Slice Patch Clamp técnica para analizar la plasticidad inducida por el aprendizaje

Hola, mi nombre es Dai Mitsushima. Aquí les mostraremos cómo preparar cortes cerebrales en animales entrenados mediante la comparación de datos de registro de voltaje en células de animales no entrenados. Podemos analizar la plasticidad sináptica inducida por el aprendizaje.

Hola, mi nombre es Hiroyuki Kida. En este experimento, investigamos el neuromecanismo de la locomoción motora mediante la prueba del palo giratorio. La prueba del palo giratorio se utiliza ampliamente para evaluar la cognición motora de los roedores.

La ventaja de este método es que podemos modificar el nivel de descubrimiento durante la prueba aumentando la velocidad del rotador. Prueba del cilindro rotatorio. Antes de la tarea motora, el aparato del cilindro rotatorio debe configurarse en modo de aceleración de 4 a 40 rpm durante 300 segundos.

Se hizo que las ratas realizaran diez intentos para cada prueba. El intervalo de tiempo entre intentos fue de 30 segundos. Durante la primera sesión de entrenamiento, las ratas generalmente caen del cilindro, incluso a bajas velocidades, y a veces caminan en la dirección incorrecta.

Después de repetir el entrenamiento, sin embargo, la rata puede caminar a una velocidad mayor. Al medir la latencia en la barra, podemos estimar el rendimiento del aprendizaje de la habilidad por parte de la rata. Aquí podemos ver los resultados de la prueba de la barra rotatoria.

Como se muestra en esta figura, dos días de entrenamiento son suficientes para adquirir la habilidad motora. En comparación con la latencia en el primer ensayo, el análisis post hoc mostró una mejora significativa en el ensayo final de los días de entrenamiento. Al medir la latencia sobre la barra, podemos estimar el rendimiento del aprendizaje de la habilidad en la rata.

A continuación, le mostraremos una prueba de evitación inhibitoria. Esta prueba es útil para analizar el rendimiento del aprendizaje contextual. El aparato de evitación inhibitoria consta de lados claro y oscuro separados por una trampilla.

Durante la sesión de entrenamiento, se colocan las ratas en el área iluminada y se les da un breve tiempo para acostumbrarse al entorno. Una vez que se abre la puerta, las ratas pueden entrar libremente al área oscurecida. Al ingresar al área oscurecida, se cierra la puerta y se administra a las ratas una descarga eléctrica leve durante dos segundos.

Después de regresar a sus jaulas durante 30 minutos tras la finalización del ensayo, las ratas se colocan nuevamente en el área iluminada del aparato. Treinta minutos después del shock, las ratas entrenadas mostraron de forma consistente una latencia más larga antes de entrar en el área oscura. Aquí podemos ver los resultados de la prueba de evitación inhibitoria.

Después del shock eléctrico, las ratas aprendieron a evitar el área oscurecida y permanecer en el lado iluminado, el cual normalmente no preferirían. Esta tendencia a evitar el lado oscurecido indica la adquisición de memorias contextuales. Cortes cerebrales posteriores al entrenamiento.

Antes de la incisión, enfriamos todas las tijeras, pinzas hemostáticas y vasos con hielo picado. Aquí puede ver nuestra preparación para la disección. La disección cerebral debe realizarse lo más rápidamente posible.

Después de que el ratón esté profundamente anestesiado, se coloca en una bandeja poco profunda con hielo triturado y se realiza una incisión para abrir la cavidad abdominal. Después de la incisión del diafragma, se realiza una incisión lateral adicional. Para abrir la cavidad torácica, el cartílago costal debe pinzarse firmemente utilizando un hemostato.

Después de exponer el corazón, se inserta una aguja de acero inoxidable de calibre 18 en la parte posterior del ventrículo izquierdo. La punta de la aguja debe ser visible a través de la pared de la aorta. Después de cortar la aurícula derecha, se inicia la perfusión.

Asegúrese de que tanto la aguja como la jeringa estén primero llenas con tampón de disección frío con gas y hielo. Cualquier burbuja de aire también debe eliminarse antes de la perfusión. Primero, corte en la parte posterior del cráneo.

Luego realice un corte lateral, seguido de un corte central para exponer el cerebro. Tras la disección, el cerebro debe colocarse en tampón frío con hielo burbujeante durante cinco minutos. Antes de continuar con la disección, el papel de filtro debe humedecerse con tampón frío con hielo.

Luego, el cerebro se coloca sobre una plataforma de acero inoxidable fría con hielo. El ángulo de la plataforma de corte es crucial para garantizar un ángulo adecuado de corte del cerebro. Un ángulo incorrecto podría cortar potencialmente las neuronas piramidales objetivo.

Después de recortar, se debe colocar una gota de pegamento instantáneo sobre la plataforma del vibrátomo. Para garantizar una adhesión firme, se debe eliminar el exceso de tampón de disección utilizando un trozo de papel de filtro. Usando el vibrátomo, se pueden obtener cortes finos de cerebro mantenidos en un tampón frío con burbujas de gas.

Nuestra área objetivo es la corteza motora primaria. El área cerebral objetivo se puede separar usando tijeras de iris. La cámara de interfaz se puede fabricar utilizando un recipiente plástico para alimentos.

La tapa de la cámara de interfase es necesaria para contener el gas. Las secciones se observan utilizando un microscopio infrarrojo-DIC. Aquí podemos ver un ejemplo de neuronas de la capa 2/3 en la corteza motora primaria.

Los micropipetas para registro de parche se llenan con la solución intracelular adecuada. La solución para el análisis en régimen de corriente constante es diferente de la utilizada para el análisis en régimen de voltaje constante. Resultados representativos.

La técnica de fijación de corriente es útil para analizar las propiedades intrínsecas de la célula. Después del entrenamiento en la barra rotatoria, pudimos obtener los datos de fijación de corriente de neuronas de la capa 2/3 en la corteza motora primaria. El panel A muestra trazos típicos inducidos por inyecciones de corriente.

El panel B indica la relación entre la corriente inyectada y el número de potenciales de acción. Las ratas entrenadas durante un día indujeron menos potenciales de acción, mientras que las ratas entrenadas durante dos días indujeron muchos más potenciales de acción que las ratas no entrenadas. Como puede observarse en los paneles inferiores, las ratas entrenadas durante un día exhibieron un potencial de reposo más bajo, un umbral de disparo más alto y una hiperpolarización posterior más profunda.

Las ratas entrenadas durante dos días exhibieron un potencial de reposo más alto y una resistencia de la membrana mayor. La técnica de bloqueo de voltaje es útil para analizar la plasticidad sináptica inducida por el aprendizaje. Aquí, podemos observar datos de neuronas CA1 tras el entrenamiento contextual.

Obtuvimos corrientes postsinápticas miniatura de neuronas CA1 inducidas por vesículas individuales de glutamato o GABA. Los paneles A y B muestran trazos representativos de corrientes postsinápticas miniatura. En presencia de tetrodotoxina, se midieron secuencialmente en las mismas neuronas las EPSC miniatura a menos 16 milivoltios y las IPSC miniatura a cero milivoltios.

El panel C muestra gráficos bidimensionales de las amplitudes de los EPSC miniatura y de los IPSC miniatura en ratas no entrenadas, entrenadas, no apareadas y de grupo control. El panel D muestra los gráficos para las frecuencias miniatura. Como puede observarse en los paneles inferiores, los entrenamientos contextuales fortalecieron significativamente tanto las sinapsis excitatorias como las inhibidorias, promoviendo la diversidad de las entradas sinápticas hacia las neuronas.

En resumen, la técnica de fijación de corriente es útil para analizar los cambios inducidos por el aprendizaje en las propiedades celulares. Asimismo, la técnica de fijación de voltaje es una herramienta potente para analizar la plasticidad inducida por el aprendizaje en sinapsis excitadoras e inhibitorias. Los resultados detallados de estos análisis pueden encontrarse en las siguientes publicaciones.