Aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales
31 de julio de 2017
Este protocolo describe la forma de llevar a cabo automático de imágenes guiadas por pinzas de abrazadera experimentos utilizando un sistema desarrollado recientemente para estándar de equipos de electrofisiología in vitro .
El objetivo general de esta tecnología consiste en utilizar la visión por computadora para detectar automáticamente células fluorescentes y realizar el registro por parche automatizado de estas células en cortes cerebrales agudos. Este método puede ayudar a superar dificultades clave en el campo de la electrofisiología por registro de parche, como la identificación, el posicionamiento y el registro por parche de células marcadas con fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica es que puede detectar automáticamente pipetas de registro, células fluorescentes e integrar los pasos con el registro por parche automático.
Esta innovación aumenta significativamente el rendimiento experimental. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de trastornos neurológicos, ya que el registro automatizado de parches guiado por imágenes de alto rendimiento puede utilizarse para cribados farmacológicos en preparaciones neuronales más fisiológicas. Este método también puede aplicarse a otras preparaciones in vitro, como orgánulos neuronales típicos, cultivos de cortes, neuronas disociadas, así como a cualquier tipo de células no neuronales.
Para comenzar este procedimiento, encienda el amplificador, el controlador del microscopio y el controlador del manipulador. A continuación, ejecute Autopatcher IG con Python desde un terminal de línea de comandos cambiando primero al directorio donde está instalado Autopatcher IG. Luego, escriba Python Autopatcher_IG.
PYW en la terminal de línea de comandos y presione la tecla Intro. A continuación, llene completamente la pipeta de vidrio con la solución interna y colóquela en la etapa de registro. Mueva la punta de la pipeta al campo visual del microscopio y enfoque.
Si se utiliza el teclado numérico para mover los manipuladores en la platina del microscopio, actualice las coordenadas presionando la tecla Z del teclado. La calibración principal convierte el ángulo y la distancia de movimiento del manipulador al sistema de coordenadas del microscopio. El manipulador se desplaza en tres direcciones con una distancia preestablecida y el software detecta las coordenadas de la punta de la pipeta dentro del campo visual del microscopio.
Haga clic en el botón de inicio de calibración en la interfaz gráfica principal para la unidad correspondiente en la que se ha cargado la pipeta. Posteriormente, guarde la calibración haciendo clic en guardar calibración en la parte inferior de la interfaz gráfica principal. Esta calibración primaria solo es necesario realizarla una vez, a menos que se modifique la configuración física del sistema.
En este paso, coloque una sección cerebral en el centro de la cámara de registro. Estabilice la sección cerebral con un sujeción para secciones o con una parrilla. Para detectar la célula fluorescente, localice el área de interés bajo una ampliación de cuatro veces.
A continuación, mueva la platina del microscopio activando el modo de desplazamiento con clic y haga clic en el centro del área de interés. Alternativamente, utilice el teclado numérico para mover la platina del microscopio. A continuación, cambie al objetivo de alta magnificación y ajuste el enfoque moviendo el microscopio en el eje Z utilizando RF en el teclado numérico.
El software dirige al microscopio y a la cámara para tomar una serie de imágenes a diferentes profundidades. Luego, estas imágenes se someten a un procesamiento mediante visión por computadora para detectar células marcadas con fluorescencia. El resultado final es una lista de coordenadas de las células detectadas.
Haga clic en el botón de detección de células en la unidad de la columna principal de la GUI, cero. Si la fuente de luz LED o láser del montaje no puede controlarse mediante la señal TTL, encienda manualmente el LED o láser. Apague el LED o láser si es necesario.
Una lista de coordenadas celulares aparecerá en la interfaz gráfica de posiciones de memoria. Elimine las células no deseadas de la lista haciendo clic en el botón X junto a las coordenadas. Alternativamente, si las células objetivo no están marcadas con fluorescencia, haga clic en el modo de ratón en la interfaz gráfica principal.
A continuación, haga clic en la célula de interés; aparecerá un punto amarillo con un número sobre la célula y las coordenadas de esta aparecerán en la interfaz gráfica de posiciones de memoria. Para realizar la calibración secundaria con el fin de detectar las coordenadas de desplazamiento de la micropipeta, llene 1/3 de una micropipeta de vidrio con solución interna. Luego, coloque la micropipeta en el porta-pipetas acoplado al cabezal.
Con baja ampliación, utilice uno y dos del teclado numérico para cambiar entre la unidad uno y la unidad dos. A continuación, introduzca la pipeta en el campo visual y ajuste el enfoque utilizando el teclado numérico. Después, cargue la calibración principal haciendo clic en cargar calibración.
Cambie el objetivo del microscopio a alta magnificación y haga clic 40 veces en la interfaz gráfica principal. Acerque la punta de la pipeta al centro. Luego, haga clic en el botón de calibración secundaria en la interfaz gráfica principal, debajo de la unidad que está en uso.
Para hacer un parche en una celda objetivo, haga clic en el botón de control de parche para abrir la interfaz gráfica de usuario (GUI) de control de parche. Haga clic en el botón ir a junto a la celda de interés en la lista de coordenadas de la GUI de posición de memoria. Posteriormente, haga clic en el botón CTM de la unidad en la GUI principal para habilitar el movimiento.
Haga clic en la célula de interés para mover la punta de la pipeta hacia la célula. Debido a las limitaciones mecánicas del manipulador, cuando se recorran distancias superiores a 500 micrómetros, puede haber un pequeño error de posicionamiento. Para evitar un error mecánico considerable de posicionamiento, se debe realizar una calibración secundaria cerca de la célula objetivo.
A continuación, utilice el botón de unidad seleccionada para cambiar la señal de entrada entre las dos unidades. Haga clic en el botón de parche en la interfaz gráfica de control de parche. Comenzará el parcheo automático y se podrá monitorear la presión y la resistencia en la interfaz gráfica de control de parche.
El algoritmo de parcheo automático monitorea la resistencia y controla la presión mediante una serie de bucles lógicos, para formar un gigasello. Una ventana emergente notifica la formación del gigasello. El sistema utiliza el cambio de resistencia para reconocer el contacto con la superficie celular.
En caso de que el contacto con la superficie celular no se detecte a tiempo, utilice el botón siguiente para avanzar a la siguiente etapa del parcheo manteniéndose en el mismo ensayo de parcheo automático. Manipule el proceso automático en cualquier momento haciendo clic en los botones correspondientes de la interfaz gráfica de control de parcheo. Luego, seleccione sí para iniciar con la combinación de impulso eléctrico (Zap) y succión.
Alternativamente, seleccione no para romper con succión únicamente. Luego, guarde el registro del parche del experimento. Esta figura muestra las ubicaciones seleccionadas cargadas en la interfaz gráfica de secuencia de comandos.
La columna izquierda muestra la lista de coordenadas y la columna derecha muestra la lista de comandos en forma de señales TTL para cada ubicación. A continuación se presentan las capturas de pantalla durante el experimento de aplicación del fármaco, correspondientes a las tres ubicaciones seleccionadas. La solución de KCL se mezcló con un colorante fluorescente rojo con el fin de visualización.
La unidad uno era la pipeta que contenía KCL y la unidad dos era la pipeta para el registro de parche. En esta figura, las inyecciones de corriente escalonada muestran una neurona de disparo regular. Aquí se muestran los trazos del registro en clamping de voltaje tras la aplicación local de una solución de cloruro de potasio 500 milimolar en tres ubicaciones.
El trazo rojo con corriente entrante se registró durante el ensayo cuando la aplicación de cloruro de potasio estuvo cerca de la célula de parche. La flecha roja indica el momento de la aplicación de cloruro de potasio. Mediante este método, se puede realizar un ensayo de registro de parche en menos de cuatro minutos sin necesidad de una formación extensa, en comparación con el registro manual.
Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la optogenética, la quimio-genética y manipulaciones farmacológicas para responder preguntas relacionadas con su proyecto de investigación. Tras su desarrollo, esta técnica podría allanar el camino para que los investigadores en el campo de las neurociencias exploren estudios de alto rendimiento de receptores sinápticos y canales iónicos en diferentes preparaciones in vitro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos automatizados de registro por parche guiados por imágenes.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para realizar experimentos automatizados de registro por parche guiados por imágenes, utilizando tecnología avanzada de visión por computadora. Este enfoque mejora la eficiencia para identificar y dirigirse a células marcadas con fluorescencia en cortes cerebrales agudos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Electrofisiología
- Neurociencia
- Técnicas de imagen
Antecedentes
- La electrofisiología con parche de membrana es fundamental para estudiar la actividad neuronal.
- La identificación y el enfoque en células específicas pueden ser difíciles.
- Las técnicas automatizadas pueden mejorar el rendimiento experimental.
- La marcación fluorescente facilita la identificación de células.
Objetivo del estudio
- Automatizar la detección de células fluorescentes para experimentos de registro con parche.
- Aumentar la eficiencia de los registros electrofisiológicos.
- Facilitar los cribados farmacológicos en preparaciones neuronales.
Métodos Utilizados
- Tecnología de visión por computadora para la detección de células.
- Configuración automatizada de registro por patch-clamp.
- Integración de los procesos de detección y registro.
- Aplicación a diversas preparaciones neuronales in vitro.
Resultados Principales
- Automatización exitosa de la identificación celular y del registro de parches.
- Aumento del rendimiento en experimentos electrofisiológicos.
- Aplicaciones potenciales en investigación farmacológica.
- Versatilidad en la aplicación a diferentes tipos celulares.
Conclusiones
- Esta técnica mejora significativamente la eficiencia experimental.
- Aborda desafíos clave en los métodos tradicionales de registro de parche.
- El enfoque tiene implicaciones para la investigación de trastornos neurológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El parche automatizado guiado por imágenes aborda las limitaciones de rendimiento en la electrofisiología neuronal, permitiendo la validación funcional escalable de canales iónicos y receptores sinápticos como dianas terapéuticas. Esta capacidad respalda los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al reducir la variabilidad técnica y aumentar la densidad de datos en campañas de identificación de compuestos líderes. El método mejora la confianza predictiva en la validación de dianas al proporcionar lecturas electrofisiológicas cuantitativas y reproducibles a partir de preparaciones neuronales fisiológicamente relevantes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la medición directa de la excitabilidad neuronal y las propiedades sinápticas en células marcadas con fluorescencia.
- Valor operativo: Reduce la dependencia de operadores expertos, estandarizando la realización del registro de parche entre usuarios y centros.
- Valor predictivo: Aumenta el rendimiento de datos por experimento, favoreciendo el rigor estadístico en estudios de interacción con el blanco y mecanismos de acción.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayos: Genera preparaciones neuronales estandarizadas adecuadas para campañas de cribado farmacológico y genético posteriores.
- Salida cuantitativa: Proporciona mediciones en tiempo real de resistencia y presión que permiten la detección automatizada de la formación del sello y la optimización del proceso.
- Escalabilidad: Permite el direccionamiento multiplexado de múltiples células por corte, aumentando la densidad experimental sin incrementos proporcionales en el tiempo del operador.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Facilita el estudio de fenotipos neuronales en cortes cerebrales agudos, manteniendo la conectividad neuronal nativa y el contexto fisiopatológico.
- Continuidad traslacional: Conecta la electrofisiología de descubrimiento con la validación preclínica al permitir lecturas consistentes entre diferentes sistemas modelo.
- Reducción del riesgo mecanicista: Permite la evaluación directa de los efectos de compuestos sobre la función de canales iónicos y los patrones de disparo neuronal en tejido intacto.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de biología de descubrimiento como un paso de validación funcional posterior a la identificación del blanco y anterior a la optimización del fármaco líder, proporcionando confirmación electrofisiológica del acoplamiento al blanco en entornos neuronales nativos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis al permitir el registro automatizado y de alta fidelidad de la actividad neuronal en respuesta a perturbaciones farmacológicas o genéticas.
- Selección: Mejora la reproducibilidad y capacidad de análisis, permitiendo la evaluación sistemática de bibliotecas de compuestos sobre la excitabilidad neuronal y la transmisión sináptica.
- Análisis: Proporciona lecturas electrofisiológicas cuantitativas (por ejemplo, frecuencia de potenciales de acción, resistencia de entrada, relaciones corriente-voltaje) que informan sobre las relaciones estructura-actividad y la selectividad del blanco.
- Investigación Traducional: Mantiene la relevancia fisiológica mediante el registro de neuronas en cortes cerebrales agudos, preservando los perfiles de expresión nativos y las señales del microambiente.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad electrofisiológica reutilizable aplicable en diversos programas de descubrimiento en neurociencia dirigidos a canales iónicos, receptores acoplados a proteínas G (GPCR) y proteínas sinápticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en la validación del blanco mediante la medición directa y cuantitativa de la función neuronal en preparaciones fisiológicamente relevantes.
- Valor operativo: Aumenta el rendimiento experimental y reduce la variabilidad mediante la automatización de la detección de células, el posicionamiento y la ejecución del registro por parche.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más rápidas de avance o interrupción del proyecto al generar datos funcionales sólidos desde las primeras etapas del proceso de descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de blancos basándose en la modulación electrofisiológica confirmada en circuitos neuronales relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología, integración de visión por computadora y manejo de micromanipuladores para la configuración y solución de problemas del sistema.
- Depende de una etiqueta fluorescente estable, una preparación adecuada de las pipetas de registro y un control ambiental para mantener sanos los cortes tisulares.
- Necesita protocolos de software y procedimientos de calibración estandarizados para garantizar la reproducibilidad entre experimentos y usuarios.
- La adaptación a tipos celulares no neuronales o disociados puede requerir ajustes en los algoritmos de detección y en los parámetros de formación del sello.
- Las limitaciones prácticas incluyen errores mecánicos de posicionamiento a grandes distancias de desplazamiento y la dependencia de relaciones óptimas de señal-ruido fluorescente para una detección celular confiable.
