los niveles de prostaglandina-D2 (PGD2) midieron de eluatos de absorción nasal en muestras seriales después de desafío alergénico nasal con polen de pasto Timothy (n = 5). Cada línea representa los datos de un individuo. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig2.jpg"> Figura 2 : Medición cinética de IL-5 después de desafío alergénico nasal. Producción de IL-5 en muestras de absorción nasal serial después de desafío alergénico nasal. Tres repetición estudios de desafío alergénico se llevaron a cabo, con los participantes (n = 19) recibieron placebo (azul), baja dosis (10 mg) oral prednisona (naranja), o prednisona oral de altas dosis (25 mg) (rojo) una hora antes de la administración del alergeno. Las líneas denotan la media geométrica y barras de error son intervalos de confianza del 95% de todos los participantes. (Figura reimpreso con permiso de perdidas et al., Inmunología Mucosal, 2017). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig3.jpg"> Figura 3 : Inducción de interferón-γ durante la infección por rinovirus. Durante la infección de adultos sanos (n = 11, azul) y asmáticos alérgicos (n = 28, rojo) con rinovirus-16, muestreo de la absorción nasal se utilizó para medir los niveles de interferón-γ (IFN-γ). Los datos se representan como parcelas A) crudo spaghetti de individuos y niveles B) medianos con barras de error que indica rangos intercuartil. (Figura reimpreso con permiso de Hansel et al. 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig4.jpg"> Figura 4 : Nasosorption discrimina interferón-γ elevada asociada a infección por RSV de los recién nacidos. Absorción nasal y aspiración nasofaríngea (NPA) fueron utilizados para medir los niveles de interferón-γ en lactantes con bronquiolitis asociada con infección por virus sincicial respiratorio (VSR) (rojo, n = 12), un patógeno respiratorio RSV no (verde, n = 12) y saludable controles (azul, n = 9). Los datos se analizaron con una prueba de Kruskall-Wallis Dunn corrección para comparaciones múltiples (***p&lt; 0,001). Líneas denota valores medianos y barras de error son rangos intercuartil. (Figura modificada con permiso de Thwaites et al. 30). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig5.jpg"> Figura 5 : Mediadores inflamatorios en muestras bronquiales absorción durante la infección por rinovirus. Después de la infección de rinovirus 16 de controles sanos (n = 10, azul) y voluntarios asmáticos alérgicos (n = 23, rojo), absorción bronquial fue utilizada para medir el nivel de A) IFN-γ, B) CXCL11, C) IL-10 y D) IL-5 al inicio del estudio y el día 4 de la infección. Datos analizados por Wilcoxon firmaron prueba rank (emparejadas muestras) y test de Mann-Whitney (muestras sin igual). Figura reimpreso con permiso de Hansel et al. 6 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este manuscrito describe el uso de técnicas de absorción nasal y bronquial, específicamente utilizando matrices absorbentes sintéticos (SAM) para el líquido de la mucosa de revestimiento (MLF) de la vía aérea superior e inferior de la muestra. Estos métodos proporcionan mejor estandarización y tolerabilidad que técnicas de muestreo respiratorias existentes.

Absorción de fluidos nasales y bronquiales: precisión muestras de la Mucosa respiratoria humana y laboratorio de procesamiento de muestras

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Hoy vamos a demostrar la técnica de nasosorción, una forma de muestreo de mucosa de precisión que utiliza una matriz absorbente sintética para absorber el líquido del revestimiento de la mucosa. El muestreador de nasosorción consta de un mango y SAM en un tubo criogénico estéril. Los SAM se componen de polímeros, ya sea fibras o espuma, y están especialmente seleccionados para ser suaves y absorbentes, con una rápida absorción para la recolección de muestras.Los SAM también tienen una unión mínima a proteínas, para permitir la elución eficiente de las secreciones absorbidas. La nasosorción es una técnica muy suave y no invasiva que se puede realizar en pacientes de todas las edades, incluidos los bebés. Además, es posible el muestreo en serie, incluso cada pocos minutos.Al realizar la nasosorción, primero debe lavarse las manos y ponerse guantes, preferiblemente frente al paciente. Primero se inspecciona la cavidad nasal. Recomendamos el uso de una linterna frontal y que el clínico use su pulgar no dominante para retraer la nariz del paciente para visualizar la cavidad nasal.Por lo general, no se requiere un espéculo nasal. Si nos fijamos en la cavidad nasal, las fosas nasales no son redondas en sección transversal y van rectas hacia atrás. Por lo general, el cornete inferior se ve como una protuberancia, una hendidura en la pared lateral de la fosa nasal, con el tabique nasal formando la pared medial lisa y plana.Queremos tomar una muestra de este cornete inferior ya que el epitelio subyacente es un epitelio ciliado simple del tracto respiratorio. Durante el muestreo, la SAM de nasosorción se pasa suavemente por el lumen, orientándolo para que quede plano contra el cornete inferior. A continuación, utilice el dedo índice para presionar el SAM sobre la mucosa nasal.Esto puede causar un ligero cosquilleo con posible lagrimeo a medida que se absorbe el FML. Por lo general, utilizamos una absorción temporizada de 60 segundos. A continuación, el dispositivo de nasosorción se retira de la fosa nasal, se vuelve a colocar en el tubo criogénico y puede almacenarse inmediatamente en hielo y luego congelarse.Alternativamente, puede proceder inmediatamente a eluir el FML. La nasosorción se está estudiando en una variedad de modelos de provocación de la mucosa nasal y también en diferentes enfermedades de las vías respiratorias. Sin embargo, este método relativamente nuevo todavía requiere una validación formal frente a otros métodos de muestreo respiratorio.La técnica de broncosorción utiliza una matriz absorbente sintética para muestrear el líquido del revestimiento mucoso del bronquio. El método es realizado por personal especializado a través de un broncoscopio de fibra óptica. El dispositivo de broncosorción consiste en un catéter hueco externo con una guía central de plástico.Este tiene un SAM en el extremo que se puede extruir al activar la pieza de mano. Al igual que la nasosorción, la tira SAM es suave y absorbente con una rápida absorción para la recolección de muestras. También tiene una unión mínima a proteínas para permitir la elución eficiente de las secreciones absorbidas.Antes de colocar el dispositivo de broncosorción en el broncoscopio, es habitual comprobar que la SAM está extruyendo y retirándose hacia el catéter con facilidad. A continuación, demostraremos el método de broncosorción utilizando un simulador de broncoscopia. Primero se realiza una broncoscopia estándar, pasando el broncoscopio por la tráquea, hasta el bronquio principal derecho y hasta el nivel del bronquio intermedio justo proximal a la división de los lóbulos inferior derecho y medio derecho.Una vez insertado en este nivel, se siguen cinco pasos. Uno, el catéter hacia abajo. Insertar el catéter de broncosorción a través del canal de operación del broncoscopio hasta que la punta blanca sea visible en la vía aérea hasta un máximo de un centímetro distal al extremo del broncoscopio.Mantenga el broncoscopio y la punta del catéter en el centro de la luz de las vías respiratorias. Tenga cuidado de minimizar el contacto entre la punta del catéter y la mucosa bronquial para reducir el riesgo de daño a la mucosa. Dos, SAM fuera.Presione el mango del dispositivo de broncosorción para que la tira de SAM se extruya en la luz de la vía aérea del lóbulo medio derecho o inferior derecho. Bajo visión directa, doble la punta del broncoscopio para asegurarse de que la SAM esté en contacto con el líquido del revestimiento de la mucosa en la pared de las vías respiratorias. Deje la tira de SAM dentro de las vías respiratorias, plana contra la pared mucosa durante 30 segundos cronometrados.Tres, SAM adentro. Bajo visión directa, retraiga el SAM directamente en el catéter. A medida que se retrae, asegúrese de que la sonda SAM húmeda esté recta.Si es necesario, el catéter y la punta del broncoscopio se pueden llevar hacia atrás para enderezar el SAM. Si hay dificultad para retraer el SAM, retire todo el dispositivo con el SAM extruido fuera de las vías respiratorias. Cuatro, catéter colocado.Extraiga todo el catéter del canal de operación del broncoscopio. Cinco, cortar a SAM. El SAM se corta con tijeras estériles, se coloca en un tubo criogénico y debe colocarse inmediatamente en hielo antes de congelarlo o eluirlo directamente.El siguiente videoclip muestra la extrusión de un SAM en las vías respiratorias de un paciente que se somete a una broncoscopia de investigación. La broncosorción se está estudiando actualmente en una variedad de enfermedades pulmonares diferentes. Esperamos que este método de muestreo preciso de la mucosa resulte útil en la evaluación diagnóstica y en la estratificación y monitorización de los pacientes.Procesamiento de laboratorio después de la nasosorción y broncosorción. La elución del fluido de revestimiento de la mucosa a partir de la matriz absorbente sintética. Hoy vamos a demostrar los principios generales del procesamiento de muestras de laboratorio después de las técnicas no invasivas de muestreo de mucosas de nasosorción y broncosorción.En particular, demostraremos cómo eluimos la muestra de líquido de revestimiento de la mucosa de la matriz absorbente sintética. En el punto de recolección, las muestras deben colocarse en hielo para su transporte al laboratorio. Las muestras se pueden procesar inmediatamente o se pueden colocar directamente en el congelador en su tubo de muestra original para su elución en una fecha posterior.Si se realiza un procesamiento inmediato, la muestra puede transferirse en hielo al laboratorio en su tubo de muestra original. O bien, el SAM puede separarse y colocarse en un tampón de elución en el punto de recolección y luego transferirse en hielo al laboratorio. Las muestras pueden permanecer en hielo, ya sea en un tampón o dentro de su tubo de muestra durante varias horas antes del procesamiento.Un paso de lavado antes de la centrifugación y la elución por centrifugación del SAM tiene como objetivo optimizar el rendimiento de la muestra. Para lograr esto, el SAM se inserta en un tubo Eppendorf junto con el insecto de extracción deseado. A continuación, la muestra se mezcla en un mezclador de vórtice durante 30 segundos para lavar la SAM de los fluidos y biomoléculas sueltos.Para garantizar la recuperación completa de la muestra, la elución por centrifugación se realiza añadiendo el SAM húmedo a un inserto de centrifugado dentro del mismo tubo Eppendorf utilizado para el lavado. Se deben usar pinzas limpias para este procedimiento y deben cambiarse entre muestras para evitar la contaminación. Este método utiliza la centrifugación para extraer el fluido del SAM.Centrifugamos muestras durante 20 minutos a 16.000 g en una centrífuga enfriada a cuatro grados centígrados. El bugger de elución utilizado será determinado por la aplicación deseada. Por lo general, utilizamos tampón de ensayo de aminoácidos que contiene proteínas o tampón de lisis de ARN.Se pueden utilizar dos tipos de filtro de centrifugado. El primero contiene solo una malla de plástico que mantiene el SAM en su lugar, lo que permite la elución completa de los fluidos. Alternativamente, si se trabaja con materiales infecciosos, se pueden utilizar filtros de centrifugación con un tamaño de poro de 0,2 micrómetros.Estos filtros descontaminarán las muestras infectadas y son adecuados para muestras con sospecha de infección microbacteriana. Si se requieren tales filtros, es importante incluir un paso de preincubación en el que se permita que el tampón proteico penetre a través del filtro antes de agregar la muestra. Este paso minimiza la unión de los mediadores al filtro por absorción de proteínas inespecíficas.El siguiente es un ejemplo de método utilizado por nuestro laboratorio para el procesamiento de nasosorción y broncosorción de muestras que no requieren un paso de descontaminación, incluidos los patógenos de clase dos. En el primer paso, el SAM se coloca en un Eppendorf que contiene el tampón y el vórtice adecuados durante 30 segundos. Para la nasosorción solemos utilizar 300 microlitros de tampón y para la broncosorción 100 microlitros.En el segundo paso, el SAM se retira con pinzas y se coloca en un vaso de filtro de malla de plástico junto con el tampón utilizado para lavar el SAM. En el tercer paso, el vaso de filtro de malla de plástico que contiene el SAM se devuelve al Eppendorf original. En el cuarto paso, el Eppendorf que contiene la copa de filtro, el tampón y el SAM se centrifuga durante 20 minutos a 16.000 g a cuatro grados centígrados.Después de la centrifugación, se retira y se desecha el vaso filtrante que contiene el SAM. A continuación, el eluido puede ser alícuota y congelado para su análisis en un momento posterior. El muestreo de nasosorción se ha aplicado a varios entornos de investigación respiratoria clínica.Esto incluye mediciones de mediadores inflamatorios durante la exposición a alérgenos nasales, como la prostaglandina D2 y la interleucina 5. Es importante destacar que, en estos entornos de modelos de desafío, el muestreo por nasosorción permite un perfil cinético frecuente de los niveles de mediadores, donde el muestreo se puede repetir cada pocos minutos. La nasosorción también se ha utilizado durante un desafío de infección por rinovirus en sujetos sanos y asmáticos alérgicos, donde la nasosorción se repitió diariamente durante el período de estudio.El uso de la nasosorción en el estudio permitió una caracterización sensible de las respuestas del interferón a la infección por rinovirus. Por último, hemos utilizado el muestreo de nasosorción para estudiar a los lactantes con bronquiolitis. En este estudio, la infección por el virus respiratorio sincitial se asoció con niveles más altos de mediadores inflamatorios, como el interferón gamma.Es importante destacar que el muestreo con nasosorción permite la inclusión de un grupo de control sano en los estudios en lactantes. La broncosorción también se utilizó en el estudio de provocación con rinovirus en sujetos sanos y asmáticos alérgicos. Este estudio demostró aumentos significativos en los mediadores inflamatorios interferón gamma, ITAC, IL-10 e IL-5 en las vías respiratorias inferiores durante la infección por rinovirus.La inclusión de esta técnica en los estudios de la vía aérea inferior crea la posibilidad de medir los niveles de mediadores, que podrían ser indetectables por métodos convencionales como el lavado broncoalveolar. En conclusión, el líquido del revestimiento de la mucosa se puede obtener de forma no invasiva y tiene un potencial emocionante para medir las respuestas inflamatorias en la infección y la inflamación. Los métodos de elución deben adaptarse de acuerdo con la naturaleza de las muestras y los parámetros que se van a medir.En particular, la FML se puede utilizar para medir las citocinas y quimiocinas de la mucosa, las infecciones virales, la carga viral, las infecciones bacterianas y fúngicas, el microbioma y los anticuerpos de la mucosa. Por último, los métodos de muestreo y elución de la mucosa requerirán un desarrollo personalizado y una validación cuidadosa para cada proyecto.

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Este video muestra cómo separar los neutrófilos de las secreciones traqueales utilizando un dispositivo microfluídico con canales en espiral. El dispositivo logra una separación eficiente basada en el tamaño de la celda mediante la utilización de diferentes espesores y canales de forma trapezoidal. La interacción entre las fuerzas da como resultado que los neutrófilos grandes se acumulen cerca de la pared interna, mientras que los eritrocitos y los agregados de mucina permanecen cerca de la...

Separación de neutrófilos sin etiquetas de la secreción traqueal mediante un canal de microfluídica en espiral

Este video demuestra la cuantificación de los niveles de mediadores inmunológicos en el extracto de líquido del revestimiento de la mucosa nasal humana neonatal. Un sistema de ensayo múltiplex basado en electroquimioluminiscencia mide estos mediadores evaluando la intensidad de la luz emitida cuando se excitan.

Cuantificación de los niveles de mediadores inmunitarios en el líquido de revestimiento de la mucosa humana

Células epiteliales nasales, obtenidas mediante biopsia raspadura superficial de voluntarios humanos, se expanden y se transfieren a insertos de cultivo de tejidos. Al llegar a la confluencia, las células se cultivan en la interfase aire-líquido, produciendo cultivos de células ciliadas y no ciliadas. Cultivos de células epiteliales nasales diferenciados proporcionan modelos experimentales viables para el estudio de la mucosa respiratoria.

El cultivo de células humanas epiteliales nasales en la interfase aire líquido

En este artículo se describen las técnicas de broncoscopia en el pulmón bovino en condiciones experimentales, es decir, la inoculación broncoscópicamente guiada, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial y biopsia pulmonar transbronquial.

La broncoscopia guiada visualmente, intrabronquial Inoculación e: El pulmón bovino en la Investigación Biomédica<em&gt; En Vivo</em&gt; Técnicas de Muestreo

Este protocolo describe una técnica no invasiva para la toma de muestras del líquido guarnición mucosa de las vías aéreas superiores. Puede ser utilizado para realizar la cuantificación de en vivo los niveles de mediadores de la proteína, tales como citoquinas y quimioquinas, en sujetos de todas las edades.

Muestreo no invasivo de revestimiento mucoso líquido para la cuantificación In Vivo de la vía aérea superior mediador inmune niveles

Aquí describimos la técnica de inducción de esputo. Este protocolo también explica el proceso para realizar un conteo diferencial y recoger sobrenadante de esputo esputo y las células para su posterior análisis.

Metodología para la inducción de esputo y el procesamiento de laboratorio

En esta investigación, se demuestra un método de separación libre de etiqueta neutrófilo de clínica las secreciones mediante la operación de circuito cerrado de la microfluídica inercial espiral. El método propuesto expandiría los ensayos clínicos en vitro para diversas enfermedades respiratorias.

Etiqueta-libre neutrófilo enriquecimiento de la secreción de la vía aérea paciente derivado mediante microfluídica inercial de lazo cerrado

Para garantizar un análisis funcional ciliar exitoso y de alta calidad para el diagnóstico de PCD, es esencial un método preciso y cuidadoso para el muestreo y procesamiento del epitelio respiratorio. Para continuar brindando el servicio de diagnóstico de PCD durante la pandemia de COVID-19, el protocolo de videomicroscopía ciliar se ha actualizado para incluir medidas adecuadas de control de infecciones.

Muestreo y procesamiento del cepillado nasal mediante videomicroscopía ciliar digital de alta velocidad: adaptación para la pandemia de COVID-19

Varios patógenos bacterianos pueden causar infecciones del tracto respiratorio y provocar graves problemas de salud si no se detectan con precisión y se tratan con prontitud. La detección rápida y precisa de estos patógenos a través de la amplificación isotérmica mediada por bucle proporciona una gestión y un control eficaces de las infecciones del tracto respiratorio en entornos clínicos.

Detección rápida de patógenos bacterianos que causan infecciones del tracto respiratorio inferior a través de la amplificación isotérmica mediada por bucle basada en chips microfluídicos

El presente protocolo describe un método novedoso para evitar la contaminación sanguínea en el líquido de lavado nasal (FLN) murino. Dado que este método garantiza la recolección de NLF sin contaminación de la sangre, permite detecciones más precisas de componentes inmunológicos y diversos patógenos respiratorios.

Recolección de líquido de lavado nasal murino sin contaminación de sangre

Este protocolo describe un método LAMP basado en un chip microfluídico completamente integrado que permite la detección, en un punto de atención, de 15 patógenos que causan infecciones del tracto respiratorio inferior en pacientes de UCI dentro de una hora.

Detección rápida en el punto de atención de patógenos causantes de infecciones del tracto respiratorio inferior en pacientes de la UCI

Aprende las técnicas de nasosorción y broncosorción para muestreo de fluido mucoso en vías respiratorias usando matrices absorbentes sintéticas. Estos métodos no invasivos mejoran el diagnóstico de enfermedades respiratorias.

Absorción de fluidos nasales y bronquiales: precisión muestras de la Mucosa respiratoria humana y laboratorio de procesamiento de muestras (Video) | JoVE Journal

Absorción de fluidos nasales y bronquiales: precisión muestras de la Mucosa respiratoria humana y laboratorio de procesamiento de muestras

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