Name: Aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprende la técnica de patch-clamp automatizado guiado por imágenes para electrofisiología en cortes cerebrales agudos. Este método mejora la eficiencia experimental y facilita el cribado farmacológico en preparaciones neuronales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Whitehall. Nos gustaría agradecer a Samuel T. Kissinger por los valiosos comentarios.

1. Configuración del sistema <ol><li> Construir la unidad de control de presión. <ol><li> Monte la unidad de control de presión de acuerdo con el mapa de circuitos ( Figura 1 ). Soldar las piezas necesarias en la placa de circuito impreso (PCB) fabricada de acuerdo con los esquemas de circuitos eléctricos ( Figura 1b ). Utilice resistencias estándar, LED, Transistores de campo-Eficiencia de semiconductores de metal-óxido (MOSFET), condensadores y conectores (consulte la Tabla de materiales ). Solde las válvulas de solenoide en la PCB. Conecte la bomba de aire y el sensor de presión de aire a la PCB con un cable eléctrico. NOTA: La construcción de la unidad de control de presión debe tomar alrededor de 2 h con todas las piezas necesarias disponibles. </li></ol></li><li> Conecte la tarjeta de adquisición de datos secundarios (DAQ). <ol><li> Conecte las salidas de datos de la placa de circuito impreso a la tarjeta DAQ, siguiendo la Tabla 1 . NOTA: La tarjeta de DAQ wilL estar funcionando en &quot;Single-ended mode&quot;. El mapa de puertos se puede encontrar en el manual del usuario (ver la Tabla de Materiales ). </li><li> Conecte &quot;AIn Pr S&quot; a uno de los canales de entrada analógica (AI) y &quot;R-Gr&quot; a uno de los motivos analógicos en la placa DAQ secundaria. </li><li> Conecte la salida primaria del amplificador a uno de los canales AI y la tierra a la tierra analógica de la tarjeta DAQ secundaria. NOTA: Se puede utilizar un cable BNC estándar para conectar la salida primaria del amplificador. </li><li> Desmonte el otro extremo y conecte la señal positiva ( es decir, el núcleo de cobre) al canal AI y la tierra ( es decir, el cable delgado alrededor del núcleo) a la tierra analógica. Repita este paso para un segundo canal si se utiliza más de un canal de parche. NOTA: La entrada analógica de la tarjeta DAQ se configurará en pasos posteriores. </li><li> Conecte la alimentación a la salida de potencia de la tarjeta DAQ secundaria. Utilice una alimentación de 12 VPara la bomba. </li></ol></li><li> Conecte el tubo. <ol><li> Conectar la bomba de aire y las dos válvulas de acuerdo con la Tabla 2 . Utilice un conector de 3 vías para conectar el tubo blando desde el puerto superior de la válvula 2, el sensor de presión y el soporte de la pipeta en el último paso. </li><li> Añada otro conector de 3 vías al tubo conectado al soporte de la pipeta si se usan dos pipetas. Cambie manualmente entre las válvulas y las pipetas que se usan al aplicar parches. </li></ol></li><li> Instalar el Autopatcher IG. NOTA: Requisitos del sistema: Autopatcher IG sólo se probó en un PC con Windows 7. No se ha validado para otros sistemas operativos. El procedimiento descrito se aplica específicamente al hardware enumerado en la Tabla de Materiales. <ol><li> Descargue Autopatcher-IG desde GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG). </li><li> Instale Python (consulte la Tabla de materiales para la versión y la dirección de descarga). </li><li> Desinstalar el PyQt4Biblioteca &quot;, escribiendo&quot; pip uninstall PyQt4 &quot;en un terminal de línea de comandos. NOTA: El sistema utiliza una versión anterior de la biblioteca PyQt4 para lograr la compatibilidad con las bibliotecas Qwt y Opencv. </li><li> Instale las bibliotecas de Python de los archivos históricos de la rueda (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Encuentre los archivos siguientes: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) y Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl). <ol><li> Para instalar los archivos de rueda, vaya al directorio donde se guardan los archivos y escriba &quot;pip install *** wheelfilename ***. Whl.&quot; Sustituya &quot;*** wheelfilename ***&quot; con el nombre real del archivo. NOTA: &quot;cp27&quot; en el nombre de archivo de rueda indica Python 2.7 y &quot;win32&quot; indicó Windows de 32 bits. Si &quot;win32&quot; no funciona, pruebe &quot;win64&quot;. </li></ol></li><li> Para controlar la cámara CCD, descargue e instale el instaladorPara 64 bits (https://www.qimaging.com/support/software/). A continuación, descargue MicroManager para 64 bits (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) para controlar la cámara en Python. </li><li> Para controlar los manipuladores y la etapa del microscopio, instale el software de control proporcionado por el fabricante. NOTA: Al hacer esto, también se instala el controlador necesario para controlar los manipuladores. El paquete de instalación se suministra normalmente en un CD-ROM. </li><li> Para controlar la placa DAQ secundaria, instale la biblioteca universal desde el CD-ROM, que se suministra con la compra de la tarjeta DAQ. </li></ol></li><li> Configure el hardware para Autopatcher IG. <ol><li> Conecte la etapa del microscopio y los controladores del manipulador a la computadora a través de los puertos USB. </li><li> Asigne números de puerto COM a la unidad 0: etapa del microscopio, unidad 1: manipulador izquierdo, y unidad 2: manipulador derecho, en este orden, en el archivo de configuración &quot;ports.csv&quot; en la carpeta &quot;configuration&quot;. LGuardan los otros parámetros en el archivo ports.csv ( es decir, &quot;SCI&quot; ​​y &quot;1&quot;) sin cambios. NOTA: La información del número de puerto COM se puede encontrar ejecutando el software de configuración del manipulador proporcionado por el fabricante. Vaya a la pestaña &quot;Configuración&quot;, seleccione &quot;Configuración&quot; y la página &quot;Movimiento&quot;, y lea las etiquetas de cada ficha en la parte superior. Alternativamente, esta información se puede encontrar en el Administrador de dispositivos de PC. </li><li> Asigne números de canal de entrada analógica en la tarjeta DAQ para un sensor de presión y los canales de parche 1 y 2 (correspondientes a la unidad 1 y 2). Introduzca el número de canal en el archivo &quot;DAQchannels.csv&quot; en la carpeta &quot;configuration&quot;. NOTA: Se recomienda abrir los archivos .csv con la aplicación Bloc de notas en lugar de una hoja de cálculo, ya que puede alterar la información al guardar los cambios. </li></ol></li><li> Ejecutar Autopatcher IG. <ol><li> Encienda el amplificador, el controlador del microscopio y el controlador del manipulador. EnsuQue el software del amplificador está funcionando. </li><li> Ejecute Autopatcher IG con Python desde un terminal de línea de comandos de la siguiente manera: primero, cambie el directorio (comando &quot;cd&quot; para la mayoría de terminales comunes) donde está instalado Autopatcher IG, escriba &quot;python Autopatcher_IG.pyw&quot; en el terminal de línea de comandos y pulse el botón &quot;Introducir clave. NOTA: No ejecute el software de control del manipulador antes de ejecutar Autopatcher IG porque ocupará la etapa del microscopio y el manipulador, haciendo que Autopatcher IG no pueda encontrar el hardware. El software de control del manipulador se puede ejecutar después de que Autopatcher IG se inicia completamente si hay módulos adicionales que se deben controlar ( por ejemplo, el calentador en línea). </li></ol></li><li> Calibre la pipeta primaria. <ol><li> Tire de las pipetas de parche como se describe anteriormente 9 . Llenar una pipeta de vidrio con solución interna y cargarla en la cabeza. NOTA: Las pipetas de vidrio vacías tienen diferentes contrastesEl microscopio y puede conducir a una calibración incorrecta. </li><li> Mueva la punta de la pipeta al campo visual del microscopio y póngala en foco. Si se utiliza el teclado de marcación para mover los manipuladores y / o la etapa del microscopio, actualice las coordenadas presionando &quot;z&quot; en el teclado. NOTA: Esta acción no es necesaria si el teclado (eje del microscopio: A / D - eje x, eje W / S - y, eje R / F - z, manipuladores: H / J - eje y, O / L - eje z, 1/2 - número de unidad) se utiliza para controlar el movimiento porque las coordenadas se actualizarán en tiempo real. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Iniciar calibración&quot; en la interfaz gráfica de usuario principal (GUI) para la unidad correspondiente en la que se carga la pipeta ( Figura 2 ). NOTA: Una ventana emergente aparecerá cuando finalice la calibración. NOTA: La calibración se llevará a cabo automáticamente, lo que tomará aproximadamente 3,5 min. Haciendo clic en el mismo botón (cambiado ahora a &quot;cancelar calibración&quot;Que inicia la calibración) abortará el intento de calibración. </li><li> Guarde la calibración haciendo clic en &quot;guardar calibración&quot; en la parte inferior de la GUI principal (guarda la calibración actual para ambos manipuladores y se puede cargar en el futuro). NOTA: El campo de visión con una ampliación baja (4 o 10X) y alta (40X) debe estar alineado para que la calibración secundaria funcione correctamente. Consulte el manual de usuario del sistema óptico en uso para los procedimientos de alineación. </li></ol></li></ol> 2. Procedimiento automático de la abrazadera del remiendo <ol><li> Preparar rebanadas cerebrales agudas, como se describió anteriormente 10 . </li><li> Prepare pipetas de vidrio para la abrazadera de parche. </li><li> Coloque una rebanada de cerebro en el centro de la cámara de grabación. Estabilice la rebanada con una rebanada de sujeción, o &quot;arpa&quot;. </li><li> Detectar la célula fluorescente. <ol><li> Encuentre el área de interés debajo de la lente 4X. Mueva la etapa del microscopio encendiendo cliCk-to-move (&quot;CTM&quot;) y haga clic en el centro del área de interés. Alternativamente, utilice el teclado para mover la platina del microscopio (A / D - eje x, W / S - eje y, R / F - eje z). </li><li> Cambie a la lente de gran aumento y ajuste el enfoque moviendo el microscopio en el eje z, usando R / F en el teclado. NOTA: Se recomienda ajustar el nivel del baño de agua para que el plano focal bajo las lentes de aumento alto y alto sea igual o similar en el eje z. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Detectar celda&quot; en la columna GUI principal, &quot;Unidad 0.&quot; Si el LED o la fuente de luz láser de la configuración no pueden ser controlados por la señal TTL, encienda manualmente el LED / láser; Aparecerá una ventana emergente cuando se complete la detección de celdas. <ol><li> Apague el LED / láser si es necesario; Aparecerá una lista de coordenadas de celda en la GUI &quot;Posiciones de memoria&quot;. Elimine las celdas no deseadas de la lista haciendo clic en el botón &quot;X&quot; junto a las coordenadas. </li><li>Alternativamente, si las células objetivo no están marcadas con fluorescencia, haga clic en &quot;Modo ratón&quot; en la GUI principal. Haga clic en la celda de interés; Aparecerá un punto amarillo con un número en la celda y las coordenadas de la celda aparecerán en la GUI de &quot;Memory positions&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Calibrar la pipeta secundaria. <ol><li> Llene 1/3 de una pipeta de vidrio con solución interna. Cargue la pipeta en el soporte de la pipeta unido a la cabeza. </li><li> Utilice la lente de baja ampliación. Coloque la pipeta en el campo visual y ajuste el enfoque utilizando el teclado (H / K - eje x, U / J - eje y, eje O / L - z). Utilice &quot;1&quot; y &quot;2&quot; para cambiar entre la unidad 1 y la unidad 2. </li><li> Cargue la calibración primaria haciendo clic en &quot;Cargar calibración&quot;. Haga clic en el botón &quot;Calibración secundaria&quot; en la GUI principal debajo de la unidad que está en uso. Por ejemplo, si la unidad 2 está en uso, haga clic en el botón &quot;Calibración secundaria&quot; de laColumna Siga las instrucciones de la ventana emergente para cambiar a la lente de gran aumento. </li></ol></li><li> Parche una célula objetivo. <ol><li> Asegúrese de que el software &quot;MultiClamp&quot; ( es decir, amplificador) esté funcionando. Haga clic en el botón &quot;Patch control&quot; para abrir la GUI del &quot;Patch Control&quot;; Puede tardar hasta unos minutos en abrir esta GUI. </li><li> Utilice la lente de ampliación 40X marcando &quot;40X&quot; en la columna GUI principal &quot;Unidad 0&quot;. Haga clic en el botón &quot;ir a&quot; situado junto a la celda de interés en la lista de coordenadas en la GUI &quot;Memory position&quot; (posición de memoria); El microscopio se moverá a la célula. </li><li> Haga clic en el botón CTM de la unidad en uso en la GUI principal para activar el movimiento con un clic del ratón. Haga clic en la celda de interés; La punta de la pipeta se moverá a la celda. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Parche&quot; en la GUI &quot;Control de parches&quot;. NOTA: Se iniciará el parcheo automático y se podrá controlar la presión y la resistencia enEl &quot;Control de parches&quot; GUI. <ol><li> Utilice el botón &quot;Unidad 1 seleccionada&quot; para cambiar la señal de entrada entre las dos unidades. NOTA: El sistema se aproximará a la célula objetivo, aplicará presión negativa, ajustará el potencial de la membrana celular y detectará la formación de la gigasa basándose en una serie de umbrales de presión y resistencia y lógica. </li><li> Manipule el proceso automático en cualquier punto haciendo clic en los respectivos botones de la interfaz gráfica de &quot;Control de parches&quot;. Por ejemplo, haga clic en el botón &quot;Parche&quot; de nuevo para cancelar la prueba de parches y haga clic en &quot;Próxima etapa&quot; para avanzar el proceso de parcheado al siguiente paso, independientemente del umbral. NOTA: Una ventana emergente notificará al usuario cuando se haya formado un gigaseal, y se presentará la opción de aplicar zap junto con una presión negativa grande. </li></ol></li><li> Seleccione &quot;Sí&quot; para romper con zap combinado y succión. Alternativamente, seleccione &quot;No&quot; para romper con succión solamente. <br/&gt; NOTA: Cuando se haya completado un patch de celda completa con éxito, una ventana emergente le recordará al usuario que guarde el registro de parches del experimento. </li><li> Guarde el registro de revisiones del experimento. NOTA: Si una prueba de parche no tiene éxito, una ventana emergente notificará al usuario y se reiniciará el proceso de revisión. </li><li> Vuelva al paso 2.4 y repita los pasos con una celda diferente. </li></ol></li><li> Refinar los umbrales de parcheo (opcional). NOTA: Umbrales para el rango inicial de resistencia de la pipeta, presión positiva y negativa, resistencia gigasca, etc. Se puede modificar desde un archivo de configuración. <ol><li> Abra el archivo &quot;PatchControlConfiguration.csv&quot; en la carpeta &quot;Configuración&quot; en el destino donde está instalado el sistema. Cambie los números correspondientes a cada valor de umbral. No cambie los nombres de los valores; Esto resultará en entradas irreconocibles en el sistema. </li><li> Implemente los nuevos valores de umbral presionando &quot;CtRl + L &quot;sin reiniciar el programa, al reiniciar el programa se implementará el valor de umbral más reciente del archivo. </li></ol></li></ol> 3. Realización de grabaciones NOTA: El modo en el amplificador de microelectrodo controlado por computadora se ajustará automáticamente a Clamp de corriente (&quot;IC&quot;) por el software de autopatcher una vez que se ha logrado un parche exitoso. Las grabaciones de parches de parches de células enteras se pueden hacer usando el software de grabación de elección (este sistema no incluye una función de grabación). Si se identificaron varias células diana, después de terminar una grabación, vuelva al paso 2.4 y pruebe otra célula. <ol><li> Realizar experimentos automáticos de aplicación de fármacos locales usando un picospritzer (opcional). NOTA: Aquí se usa un experimento de aplicación de fármaco local como un ejemplo para describir cómo usar la función adicional de &quot;Secuencia de Comando&quot; para controlar hardware externo a través de señales TTL. <ol><li> Puerto de conexión A chaNnel 0 y la tierra de la placa DAQ secundaria a la entrada de disparo de inicio en el digitalizador utilizando un cable BNC desnudo (como se describe en el paso 1.2.3). Conecte un canal de salida digital en el digitalizador al gatillo externo del picospritzer. </li><li> Prepare el picospritzer de acuerdo con el manual del usuario. Conecte la salida de aire del picospritzer al soporte de la pipeta del droga-soplo unido a un micromanipulator. </li><li> Cargue una pipeta llena con un medicamento de su elección. Sujételo al soporte de la pipeta. Calibre la pipeta, como se describe en el paso 1.7. </li><li> Después de remendar una celda como se describe en el paso 2.6, seleccione un lugar deseado para la entrega de fármacos haciendo clic con el ratón en la GUI de vista de cámara en &quot;modo de ratón&quot; (cambiado desde la GUI principal). Como alternativa, utilice la GUI &quot;Grid&quot; para diseñar una cuadrícula, con cada píxel en la cuadrícula como una de las ubicaciones de destino. NOTA: La cuadrícula se puede manipular en la GUI de la vista de la cámara arrastrándola con el ratón. </li><li> En el comando &quot;Sequ, Seleccione la unidad manipuladora en la que está montada la pipeta de medicamento Haga clic en &quot;cargar puntos de ratón&quot; o &quot;cargar puntos de cuadrícula&quot; para importar todas las coordenadas para la entrega de fármacos. <ol><li> Haga clic en cada entrada de coordenadas para editar la señal TTL de comando específico en la columna derecha. En la primera entrada de comando, haga clic en el dígito más a la derecha para pasar de &quot;0&quot; a &quot;1&quot;, enviando una señal TTL +5-V. Ajuste el tiempo (T) a la duración deseada de la señal TTL, en ms. </li><li> En la segunda entrada de comando, ajuste todos los dígitos a &quot;0&quot; y ajuste T a la duración de la duración de grabación de la prueba. Editar comandos para todas las entradas de coordenadas. Agregue entradas de comando haciendo clic en &quot;+&quot; si son necesarias varias señales TTL. NOTA: Los bits de 8 dígitos representan los canales A del canal A 0-7 en el DAQ secundario (los puertos 1 - 3 son ocupados por la bomba y dos válvulas) si es necesario. </li></ol></li><li> Crear un protocolo de grabación en el módulo de adquisición deQue el inicio de un barrido es activado por el disparador de inicio externo. Edite el protocolo para entregar el medicamento en el momento deseado. </li><li> En la GUI &quot;Command Sequence&quot;, haga clic en &quot;Ejecutar&quot; a la izquierda para ejecutar todas las coordenadas. Alternativamente, haga clic en &quot;Ejecutar&quot; a la derecha para ejecutar sólo la secuencia seleccionada. NOTA: La pipeta se moverá a cada coordenada y ejecutará la señal TTL como se define para iniciar el barrido de grabación. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li>
<li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li>
<li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630(2013).</li>
<li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACQ4%3A+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroinform%22%5BJournal%5D)">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li>
<li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li>
</ol>

Una solicitud de patente no provisional &quot;SISTEMAS Y MÉTODOS PARA ELECTROFISIOLOGÍA PATCH-CLAMP AUTOMATIZADA GUÍA DE IMAGEN EN VITRO&quot;, US Nº de Serie: 15 / 353,719, fue presentada el 16 de noviembre de 2016, Ref. No .: PRF 67270-02.

En este caso, se describe un método para grabar autoadhesivo guiado por imágenes autoadhesivas in vitro . Los pasos clave en este proceso se resumen de la siguiente manera. En primer lugar, la visión por ordenador se utiliza para reconocer automáticamente la punta de la pipeta utilizando una serie de imágenes adquiridas a través de un microscopio. Esta información se utiliza entonces para calcular la función de transformación de coordenadas entre el microscopio y los sistemas de coordenadas del manipulador. La ...

La técnica de la abrazadera del remiendo fue desarrollada por primera vez por Neher y Sakmann en los años 70 para estudiar los canales iónicos de las membranas excitables 1 . Desde entonces, el pinzamiento de parches ha sido aplicado al estudio de muchos sujetos diferentes a nivel celular, sináptico y de circuito tanto in vitro como in vivo en muchos tipos de células diferentes, incluyendo neuronas, cardiomiocitos, ovocitos de Xenopus y liposomas artificiales 2 . Este proceso implica la identificación correcta y el direccionamiento de una célula de interés, un control intrincado del micromanipulador para mover la pipeta de parche en proximidad cercana a la célula, la aplicación de presión positiva y negativa a la pipeta en el momento apropiado para establecer un parche estrecho gigaseal, Y una ruptura para establecer una configuración de parches de célula completa. La fijación del parche se realiza típicamente manualmente y requiere un entrenamiento extensivo para dominar. Incluso para un investigador experimentado con el parcheClamp, la tasa de éxito es relativamente baja. Más recientemente, se han hecho varios intentos para automatizar experimentos de parche-abrazadera. Dos estrategias principales han evolucionado para lograr la automatización: aumentar el equipo estándar de la abrazadera del remiendo para proporcionar el control automático del proceso de remiendo y el diseño de nuevo equipo y de técnicas de la tierra para arriba. La estrategia anterior es adaptable al hardware existente y puede utilizarse en una variedad de aplicaciones de abrazadera de parche, incluyendo abrazadera de parche ciego in vivo 3 , 4 , 5 , clamp de parche in vitro de cortes de cerebro agudo, cultivos de corte organotípico y neuronas disociadas cultivadas 6 . Permite la interrogación de circuitos locales complejos utilizando simultáneamente múltiples micromanipuladores 7 . El método de parche planar es un ejemplo de la nueva estrategia de desarrollo, que puede lograr el rendimiento simultáneo p de alto rendimientoAtch clamp de células en suspensión para fines de cribado de drogas 8 . Sin embargo, el método de parche plano no es aplicable a todos los tipos de células, particularmente neuronas con procesos largos o circuitos intactos que contienen conexiones extensas. Esto limita su aplicación a la cartografía de los intrincados circuitos del sistema nervioso, que es una ventaja clave de la tecnología de pinza de parche tradicional. Hemos desarrollado un sistema que automatiza el proceso manual de la abrazadera del remiendo in vitro aumentando el hardware estándar de la abrazadera del remiendo. Nuestro sistema, Autopatcher IG, proporciona la calibración automática de la pipeta, la identificación de la blanco de la célula fluorescente, el control automático del movimiento de la pipeta, remiendo automático de la célula entera, y registro de datos. El sistema puede adquirir automáticamente múltiples imágenes de rodajas de cerebro a diferentes profundidades; Analizarlos utilizando la visión por computadora; Y extraer información, incluyendo las coordenadas de las células marcadas fluorescentemente. Esta información puede serUsado para apuntar y automáticamente parche las células de interés. El software está escrito en Python -un lenguaje de programación libre y de código abierto- que utiliza varias bibliotecas de código abierto. Esto asegura su accesibilidad a otros investigadores y mejora la reproducibilidad y el rigor de los experimentos de electrofisiología. El sistema tiene un diseño modular, de modo que el hardware adicional puede ser fácilmente interconectado con el sistema actual demostrado aquí.

<table><tbody><tr><td>Cámara CCD</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>Equipo de electrofisiología</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>Incluye microscopio y manipuladores. El software de control del manipulador proporcionado por el fabricante que se muestra en este manuscrito es " Linlab2".</td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td> amplificador <td>de microelectrodo controlado por ordenador</td></tr><tr><td>Digitalizador</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz LED</td><td>Cool LED</td><td>pE-100</td><td>488 nm Longitud de onda</td></tr><tr><td>Tarjeta de adquisición de datos</td><td>Computación de medición</td><td>USB1208-FS</td><td>Secundario DAQ. Consulte el manual en : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>Válvulas solenoides</td><td>The Lee Co.</td><td></td><td></td>LHDA0531115H</tr><tr><td>Bomba de aire</td><td>Industria virtual</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>Sensor de presión de aire</td><td>Freescale semiconductor</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>Sujeción de corte Warner</td><td>instruments</td><td>64-1415 (SHD-40/2)Kit de</td> <td>anclaje de corte, plano para cámara RC-40, 2,0 mm, 19,7 mm</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>versión 2.7 (32 bits para Windows)</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>Terminales de tornillo</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>Terminales de tornillo de 3,5 mm de paso (2 pines)</td></tr> <tr><td>(2 pines)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MOSFET de canal N 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>Zócalos DIP Cola de soldadura - 8 pines</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - Básico Rojo 5 mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - Verde Básico 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>Conector / Conector de Alimentación de Barril de CC (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de Pared Fuente de Alimentación - 12 V DC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>Cable de Conexión - Surtido (Núcleo Sólido, 22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>Llave de paso de bloqueo Macho x Hembra x Hembra</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Tubos flexibles</td><td>Fisher scientific</td><td>14-171-129</td><td>Diámetro exterior: 1/8 pulg. Diámetro interior: 1/16 pulg.</td></tr><tr><td>Cable coaxial BNC macho a BNC macho</td><td>Belkin Components</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>Resistencia de 560 Ohm (tolerancia del 5%)</td><td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Válvula General</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

La abrazadera del remiendo de la célula entera es el método gold-standard para medir las características eléctricas de células individuales. Sin embargo, la abrazadera de parche in vitro sigue siendo una técnica desafiante y de bajo rendimiento debido a su complejidad y alta dependencia en el funcionamiento y control del usuario. Este manuscrito demuestra un sistema de abrazadera de parche automático guiado por imágenes para experimentos in vitro de clamp de parche de células enteras en cortes cerebrales agudos. Nuestro sistema implementa un algoritmo basado en la visión por computadora para detectar células marcadas fluorescentemente y para dirigirlas para un parche totalmente automático usando un micromanipulador y un control interno de la presión de la pipeta. Todo el proceso es altamente automatizado, con requisitos mínimos para la intervención humana. La información experimental en tiempo real, incluida la resistencia eléctrica y la presión interna de la pipeta, se documentan electrónicamente para análisis futuros y para la optimización a diferentes tipos de células. Aunque nuestro sistema se describe en el contexto de agudos braiN, también se puede aplicar a la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada de neuronas disociadas, cultivos de corte organotípico y otros tipos de células no neuronales.

<html> Nuestro sistema ha sido probado en su capacidad de parche de células en los cortes de cerebro agudo, inducida por el ratón Pluripotent Stem Cells (iPSCs) diferenciadas en neuronas, y células HEK 293 que expresan artificialmente los canales de interés. La Figura 3 muestra un experimento utilizando ratones transgénicos Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) dirigidos a neuronas piramidales de capa 5 marcadas fluorescentemente en la cortez...

Este protocolo describe la forma de llevar a cabo automático de imágenes guiadas por pinzas de abrazadera experimentos utilizando un sistema desarrollado recientemente para estándar de equipos de electrofisiología in vitro .

Aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

El objetivo general de esta tecnología consiste en utilizar la visión por computadora para detectar automáticamente células fluorescentes y realizar el registro por parche automatizado de estas células en cortes cerebrales agudos. Este método puede ayudar a superar dificultades clave en el campo de la electrofisiología por registro de parche, como la identificación, el posicionamiento y el registro por parche de células marcadas con fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica es que puede detectar automáticamente pipetas de registro, células fluorescentes e integrar los pasos con el registro por parche automático.Esta innovación aumenta significativamente el rendimiento experimental. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de trastornos neurológicos, ya que el registro automatizado de parches guiado por imágenes de alto rendimiento puede utilizarse para cribados farmacológicos en preparaciones neuronales más fisiológicas. Este método también puede aplicarse a otras preparaciones in vitro, como orgánulos neuronales típicos, cultivos de cortes, neuronas disociadas, así como a cualquier tipo de células no neuronales.Para comenzar este p

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra una técnica para el registro de patch-clamp desde la superficie de la membrana dendrítica. Esto ayuda a examinar directamente las propiedades eléctricas de las dendritas y los canales iónicos subyacentes dependientes de voltaje en las neuronas dopaminérgicas.

Grabaciones de patch-clamp de la dendrita de una neurona dopaminérgica en un corte de cerebro

Este video muestra cómo colocar una pipeta de punta fina cerca de cortes de cerebro, formando un sello con una célula neuronal. La succión rompe la membrana celular, creando así una pinza de parche de celda completa que permite mediciones de corriente para experimentos de electrofisiología.

Establecimiento de una configuración de pinza de voltaje de celda completa para registros electrofisiológicos en cortes de cerebro

Este video describe un método para obtener imágenes y registrar simultáneamente la actividad eléctrica de cortes de cerebro transgénicos que contienen proteínas fluorescentes específicas de neuronas. El procedimiento consiste en mantener el corte de cerebro en una cámara de perfusión con líquido cefalorraquídeo artificial aireado, utilizar una fuente de luz para excitar las células marcadas con fluorescencia y registrar las señales eléctricas con una sonda multicanal y una pinza de parche.

Monitorización óptica y electrofisiológica simultánea de células neuronales en cortes de cerebro

En este video, se inmovilizan cortes de cerebro en una cámara de grabación, y se localizan y enfocan las células de interés utilizando un microscopio controlado por computadora. A continuación, el sistema automatizado de procesamiento de imágenes posiciona con precisión una pipeta de parche para sellar la membrana celular y monitorizar las señales eléctricas.

Técnica automatizada de pinza de parche guiada por imágenes para estudiar las neuronas en cortes de cerebro

Este video muestra el procedimiento para mapear las conexiones sinápticas asegurando un corte de cerebro, colocando pipetas para lograr configuraciones de células completas y estimulando las neuronas presinápticas para registrar respuestas postsinápticas, dilucidando así la conectividad neuronal.

Registro de las conexiones neuronales en cortes cerebrales agudos

En este artículo, se describe un método útil para estudiar ligandos función del canal iónico en las neuronas de rodajas de cerebro agudamente aisladas. Este método implica el uso de una micropipeta de relleno de fármaco para aplicación local de medicamentos a las neuronas registradas utilizando técnicas estándar de patch clamp.

La aplicación local de medicamentos para estudiar la función del receptor nicotínico de acetilcolina en rodajas de cerebro de ratón

registros de patch-clamp y el llenado simultáneo de biocitona intracelular de neuronas sinápticamente acopladas en cortes agudos de cerebro permiten un análisis correlacionado de sus propiedades estructurales y funcionales. El objetivo de este protocolo es describir los pasos técnicos esenciales del registro electrofisiológico a partir de microcircuitos neuronales y su posterior análisis morfológico.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

Este protocolo muestra la implementación de un optimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de protección recuperación de preparación de corte de cerebro. Una formulación de medios de comunicación solo se utiliza para obtener confiablemente rebanadas de cerebro sano de animales de cualquier edad y para diversas aplicaciones experimentales.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

Este protocolo se describen los pasos básicos de procedimiento para la realización de patch-clamp grabaciones de células enteras. Esta técnica permite el estudio del comportamiento eléctrico de las neuronas, y cuando se realiza en secciones de cerebro, permite la evaluación de varias funciones neuronales de las neuronas que todavía están integrados en los circuitos cerebrales relativamente bien conservadas.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

La técnica de abrazadera del remiendo de rebanada es un método eficaz para el análisis de los cambios inducidos por el aprendizaje en las propiedades intrínsecas y la plasticidad de las sinapsis excitatorias o inhibitorias.

Slice Patch Clamp técnica para analizar la plasticidad inducida por el aprendizaje

Los cortes cerebrales ex vivo se pueden usar para estudiar los efectos de los anestésicos volátiles en las respuestas evocadas a las entradas aferentes. La optogenética se emplea para activar independientemente las aferentes talamocorticales y corticocorticales al neocórtex no primario, y las respuestas sinápticas y de red se modulan con isoflurano.

Activación optogenética de vías aferentes en cortes cerebrales y modulación de respuestas por anestésicos volátiles

Aprende la técnica de patch-clamp automatizado guiado por imágenes para electrofisiología en cortes cerebrales agudos. Este método mejora la eficiencia experimental y facilita el cribado farmacológico en preparaciones neuronales.

Aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales

Explorar más videos