Slice Patch Clamp técnica para analizar la plasticidad inducida por el aprendizaje

Hola, mi nombre es Dai Mitsushima. Aquí le mostraremos cómo hacer cortes de cerebro en animales entrenados comparando los datos de la pinza de parche en animales no entrenados. Podemos analizar la plasticidad sináptica inducida por el aprendizaje.

Hola, mi nombre es Hiroyuki Kida. En este experimento, investigamos el neuromecanismo del funcionamiento del motor mediante el uso de la prueba de la varilla del rotor. La prueba de la varilla del rotor es ampliamente utilizada para evaluar la cognición motora de los roedores.

La ventaja de este método es que podemos cambiar el nivel de descubrimiento durante la prueba aumentando la velocidad del rotador. Prueba de biela del rotor. Antes de la tarea del motor, el aparato de la varilla del rotor debe configurarse en modo de aceleración de 4 a 40 rpm durante 300 segundos.

Se hizo que las ratas realizaran diez intentos para cada prueba. En el intervalo de tiempo entre intentos fue de 30 segundos. Durante la primera sesión de entrenamiento, las ratas suelen caerse de la caña, incluso a bajas velocidades y, a veces, caminan en la dirección equivocada.

Sin embargo, después de repetir el entrenamiento, la rata puede caminar a una velocidad más alta. Al medir la latencia en la vara, podemos estimar el rendimiento de aprendizaje de la habilidad de la rata. Aquí podemos ver los resultados de la prueba de la barra del rotor.

Como se muestra en esta figura, dos días de entrenamiento son suficientes para adquirir la habilidad motora. En comparación con la latencia en la primera prueba, el análisis post hoc mostró una mejora significativa en la prueba final de los días de entrenamiento. Al medir la latencia en la vara, podemos estimar el rendimiento de aprendizaje de la habilidad de la rata.

A continuación, te mostraremos un test de evitación inhibitoria. Esta prueba es útil para analizar el rendimiento del aprendizaje contextual. El aparato de evitación inhibitoria consta de lados claros y oscuros separados por una trampilla.

Durante la sesión de entrenamiento, las ratas se colocan en el área iluminada y se les da un corto tiempo para que se aclimaten al entorno. Una vez que se abre la puerta, las ratas pueden entrar libremente en el área oscura a voluntad. Al entrar en la zona oscura, la puerta se cierra y las ratas reciben una descarga eléctrica leve durante dos segundos.

Después de ser devueltas a sus jaulas durante 30 minutos una vez finalizada la prueba, las ratas se colocan de nuevo en la zona iluminada del aparato. Treinta minutos después del choque, las ratas entrenadas mostraron consistentemente una latencia más larga antes de entrar en el área oscura. Aquí podemos ver los resultados de la prueba de evitación inhibitoria.

Después de la descarga eléctrica, las ratas aprendieron a evitar el área oscura y permanecer en el lado iluminado, lo que normalmente no preferirían. Esta tendencia a evitar el lado oscurecido indica la adquisición de recuerdos contextuales. Cortes de cerebro después del entrenamiento.

Antes de la incisión, enfriamos todas las tijeras, hemostáticos y vasos de precipitados con hielo picado. Aquí puedes ver nuestra preparación para la disección. La disección del cerebro debe realizarse lo más rápido posible.

Después de esto profundamente anestesiada, la rata se coloca en una bandeja poco profunda con hielo picado y se hace una incisión para abrir la cavidad abdominal. Después de la incisión del diafragma, se realiza otra incisión lateral. Para abrir la cavidad torácica, el cartílago costal debe cerrarse con un hemostático.

Después de exponer el corazón, se inserta una aguja de acero inoxidable de calibre 18 en la parte posterior del ventrículo izquierdo. La punta de la aguja debe ser visible a través de la pared de la aorta. Después de cortar el pabellón auricular derecho, se inicia la perfusión.

Asegúrese de que tanto la aguja como la jeringa se llenen primero con tampón de disección helado gaseado. Las burbujas de aire también deben eliminarse antes de la perfusión. Primero, corte en la parte posterior del cráneo.

Luego haz un corte lateral, seguido de un corte central para exponer el cerebro. Después de la disección, el cerebro debe colocarse en un tampón burbujeante y helado durante cinco minutos. Antes de proceder con la disección, el papel de filtro debe humedecerse con un tampón helado.

Luego, el cerebro se coloca en un escenario de acero inoxidable helado. El ángulo de la etapa de corte es crucial para garantizar un ángulo de corte correcto para el corte de cerebro. Un ángulo incorrecto podría cortar las neuronas piramidales objetivo.

Después de recortar, se debe colocar una gota de superpegamento en la etapa del vibratono. Para garantizar una adherencia ajustada, el exceso de tampón de disección debe eliminarse con un trozo de papel de filtro. Usando el vibratono, se pueden hacer rodajas delgadas de cerebro mantenidas en un tampón burbujeante y helado.

Nuestra área objetivo es la corteza motora primaria. El área del cerebro objetivo se puede recortar con unas tijeras Iris. La cámara de interfaz se puede fabricar utilizando un recipiente de plástico para alimentos.

La tapa de la cámara de interfaz es necesaria para contener el gas. Los cortes se observan con un microscopio infrarrojo DIC. Aquí podemos ver un ejemplo de neuronas de capa 2/3 en la corteza motora primaria.

Las pipetas de registro de parches se llenan con la solución intracelular adecuada. La solución para el análisis de la pinza amperimétrica es diferente del análisis de la pinza amperimétrica. Resultados representativos.

La técnica de pinza de corriente es útil para analizar las propiedades intrínsecas de las células. Después del entrenamiento con la barra del rotor, pudimos obtener los datos de la pinza de corriente de las neuronas de capa 2/3 en la corteza motora primaria. El panel A indica las trazas típicas inducidas por las inyecciones de corriente.

El panel B indica la relación entre la corriente inyectada y el número de picos. Las ratas entrenadas de un día indujeron menos picos, mientras que las ratas entrenadas de dos días indujeron muchos más picos que las ratas no entrenadas. Como se puede ver en los paneles inferiores, las ratas entrenadas durante un día exhibieron un potencial de reposo más bajo, un umbral de pico más alto y una hiperpolarización posterior más profunda.

Las ratas entrenadas durante dos días mostraron un mayor potencial de reposo y resistencia a la membrana. La técnica de pinza de voltaje es útil para analizar la plasticidad sináptica inducida por el aprendizaje. Aquí, podemos ver datos de las neuronas CA1 después del entrenamiento contextual.

Obtuvimos corrientes postsinápticas en miniatura de neuronas CA1 inducidas por vesículas individuales de glutamato o GABA. Los paneles A y B muestran trazas representativas de corriente postsináptica en miniatura. En presencia de tetrodotoxina, se midieron secuencialmente en las mismas neuronas EPSCs en miniatura a menos 16 milivoltios y IPSCs en miniatura a cero milivoltios.

El panel C muestra gráficos bidimensionales de las amplitudes EPSC en miniatura e IPSC en ratas no entrenadas, entrenadas, no apareadas y de paso. El panel D muestra los gráficos de las frecuencias en miniatura. Como se puede ver en los paneles inferiores, los entrenamientos contextuales fortalecieron significativamente las sinapsis excitadoras e inhibidoras, promoviendo la diversidad de entradas sinápticas a las neuronas.

En resumen, la técnica de pinza de corriente es útil para analizar los cambios inducidos por el aprendizaje en las propiedades de la célula. Además, la técnica de fijación de voltaje es una herramienta poderosa para analizar la plasticidad inducida por el aprendizaje en las sinapsis excitatorias e inhibidoras. Los resultados detallados de estos análisis se pueden encontrar en las siguientes publicaciones.