Aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales

El objetivo general de esta tecnología es utilizar la visión artificial para detectar automáticamente células fluorescentes y realizar una pinza de parche automatizada de estas células en cortes agudos de cerebro. Este método puede ayudar a superar dificultades clave en el campo de la electrofisiología de la pinza de parche, como la identificación, la focalización y la fijación de parche de células marcadas con fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica es que puede detectar automáticamente pipetas de parche, células fluorescentes e integrar los pasos con una pinza de parche automática.

Esta innovación aumenta significativamente el rendimiento experimental. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de trastornos neurológicos, ya que la pinza de parche automática guiada por imágenes de alto rendimiento se puede utilizar para cribados farmacológicos en preparaciones neuronales más fisiológicas. Este método también se puede aplicar a otras preparaciones in vitro, como los orgánulos neuronales típicos, o cultivos en rodajas, neuronas disociadas, así como cualquier célula no neuronal.

Para comenzar este procedimiento, encienda el amplificador, el controlador del microscopio y el controlador del manipulador. A continuación, ejecute Autopatcher IG con python desde un terminal de línea de comandos cambiando primero el directorio donde está instalado Autopatcher IG. A continuación, escriba Python Autopatcher_IG.

PYW en el terminal de línea de comandos y presione la tecla enter. Después de eso, llene toda la pipeta de vidrio con solución interna y cárguela en la platina principal. Mueva la punta de la pipeta al campo visual del microscopio y enfóquela.

Si se utiliza el teclado de marcación para mover los manipuladores en la etapa del microscopio, actualice las coordenadas pulsando Z en el teclado. La calibración primaria convierte el ángulo y la distancia de movimiento del manipulador en el sistema de coordenadas del microscopio. El manipulador se desplaza en tres direcciones con una distancia preestablecida y el software detecta las coordenadas de la punta de la pipeta dentro del campo visual del microscopio.

Haga clic en el botón de inicio de calibración en la GUI principal de la unidad correspondiente en la que está cargada la pipeta. Posteriormente, guarde la calibración haciendo clic en guardar calibración en la parte inferior de la GUI principal. Esta calibración primaria solo es necesario realizarla una vez, a menos que se altere la organización física del equipo.

En este paso, coloque un trozo de cerebro en el centro de la cámara de grabación. Estabilice la rebanada de cerebro con una rebanada o un arpa. Para detectar la célula fluorescente, encuentre el área de interés bajo el aumento de cuatro veces.

A continuación, mueva la platina del microscopio activando el modo clic para mover y haga clic en el centro del área de interés. Alternativamente, use el teclado para mover la platina del microscopio. A continuación, cambie a la lente de gran aumento y ajuste el enfoque moviendo el microscopio en el eje Z usando RF en el teclado.

El software dirige el microscopio y la cámara para tomar una serie de imágenes a diferentes profundidades. Luego, estas imágenes se someten a un procesamiento de visión por computadora para encontrar células marcadas con fluorescencia. El resultado final es una lista de las coordenadas de celda detectadas.

Haga clic en el botón Detectar celda en la columna principal de la GUI, unidad cero. Si la fuente de luz LED o láser de la configuración no puede ser controlada por la señal TTL, encienda manualmente el LED o el láser. Apague el LED o el láser si es necesario.

Aparecerá una lista de coordenadas de celda en la GUI de posiciones de memoria. Elimine las celdas no deseadas de la lista haciendo clic en el botón X junto a las coordenadas. Alternativamente, si las celdas objetivo no están marcadas con fluorescencia, haga clic en el modo del mouse en la GUI principal.

Luego, haga clic en la celda de interés, aparecerá un punto amarillo con un número en la celda y las coordenadas de la celda aparecerán en la GUI de posiciones de memoria. Para realizar la calibración secundaria con el fin de detectar las coordenadas de desplazamiento de la pipeta, llene 1/3 de una pipeta de vidrio con solución interna. A continuación, cargue la pipeta en el soporte de pipetas fijado a la platina principal.

Con un aumento bajo, use uno y dos en el teclado para cambiar entre la unidad uno y la unidad dos. A continuación, lleve la pipeta al campo visual y ajuste el enfoque con el teclado. A continuación, cargue la calibración primaria haciendo clic en cargar calibración.

Cambie la lente del microscopio a un aumento alto y haga clic 40 veces en la GUI principal. Lleva la punta de la pipeta al centro. Luego, haga clic en el botón de calibración secundaria en la GUI principal, debajo de la unidad que está en uso.

Para parchear una celda objetivo, haga clic en el botón de control de parches para abrir la GUI de control de parches. Haga clic en el botón Ir a junto a la celda de interés en la lista de coordenadas en la GUI de posición de memoria. A continuación, haga clic en el botón CTM de la unidad en la GUI principal para habilitar el movimiento.

Haga clic en la celda de interés para mover la punta de la pipeta a la celda. Debido a la limitación mecánica del manipulador, cuando se viaja a más de 500 micrómetros de distancia, puede haber un ligero error de posicionamiento. Para evitar un gran error de posicionamiento mecánico, la calibración secundaria debe realizarse cerca de la celda objetivo.

A continuación, utilice el botón de la unidad uno seleccionado para cambiar la señal de entrada entre las dos unidades. Haga clic en el botón de parche en la GUI de control de parches. Se iniciará la aplicación automática de parches y la presión y la resistencia se pueden monitorear en la GUI de control de parches.

El algoritmo de parcheo automático monitorea la resistencia y controla la presión a través de una serie de bucles lógicos, para formar un gigaseal. Una ventana emergente notifica la formación de un gigaseal. El sistema utiliza el cambio de resistencia para reconocer el contacto entre la célula y la superficie.

En la situación de que el contacto entre la celda y la superficie no se detecte a tiempo, utilice el botón siguiente para avanzar en la etapa de aplicación de parches mientras permanece en la misma prueba de aplicación automática de parches. Manipule el proceso automático en cualquier momento haciendo clic en los botones respectivos en la GUI de control de parches. A continuación, seleccione sí para entrar con Zap y succión combinados.

Alternativamente, seleccione no para entrar solo con succión. A continuación, guarde el registro de parches del experimento. Esta figura muestra las ubicaciones seleccionadas cargadas en la GUI de secuencia de comandos.

La columna de la izquierda muestra la lista de coordenadas y la columna de la derecha muestra la lista de comandos en forma de señales TTL para cada ubicación. Aquí están las capturas de pantalla durante el experimento de aplicación de medicamentos, correspondientes a las tres ubicaciones seleccionadas. La solución de KCL se mezcló con un tinte fluorescente rojo con el fin de visualizar.

La unidad uno fue la pipeta que contiene KCL y la unidad dos fue la pipeta de parcheo. En esta figura, las inyecciones de corriente escalonada muestran una neurona de pico regular. Aquí se muestran las trazas de registro de pinzas de voltaje de la aplicación local de una solución de cloruro de potasio de 500 milimolares en tres ubicaciones.

La traza roja con corriente interna se registró en el ensayo cuando la aplicación de cloruro de potasio estaba cerca de la celda del parche. La flecha roja indica el momento de la aplicación del cloruro de potasio. Con este método, se puede realizar una prueba de fijación de parche en cuatro minutos sin una formación exhaustiva en comparación con el parcheo manual.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la optogenética, la quimiogenética y las manipulaciones farmacológicas, con el fin de responder preguntas relacionadas con su proyecto de investigación. Tras su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploren estudios de alto rendimiento de receptores sinápticos y canales iónicos en diferentes preparaciones in vitro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de fijación de parche automatizados guiados por imágenes.