Investigación de sináptica Tagging / Captura y Cruz de captura utilizando aguda hipocampo rebanadas de Roedores

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la plasticidad a largo plazo y sus procesos asociativos, como la etiquetación sináptica, la captura y la etiquetación cruzada, en neuronas paramedial del CA uno utilizando cortes hipocampales Q de roedores. Esto se logra primero mediante la disección del cerebro y la rápida aislación del hipocampo en un líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado y frío. El segundo paso consiste en preparar cortes hipocampales agudos utilizando un cortador manual de tejidos e incubarlos en una cámara de interfaz.

A continuación, se colocan dos electrodos estimulantes y dos electrodos de registro en la región CA1 para registrar respuestas de EPSP de campo y respuestas de espiga poblacional provenientes de dos entradas sinápticas. El paso final consiste en inducir una forma transitoria de plasticidad en una entrada sináptica y una forma persistente de plasticidad en otra entrada dentro de una ventana de tiempo específica. Finalmente, se registran las respuestas de EPSP de campo de ambas entradas durante períodos prolongados para investigar los mecanismos de etiquetado sináptico, captura y captura cruzada.

La marcación y captura sináptica proporciona una base conceptual sobre cómo la memoria a corto plazo se transforma en memoria a largo plazo dentro de un período de tiempo determinado. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos experimentales son difíciles de aprender porque implican la estimulación y grabación de múltiples entradas sinápticas. El procedimiento será demostrado por Mahesh Shira, machete y maima Sharma, estudiantes de posgrado de mi laboratorio.

Para comenzar este procedimiento, prepare un LCR A y burbujéelo con 95% oxígeno y 5% dióxido de carbono. Llene la parte inferior de la cámara de interfaz con agua destilada hasta aproximadamente el 70% de su capacidad. Luego encienda el controlador de temperatura ajustado previamente a 32 grados Celsius.

A continuación, lave la cámara superior durante 10 a 15 minutos haciendo pasar agua destilada a través del tubo de entrada a un flujo elevado antes de cambiar a un LCR A a un flujo de un mililitro por minuto. Luego coloque una malla en la cámara superior para proporcionar una superficie de reposo para los cortes. Comience a burbujear carbógeno en la cámara inferior e introduzca el tubo de entrada en el LCR A que está siendo continuamente carbogenado.

Permita 20 minutos para que el LCR A se sature con carbógeno y para que llene la cámara superior. En este paso, monte una cuchilla de afeitar en el cortador de tejidos y asegúrese de que el borde de corte esté alineado uniformemente. Pruebe cortando un pequeño trozo de papel filtro para verificar que la cuchilla esté firmemente sujeta.

Luego, coloque el micrómetro vernier deslizante en su posición inicial. Ahora, obtenga la cabeza de una rata sacrificada y, utilizando unas tijeras de iris, realice un corte a través del cráneo posterior para extraer el bulbo raquídeo. A continuación, haga una incisión pequeña a lo largo del lado derecho del cráneo y una incisión más larga en el lado izquierdo.

Retire cuidadosamente el cráneo con un UR óseo comenzando desde el lado izquierdo y avanzando hacia el lado derecho del cráneo. Para exponer la corteza y la delgada capa de duramadre que la recubre, retire con cuidado la duramadre con una espátula fina y luego retire las placas frontales junto con el hueso. Posteriormente, elimine la duramadre restante específicamente en la unión entre la corteza y el cerebelo utilizando el extremo plano de una espátula, y evite dañar el cerebro manteniendo la presión hacia arriba.

Usando la espátula, retire suavemente el cerebro e introdúzcalo en una placa de Petri colocada sobre un bloque refrigerante de aluminio lleno con A CSF frío y carbonatado para aislar el hipocampo; utilizando un bisturí número 11, realice un corte recto para eliminar el cerebelo y otro corte para retirar un cuarto de la porción anterior del cerebro. A continuación, haga un corte sagital superficial a lo largo de la línea media. Comenzando desde la línea media.

Retire cuidadosamente la corteza con el escalador en forma de hoz para exponer el hipocampo dorsal. A continuación, elimine la capa de corteza situada por encima del hipocampo. Haga un pequeño corte en la comisura del hipocampo.

Retire suavemente el hipocampo con el escalpelo en forma de hoz, comenzando desde el extremo dorsal utilizando movimientos de rodado. Posteriormente, elimine cualquier corteza y tejidos conectivos alrededor del hipocampo aislado utilizando el extremo curvo del escalpelo en forma de hoz. Para cortar el tejido hipocampal, coloque un trozo de papel filtro Watman de 30 milímetros empapado en LCR sobre la plataforma de corte del cortador manual.

Transfiera el tejido del hipocampo sobre el papel de filtro. Utilizando el extremo plano del escalpelo en forma de hoz, mueva el papel de filtro para alinear el hipocampo en una orientación adecuada con respecto a la cuchilla del cortador, de modo que el hipocampo se corte a un ángulo de aproximadamente 70 grados respecto al fia. A continuación, retire con absorción la solución excesiva que rodea el tejido del hipocampo.

Con un papel filtro plegado, seccione el hipocampo transversalmente y deseche el tejido del extremo más distal del hipocampo, donde la morfología del corte no es clara. A continuación, seccione el tejido restante en láminas de 400 micrones de grosor ajustando el micrómetro vernier después de cada serie de cortes. Después de cada corte, transfiera suavemente la lámina desde la hoja utilizando un pincel de cerdas suaves hacia un vaso pequeño lleno de A CSF frío y carbonatado.

Luego, transfiera suavemente las secciones a la red de la cámara para secciones utilizando una pipeta Pasteur de plástico limpia. Con una punta ancha, ajuste cuidadosamente la posición de las secciones de manera que facilite la ubicación del electrodo y la verificación de la grabación, asegurándose de que las secciones estén suficientemente rodeadas por una capa de A CSF, pero sin quedar completamente sumergidas. A continuación, cubra la cámara e incube las secciones durante dos o tres horas en experimentos de marcado sináptico y captura.

Bajo el microscopio, coloque los dos electrodos estimulantes en la capa radiatum del área CA1 para estimular las fibras colaterales de Schaffer, y un electrodo de registro en la región dendrítica apical del CA1, a mitad de camino entre los electrodos estimulantes. Para registrar las respuestas F-E-P-S-P, coloque otro electrodo de registro en la capa stratum pyramidale para la grabación del potencial de población.

Cuando todos los electrodos toquen el corte, aplique una estimulación de prueba para asegurarse de que se pueda obtener una señal adecuada de PEPF en ambas entradas. Una vez obtenida una señal adecuada de PEPF, baje cuidadosamente los electrodos unos 200 micrones adicionales utilizando los mandos de movimiento fino de los manipuladores. Luego, permita 20 minutos para que el corte se recupere.

Después de eso, determine la relación entrada-salida midiendo la pendiente del PECE de campo frente a un rango de intensidades de corriente desde 20 microamperios hasta 100 microamperios. Luego, para cada entrada, establezca la intensidad de estimulación que evoca el 40 % de la pendiente máxima del PECE de campo como estímulo constante durante todo el experimento. Después de 15 a 20 minutos, comience a registrar la línea base, obteniendo una línea base estable de al menos 30 a 60 minutos antes de la inducción de PTL-DBL en una entrada; induzca una PTL temprana utilizando un protocolo de tetanización débil que consista en una única estimulación de alta frecuencia.

Mientras la otra entrada continúa registrando la línea base durante 30 minutos después de la inducción de la PTP temprana, induzca una PTP tardía en la entrada S dos, utilizando un protocolo de tetanización fuerte que implique estimulaciones de alta frecuencia repetidas con un intervalo interestímulo de 10 minutos. Luego registre las respuestas del PEPS de campo durante períodos prolongados para revelar la transformación de la PTP temprana en la entrada S uno a PTP tardía mediante la etiquetación sináptica y la captura. De manera similar, en un experimento de captura cruzada, primero induzca una PTP temprana en una entrada, seguida 30 minutos después por la inducción de una DTP tardía en otra entrada, utilizando un protocolo de estimulación de baja frecuencia fuerte que consista en 900 ráfagas durante un período de 15 minutos.

Luego registre las respuestas del PEPS de campo durante períodos prolongados para revelar la transformación del LTP temprano en la entrada S uno en LTP tardío mediante la captura cruzada. En esta representación, dos electrodos estimulantes se colocan en la capa radiatum del área CA uno para estimular dos entradas sinápticas independientes pero superpuestas. Hacia neuronas parametálicas CA uno con dos electrodos de registro extracelular.

Uno para registrar el F-E-P-S-P desde el compartimento dendrítico apical y otro para registrar el potencial de espiga somático de la población de cuerpos celulares parametales ubicados en el estrato radiatum y el estrato para, respectivamente. Esta figura muestra la semana anterior al fuerte paradigma para estudiar la etiquetación y captura sinápticas.

Se aplica tetanización débil a S uno para inducir la PTP temprana, seguida de una tetanización fuerte de S dos a los 30 minutos para inducir la PTP tardía, y esta figura muestra el paradigma débil antes del fuerte para estudiar la marcación cruzada. La PTP temprana se induce mediante tetanización débil en S uno, seguida de la inducción de la DTP tardía en S dos utilizando un protocolo de estimulación de baja frecuencia fuerte. Después de 30 minutos en S uno, la PTP temprana se transforma en PTP tardía que dura seis horas, mostrando marcación y captura cruzadas.

Una vez dominada, esta técnica de disección y preparación de cortes se puede realizar muy rápidamente en tres a cinco minutos. De este modo, se puede preservar la viabilidad de los cortes para grabaciones a largo plazo. Mediante este método, también se pueden evaluar los efectos de diferentes agentes farmacológicos sobre los procesos de marcado sináptico y captura.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de plasticidad funcional a largo plazo y de los procesos de etiquetado sináptico y captura.