Investigación de sináptica Tagging / Captura y Cruz de captura utilizando aguda hipocampo rebanadas de Roedores

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la plasticidad a largo plazo y sus procesos asociativos, como el marcaje sináptico, la captura y el marcaje cruzado en las neuronas parametálicas CA one utilizando cortes de hipocampo Q de roedores. Esto se logra diseccionando primero el cerebro y aislando rápidamente el hipocampo en líquido cerebra artificial oxigenado frío. El segundo paso consiste en preparar cortes agudos de hipocampo utilizando un cortador de tejido manual e incubarlos en una cámara de interfaz.

A continuación, se colocan dos electrodos de estimulación y dos electrodos de registro en la región CA uno para registrar las respuestas de EPSP de campo y picos poblacionales de dos entradas sinápticas. El paso final es inducir una forma transitoria de plasticidad en una entrada sináptica y una forma persistente de plasticidad en otra entrada dentro de una ventana de tiempo específica. En última instancia, las respuestas EPSP de campo de ambas entradas se registran durante períodos prolongados para investigar la captura de etiquetado sináptico y los mecanismos de captura cruzada.

El etiquetado y la captura sinápticos proporcionan una base conceptual sobre cómo la memoria a corto plazo se transforma en memoria a largo plazo dentro de un período de tiempo determinado. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos experimentales son difíciles de aprender porque implican la estimulación y el registro de múltiples entradas sinápticas. La demostración del procedimiento estará a cargo de Mahesh Shira, machete y maima Sharma, estudiantes graduados de mi laboratorio.

Para comenzar este procedimiento, prepare un líquido cefalorraquídeo y burbujee con un 95% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono. Llene el fondo de la cámara de interfaz con agua destilada hasta aproximadamente el 70% de su capacidad. A continuación, encienda el controlador de temperatura preestablecido a 32 grados centígrados.

A continuación, lave la cámara superior durante 10 a 15 minutos haciendo correr agua destilada a través de la tubería de entrada a un caudal alto antes de cambiar a un CSF A a un caudal de un mililitro por minuto. Luego coloque una red en la cámara superior para proporcionar una superficie de descanso para las rodajas. Inicie el carbógeno en la cámara inferior, sumerja el tubo de entrada en el CSF A que está siendo carbogen continuamente.

Espere 20 minutos para que el líquido cefalorraquídeo A se sature de carbógeno y para que llene la cámara superior. En este paso, monte una hoja de afeitar en la picadora de pañuelos y asegúrese de que el filo esté alineado uniformemente. Pruebe cortando un pequeño papel de filtro para asegurarse de que la cuchilla esté firmemente asegurada.

A continuación, coloque el micrómetro vernier deslizante en su posición inicial. Ahora obtenga la cabeza de una rata sacrificada y, con unas tijeras de iris, haga un corte a través de la parte posterior del cráneo para extraer el tronco encefálico. Luego haga una pequeña incisión a lo largo del lado derecho del cráneo y una incisión más larga en el izquierdo.

Retire con cuidado el cráneo con una UR ósea comenzando desde el lado izquierdo y yendo hacia el lado derecho del cráneo. Para revelar la corteza y la fina capa de duramadre que la cubre, retire cuidadosamente la duramadre con una espátula delgada y luego retire las placas frontales con el hueso. Posteriormente, retire la duramadre restante específicamente en la unión entre la corteza y el cerebelo con el extremo plano de una espátula, y evite dañar el cerebro manteniendo la presión hacia arriba.

Con la espátula, coloque suavemente el cerebro en una placa de Petri en un bloque de enfriamiento de aluminio lleno de LCR A frío y carbonatado para aislar el hipocampo con un bisturí número 11, haga un corte recto para eliminar el cerebelo y otro corte para eliminar una cuarta parte de la porción anterior del cerebro. A continuación, haz un corte sagital poco profundo a lo largo de la línea media. Empezando por la línea media.

Retire con cuidado la corteza con el raspador de hoz para revelar el hipocampo dorsal. Después de eso, retira la capa de la corteza por encima del hipocampo. Haz un pequeño corte en la comisura del hipocampo.

Retire suavemente el hipocampo con el raspador de hoz, comenzando desde el extremo dorsal con movimientos giratorios. Posteriormente, extirpe la corteza y los tejidos conectivos alrededor del hipocampo aislado utilizando el extremo curvo del raspador de hoz. Para cortar el tejido del hipocampo, coloque un trozo de papel de filtro watman de 30 milímetros empapado en LCR en la etapa de corte de la cortadora manual.

Transfiere el tejido del hipocampo al papel de filtro. Usando el extremo plano de la hoz scalor, mueva el papel de filtro para alinear el hipocampo en una orientación adecuada en relación con la hoja de la cortadora, de modo que el hipocampo se corte en un ángulo de aproximadamente 70 grados con respecto a la fia. A continuación, seque el exceso de solución que rodea el tejido del hipocampo.

Con un papel de filtro doblado, corte el hipocampo, transversalmente, y deseche el tejido del extremo del hipocampo donde la morfología del corte no está clara. A continuación, corte el tejido restante en rodajas de 400 micras de grosor ajustando el micrómetro vernier después de cada ronda de corte. Después de cada corte, transfiera la rebanada suavemente de la cuchilla con un cepillo con cerdas suaves a un pequeño vaso de precipitados lleno de CSF A carbonatado frío.

A continuación, transfiera las lonchas suavemente a la red en la cámara de lonchas con una pipeta de plástico limpia. Con una punta ancha, ajuste cuidadosamente la posición de las rodajas de manera que facilite la ubicación de los electrodos y la verificación del registro para asegurarse de que las rodajas estén suficientemente rodeadas por una capa de LCR A, pero no completamente sumergidas. Después de eso, cubra la cámara e incube las rodajas durante dos o tres horas en experimentos de marcaje y captura sináptica.

Bajo el microscopio, coloque los dos electrodos estimulantes en el átomo del estrato radial de la CA una región para estimular las fibras colaterales de Schaffer y cuando registre el electrodo en la región dendrítica apical de ca uno a medio camino entre los electrodos estimulantes. Para registrar las respuestas F-E-P-S-P, coloque otro electrodo de registro en el estrato parid. Capa de OD para registrar el pico de población.

Cuando todos los electrodos toquen la rebanada, administre una estimulación de prueba para garantizar que se pueda obtener una señal EPSP de campo adecuada en ambas entradas. Una vez que se obtiene una señal F-E-P-S-P adecuada, baje con cuidado los electrodos unos 200 micrones más usando las perillas de movimiento fino de los manipuladores. Luego espere 20 minutos para que la rebanada se recupere.

Después de eso, determine la relación de entrada y salida midiendo la pendiente del EPSP de campo en un rango de intensidades de corriente de 20 microamperios a 100 microamperios. A continuación, para cada entrada, establezca la intensidad de estimulación que evoca el 40% de la pendiente EPSP del campo máximo como estímulos constantes a lo largo del experimento. Después de 15 a 20 minutos, comience a registrar la línea de base, registre una línea de base estable de al menos 30 a 60 minutos antes de la inducción de L-T-P-L-T-D en una entrada, induzca una LTP temprana utilizando un protocolo de tetín débil que consiste en una sola estimulación de alta frecuencia.

Mientras que la otra entrada continúa registrando la línea de base 30 minutos después de la inducción temprana de LTP, induzca una LTP tardía en la entrada S dos, utilizando un protocolo de tetin fuerte que involucra estimulación repetida de alta frecuencia con un intervalo entre trenes de 10 minutos. A continuación, registre las respuestas EPSP de campo para duraciones extendidas a para revelar la transformación de LTP temprano en la entrada S uno a LTP tardío mediante el etiquetado y la captura sináptica. De manera similar, en un experimento de captura cruzada, primero se induce una LTP temprana y una entrada seguida 30 minutos después por una inducción tardía de LTD en otra entrada, utilizando un fuerte protocolo de estimulación de baja frecuencia que consta de 900 ráfagas durante 15 minutos de duración.

A continuación, registre las respuestas EPSP de campo durante períodos prolongados para revelar la transformación de LTP temprana en la entrada S uno a LTP tardía mediante la captura cruzada. En esta representación, dos electrodos estimulantes se colocan en el átomo del estrato radial de la región CA uno para estimular dos entradas sinápticas independientes pero superpuestas. Sobre CA una neurona parametálica dos electrodos de registro extracelular.

Uno para registrar F-E-P-S-P desde el compartimento dendrítico apical. Y otro para registrar el pico de la población somática de los cuerpos celulares parametálicos se encuentran en el estrato radi átomo y el estrato para, respectivamente. Esta figura muestra la semana anterior al paradigma fuerte para estudiar el marcaje y la captura sináptica.

Se aplica tetina débil a S uno para inducir LTP temprana, seguida de tetina fuerte de S dos a los 30 minutos para inducir LTP tardía, y esta figura muestra la semana anterior al paradigma fuerte para estudiar el marcaje cruzado. La LTP temprana es inducida por una tetina débil en S uno, seguida de la inducción de LTD tardía en S dos utilizando un fuerte protocolo de estimulación de baja frecuencia. Después de 30 minutos en S uno, el LTP temprano se transforma en LTP tardío con una duración de seis horas, mostrando marcaje cruzado y captura.

Una vez dominada, esta técnica de disección y preparación de cortes se puede realizar muy rápidamente en tres a cinco minutos. Por lo tanto, la viabilidad de las rebanadas se puede preservar para grabaciones a largo plazo. Con este método, también se pueden probar los efectos de diferentes agentes farmacológicos en los procesos de marcaje y captura sináptica.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de plasticidad funcional a largo plazo y los procesos de etiquetado y captura sináptica.