A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

El objetivo general de este procedimiento es realizar grabaciones de fijación de parche de hasta 12 celdas en modo de celda completa. Esto se logra marcando primero la posición de cada célula de interés y asignando una pipeta a cada célula. El segundo paso es localizar la punta de cada pipeta y mover automáticamente las pipetas junto a sus células asignadas.

A continuación, acérquese a cada célula con una pipeta a la vez. Para establecer sellos herméticos con la membrana celular, el paso final es romper la membrana de las células y realizar registros de células completas. En última instancia, el registro de pinzas de parche de electrodos múltiples asistido por computadora se utiliza para mostrar las propiedades de la red de pequeños circuitos neuronales con alta resolución.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el patch clamp manual, es que el número de conexiones que se pueden observar en una red crece con el cuadrado del número de neuronas que se están registrando. La demostración visual de esta técnica es importante porque los pasos de la fijación del parche pueden ser difíciles de aprender debido a la complejidad y la velocidad a la que deben realizarse. Comience este procedimiento colocando un corte de cerebro con la región de interés en el centro del rango de desplazamiento del microscopio.

A continuación, identifique las celdas de interés. A continuación, guarde la posición de las células en función del sistema de coordenadas del microscopio. La interfaz gráfica mostrará las células seleccionadas, así como las micropipetas para una visión general global, y el software añadirá un marcador en la posición de la célula que se superpondrá a las imágenes.

Además, se captura una imagen de la celda para referencia futura. Después de seleccionar las celdas de interés, asigne las pipetas que se utilizarán para registrar las celdas individuales configurando los controles de asignación en la interfaz gráfica. Visualice una vista previa de la configuración final seleccionando la casilla de verificación mostrar posiciones finales.

Ahora prepare las pipetas con solución intracelular y colóquelas en sus soportes. Coloque las etapas de la cabeza en sus fijaciones, pero no las deslice hacia adelante. Para evitar tocar el baño con la punta de la pipeta, active el control de presión positiva y seleccione todas las pipetas.

Para asegurarse de que las puntas permanezcan limpias, deslice suavemente cada etapa de la cabeza en su lugar. A continuación, coloque el microscopio en una posición central con un enfoque de dos milímetros por encima del corte presionando el botón R dos mientras mantiene presionado el botón A. Utilice la posición correspondiente para cada manipulador almacenada desde el experimento anterior presionando el botón L dos mientras mantiene presionado el botón A.At este punto, debe haber una sombra distintiva de la pipeta a la vista o un pequeño movimiento a lo largo del eje de las pipetas debería ser suficiente para observarlo. La compensación de las ligeras diferencias en la forma de la pipeta debe realizarse manualmente.

A continuación, coloque la punta de la pipeta. A continuación, coloque la punta en el punto rojo central de la pantalla de vídeo. Sin mover el microscopio, informe al software de que la pipeta está en el centro de la pantalla pulsando el botón Z mientras mantiene pulsado el botón C del controlador.

Una vez localizada la punta de pipeta individual, envíela hacia atrás para que se pueda localizar la siguiente pulsando el botón L uno mientras mantiene pulsado el botón a. Una vez que todas las puntas de pipeta se han localizado con precisión y cada pipeta se atribuye a una célula. Coloque automáticamente las pipetas cerca de sus respectivas celdas simplemente haciendo clic con el botón derecho del ratón en el centro del grupo de celdas en la ventana de representación gráfica y seleccionando la opción clúster en el menú emergente.

En la ventana de opciones del clúster, seleccione todas las pipetas que desee colocar en este momento y haga clic en Ir con las pipetas marcadas. Repita este procedimiento para cada grupo de celdas de interés. Para realizar el enfoque final, especifique la posición de las pipetas en relación con las células a 200 micras de distancia de la célula en el eje de la pipeta y 200 micras por encima de ella en la dirección vertical, lo que es suficiente para mantener la punta de la pipeta fuera del tejido.

A continuación, espere hasta que finalice el posicionamiento de las pipetas. A continuación, mueva el microscopio hacia la pipeta pulsando el botón R one mientras mantiene pulsado el botón C.Recalibre cada posición de la pipeta enfocando el microscopio en su punta en cualquier lugar de la pantalla de vídeo y pulsando el botón B mientras mantiene pulsado el botón C.Debería aparecer brevemente una cuadrícula que indique la posición identificada de la pipeta. Si la posición no es correcta, coloque la punta en el punto central de la pantalla de video y presione el botón Z mientras mantiene presionado el botón C del controlador.

Ahora confirme que la celda de interés para la pipeta actual está marcada correctamente, marcada activamente. De lo contrario, mueva el microscopio para que coincida con la celda de interés con el punto rojo central, marque la celda presionando el botón Y mientras mantiene presionado el botón C. Luego presione el botón L dos mientras mantiene presionado el botón C.To coloque la pipeta a 200 micras de distancia de su celda asignada, el microscopio se moverá automáticamente a la posición correspondiente. Ajuste la posición de la pipeta para que coincida con el punto rojo.

A continuación, ajuste el desplazamiento de la pipeta pulsando el botón R one. Mientras mantiene presionado el botón x. Active el pulso de prueba pulsando el botón L one mientras mantiene pulsado el botón x.

Después de eso, mueva lentamente la pipeta a su celda atribuida. Al observar la formación de un hoyuelo en la superficie de la membrana de la célula, aplique un breve pulso de presión negativa presionando el botón Y mientras mantiene presionado el botón Z para permitir que la presión aplicada llegue a la celda. En este punto se debe establecer un potencial de retención de aproximadamente 65 milivoltios negativos presionando el botón L dos mientras se mantiene presionado el botón x.

Una vez que se forma un sello giga para cada celda, comience a romper las membranas aplicando presión negativa. A continuación, utilice el sistema de adquisición de estimulación para realizar la grabación. Aplique pulsos o trenes de pulsos en celdas individuales una a la vez y observe las respuestas de las celdas restantes para mapear la conectividad entre estas celdas registradas.

Una vez finalizadas las grabaciones, retire las pipetas lentamente del tejido haciendo clic con el botón derecho del ratón en el botón de radio de la mesa. Seleccione pipetas de retroceso de 500 micras para que las pipetas retrocedan una distancia corta a lo largo de sus ejes. A continuación, observe la deriva en el potencial de las células para retroceder las pipetas todo el camino de regreso.

Establezca la velocidad de posicionamiento en rápida y repita la misma operación, pero elija la opción todo. Retire las pipetas usadas deslizando suavemente hacia afuera las etapas del cabezal y desenroscando las pipetas de los soportes. Este es un ejemplo de redes de conexiones sinápticas directas mapeadas en experimentos individuales.

Estos tres diagramas de conectividad son conjuntos de 12 células parametálicas registradas en la capa cinco con sus respectivas distancias intersomáticas. Y aquí está el diagrama de conectividad superpuesto a la tinción morfológica de las células parametálicas registradas. Esta figura muestra el efecto de vecino común.

Las columnas azules indican los pares de neuronas que están conectadas simultáneamente al menos a otra neurona en la red muestreada. Exhiben una probabilidad significativamente mayor de estar interconectados. Aquí se muestra que los pares de neuronas que comparten múltiples vecinos comunes ocurren con más frecuencia de lo esperado por casualidad en las redes muestreadas, la probabilidad de conexión dentro de los pares de neuronas aumenta en función del número de vecinos comunes compartidos por el pagador.

Estas propiedades, a su vez, dan lugar a pequeñas redes agrupadas en mundos. Esta figura muestra la cuantificación del reclutamiento de células Martin. Esta es una representación gráfica de una celda parametálica en rojo que forma sinapsis en una celda Martin nty en azul, que a su vez forma sinapsis en una segunda celda parametálica.

En el supraumbral negro, la estimulación de la célula parametálica conduce al reclutamiento de la célula Martin-nty. A través de la integración de potenciales postsinápticos excitatorios facilitadores, la célula Martin nty reclutada inhibe la segunda célula parametálica. Este diagrama representa la estimulación de un número cada vez mayor de células parametálicas sujetas por parches y los efectos sobre otra célula parametálica.

Aquí están los potenciales postsinápticos inhibitorios promediados registrados por una célula parametálica en función del número de otras células parametálicas cercanas que son estimuladas. La amplitud de la inhibición sináptica de DYS en un circuito local tiende a saturarse cuando se estimulan nueve o más células parametálicas y la fracción de células que reciben inhibición sináptica de DYS aumenta rápidamente a una a medida que se estimula un número creciente de células parametálicas. Al intentar este procedimiento, es importante mantener limpias las puntas de las pipetas y minimizar la distorsión del tejido evitando los vasos sanguíneos y otras células durante la fase de abordaje.

Siguiendo este procedimiento, se pueden emplear métodos adicionales, como la fotoestimulación, para abordar cuestiones adicionales, como la innovación de las células de pinza parcheadas por otro tipo de célula. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo acelerar y realizar el procedimiento de fijación de parches para múltiples neuronas.