Name: ODELAY: Un método a gran escala para la cuantificación multiparamétrica del crecimiento de la levadura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprende el método ODELAY para cuantificar fenotipos de crecimiento en levadura mediante microscopía de lapso de tiempo. Esta técnica permite observar la heterogeneidad poblacional en células individuales de Saccharomyces cerevisiae.

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Los autores reconocen el apoyo a este trabajo por las subvenciones U54 RR022220 y P50 GM076547 a JDA de los EE.UU. National Institutes of Health. FDM es un becario postdoctoral de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud. También damos las gracias al Centro de Biomedicina de Sistemas de Luxemburgo ya la Universidad de Luxemburgo por su apoyo.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo ODELAY tiene varios puntos críticos para asegurar mediciones fenotípicas reproducibles y confiables. El primer punto crítico es la preparación consistente de los cultivos de levadura. Se debe tener cuidado de recoger las células de levadura de crecimiento logarítmico. Si los cultivos se han saturado, entonces su heterogeneidad de la población se incrementará lo que puede obscurecer la heterogeneidad causada por factores genéticos o ambientales ( por ejemplo, la fuente de carbono) 11 . El segundo punto crítico es la preparación consistente de los medios de comunicación. En general, se debe generar un gran volumen de solución de material de almacenamiento 10X y luego utilizarse con el tiempo para minimizar los efectos de los lotes. Formular los medios en peso, siempre que sea posible, ayuda a mejorar la consistencia del medio a lo largo del tiempo, asegurando que la densidad de agar y el contenido global en agua de la agarosa pueden ser monitorizados de cerca. El tercer punto crítico consiste en minimizar o eliminar cualquier deformación mecánica de la agarosa meDia La deformación mecánica del medio ocurrirá más frecuentemente durante la separación de la agarosa de las diapositivas de vidrio. Como con muchas técnicas de laboratorio, la práctica es necesaria para dominar este paso. La variación en el tiempo de retardo, como se muestra en la Figura 4 , se relaciona a menudo con uno de los tres factores: deformación mecánica del medio de agarosa, variación en el espesor de agar moldeado o una fuente de luz inestable. Si el medio de agarosa varía en la altura Z a través de la matriz manchada, la variación de altura puede sobrepasar el rango de la rutina de enfoque automático, causando que las imágenes iniciales estén ligeramente fuera de foco. Por esta razón, compruebe la altura de enfoque en varios puntos en el centro ya lo largo de los bordes de la matriz manchada para asegurarse de que la rutina de enfoque automático tiene suficiente rango Z para encontrar el enfoque. Si es necesario, utilice el panel Autofocus para aumentar el rango de enfoque y aumentar el número de pasos de enfoque. Un tercer condicion posibleIon que puede conducir a un enfoque deficiente es una fuente de luz inestable o parpadeante, que puede interrumpir la puntuación de enfoque calculado para una altura Z específica. Las bombillas halógenas de tungsteno tienden a parpadear bien antes de que los bulbos se quemen. El efecto de un enfoque deficiente se observa en un ejemplo en el que las curvas de crecimiento se sumergen entre el primer y segundo puntos temporales ( Figura 5A ), mientras que el punto adyacente no tiene la misma inclinación ( Figura 5B ). En este caso, la mala condición de enfoque se alivió reemplazando la fuente de luz halógena de tungsteno. En la práctica, los autores han encontrado que para reducir el parpadeo de bulbos halógenos de tungsteno de 100W, los bulbos necesitan ser reemplazados cada 500 horas o aproximadamente cada 2 meses cuando los microscopios están bajo uso intensivo. Para evitar problemas de enfoque deficiente de una bombilla parpadeante, reemplace la fuente de luz halógena de tungsteno a menudo o reemplace la bombilla halógena con una fuente de luz de diodo. UnEl ejemplo de un conjunto de datos que muestra una baja variación en los tiempos de duplicación así como tiempos de retraso más uniformes se muestra en la Figura 6 . Este conjunto de datos se tomó con un iluminador de diodo que proporciona una iluminación más estable con el tiempo mientras se realiza el autofoco. Aunque muchos de los puntos mencionados aquí para optimizar la preparación de los medios pueden parecer obvios, en la literatura la mayoría de las pantallas a gran escala no se replican bien entre sí 8 , 11 . Por lo tanto, hemos descrito cuidadosamente la preparación de cultivos y medios de agarosa para que se puedan generar pantallas fenotípicas más reproducibles. El ensayo ODELAY está actualmente limitado en rendimiento cuando se compara con ensayos basados ​​en fijación tales como matrices genéticas sintéticas o el análisis Scan-O-Matic. Aunque estos métodos aumentan el número de cepas que se miden, carecen de la capacidad de resolver células individuales aNd por lo tanto no puede medir la heterogeneidad de la población que observamos dentro de las cepas clonales de levadura. El origen de esta heterogeneidad de la población no se entiende actualmente, pero la fusión de la tecnología y la computación como se demuestra aquí ofrece una oportunidad para abordar objetivamente los mecanismos celulares subyacentes [ 12] . Los autores desean notar que ODELAY actualmente sólo está optimizado para una marca de microscopio y tipo de cuerpo específicos. Modificar ODELAY para otros sistemas del microscopio es directo pero requerirá conocimiento de la fuente abierta API 13 . Sin embargo, tanto la API como los scripts ODELAY se escriben para adaptarse fácilmente a diferentes sistemas y ensayos experimentales. Mientras ODELAY fue desarrollado originalmente para la levadura, hemos sido capaces de utilizarlo sin modificación para observar el crecimiento de Mycobacterium smegmatis . La observación de los otros microorganismos formadores de colonias esPosible con modificaciones del código fuente proporcionado 11 . En general, ODELAY es una herramienta poderosa y flexible para comparar microorganismos cultivados bajo diferentes condiciones ambientales y perturbaciones genéticas.

Los fenotipos de crecimiento de microorganismos son un fuerte indicador de su aptitud genética subyacente a una condición ambiental dada. El crecimiento se clasifica clásicamente en 3 regímenes de crecimiento diferentes: fase de retraso, fase logarítmica y crecimiento en fase estacionaria 1 . Cada fase de crecimiento puede revelar diferentes aspectos de la aptitud que dependen de diversas condiciones ambientales y genéticas. Por ejemplo, el tiempo de retraso, o la cantidad de tiempo que un organismo pasa en fase de retraso antes del inicio del crecimiento exponencial, puede ser indicativo de la capacidad de un organismo para responder a condiciones ambientales alteradas 2 . El tiempo de duplicación durante el crecimiento de la fase logarítmica, la métrica más común de aptitud celular, revela la eficiencia global de la capacidad de un organismo para dividirse metabolizando y utilizando materiales ambientales para la replicación. La fase estacionaria, donde el crecimiento después de la fase logarítmica se reduce rápidamente, es otro indicador de aptitud, que es regularUtilizado como punto final de crecimiento en ensayos de crecimiento de levadura a base de manchas. Varios ensayos de crecimiento de levadura están actualmente disponibles y se consideran métodos estándar para evaluar los fenotipos de crecimiento en levaduras 3 , 4 , 5 . Estos ensayos se basan principalmente en métodos para cultivar levadura ya sea en medio sólido o líquido. En medios sólidos, los ensayos de fijación de colonias transfieren un pequeño número de células sobre agar sólido con un alfiler, y las células de levadura se dejan crecer durante un periodo de tiempo definido. A continuación se forman imágenes de las colonias y se comparan sus tamaños en un extremo terminal 6 . Estos ensayos de fijación de colonias han demostrado ser robustos y escalables para generar pantallas de todo el genoma. Más recientemente, se han incorporado imágenes periódicas utilizando escáneres de lecho plano y cámaras SLR (Single Lens Reflex) en estos ensayos para registrar el crecimiento de colonias a lo largo del tiempo 7 , 8, 9 . Sin embargo, la resolución de estos dispositivos les impide detectar células individuales y, por lo tanto, estos ensayos de fijación de colonias no observan directamente el tiempo de retraso y no pueden observar la variación entre las células individuales que crecen en colonias. También se han empleado ensayos de crecimiento a base de líquido para realizar pantallas de todo el genoma 3 . El acoplamiento de un ensayo de crecimiento líquido con microscopía de lapso de tiempo reveló heterogeneidad de la población en el tiempo de duplicación de células individuales genéticamente idénticas, lo que ofrece una perspectiva importante para comprender la regulación genética y la adaptación al medio ambiente. Sin embargo, este ensayo no mide otros aspectos del crecimiento tales como tiempo de retraso y capacidad de carga 10 . Aquí presentamos un método para caracterizar las tres fases de crecimiento de microorganismos formadores de colonias en medios sólidos usando un ensayo que denominamos ODELAY 11 . ODELAY consiste en utiliZing de alto rendimiento lapso de tiempo de microscopía para registrar imágenes de células individuales que crecen en colonias en medios sólidos. Esta población de células individuales que crecen en colonias revela la heterogeneidad de la población subyacente, que no es detectada por otras mediciones menos sensibles como la puntuación terminal. Se demuestra el método de la levadura, pero ODELAY puede aplicarse a cualquier organismo que muestra el contraste en microscopía de campo brillante.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>UltraPure ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>Gel Temp 36C, Fuerza de Gel (1%) 1,2 g/cm²</td></tr><tr><td>Extracto de levadura Peptona (YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de Relleno Completa (CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol 3350 (promedio mol. peso 3000-3700)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td>Cepa de levadura BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>Cepa de levadura BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos Falcon</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1 caja</td></tr><tr><td>15 mL Tubos Falcon</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 pulgadas 1,0 mm de espesor 1/2 bruto</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos de fondo plano</td><td>Corning</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>Hydra robot de manipulación de líquidos</td><td>Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star Robot de manipulación de líquidos</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydra 100 mL Puntas DARTS de longitud extendida Thermo</td><td></td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B Microscopio</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetivo Leica 10X/0.3NA</td><td>Cámara Leica</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB con caja de herramientas de procesamiento de imágenes</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>ODELAY Microscope Control (scripts de MATLAB y GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY para scripts y software de Matlab Cámara de</td></tr><tr><td>microscopio</td><td></td><td></td> ODELAY <td>www.aitchisonlab.com\ODELAY para dibujos mecánicos</td></tr><tr><td>Moldes de</td><td></td><td></td> agar ODELAY <td>www.aitchisonlab.com\ODELAY para dibujos de moldes</td></tr></tbody></table>

odelay: un método a gran escala para la cuantificación multiparamétrica del crecimiento de la levadura

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Los fenotipos de crecimiento de los microorganismos son un fuerte indicador de su aptitud genética subyacente y pueden segregarse en 3 regímenes de crecimiento: lag-phase, log-phase y stationary-phase. Cada fase de crecimiento puede revelar diferentes aspectos de la aptitud que están relacionados con diversas condiciones ambientales y genéticas. Las mediciones de alta resolución y cuantitativas de las 3 fases de crecimiento son generalmente difíciles de obtener. Aquí presentamos un método detallado para caracterizar todas las 3 fases de crecimiento en medios sólidos utilizando un ensayo denominado Evaluación de Duplicación de Celda de Arrays Vivientes de Levadura (ODELAY). ODELAY cuantifica los fenotipos de crecimiento de las células individuales que crecen en colonias en medios sólidos usando microscopía de lapso de tiempo. Este método puede observar directamente la heterogeneidad de la población con cada parámetro de crecimiento en células genéticamente idénticas que crecen en colonias. Esta heterogeneidad de población ofrece una perspectiva única para entender la regulación genética y epigenética, y las respuestas aGenéticas y ambientales. Aunque el método ODELAY se demuestra usando levadura, puede ser utilizado en cualquier microorganismo formador de colonias que sea visible por microscopía de campo brillante.

<html> En la Figura 3B se muestran ejemplos de imágenes de levaduras que crecen en microscopía de lapso de tiempo. Después de procesar las imágenes de lapso de tiempo, se muestra en la Figura 4 un conjunto de datos representativos que comparan cepas de levadura BY4741 y BY4742. En este ejemplo de conjunto de datos, hay muy poca variación en el tiempo de duplicación entre diferentes posiciones en la placa. Si el medio de agarosa se prepara pobremente, entonces una clara desviación tanto en el tiempo de duplicación como en el tiempo de retraso sería evidente en las posiciones puntuales que coinciden con la región deformada del gel de agarosa. Aunque los tiempos de duplicación parecen ser relativamente uniformes, este ejemplo muestra variaciones en las mediciones del tiempo de retardo. Un conjunto de datos más consistente se muestra en la Figura 6 . En este conjunto de datos tanto el tiempo de retardo como el tiempo de duplicación son uniformes. Archivos / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Ensamblaje de molde de agar. Los componentes del molde de agar se muestran en ( A ). Montar la base como se muestra en ( B ) y luego sujetar la base con clips pequeños. Coloque las piezas verticales más largas en la cavidad de la base ( C ) y luego acople las diapositivas al molde como se muestra en ( D ). Una vista lateral que muestra el ángulo del molde y la orientación del corte del molde necesario para una separación consistente del agar del portaobjetos de vidrio ( E ). Observe la posición del dedo pulgar y de los dedos índice, así como la línea recta del agar que se separa de la diapositiva ( F ) y observe la flecha horizontal. La línea de separación debe moverse uniformemente en la dirección de las flechas verticales. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> = &quot;Jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> Figura 2: Método de sonicación y manchado. Sonicar la placa en agua helada y usar un soporte de cubeta centrífuga para ayudar a apoyar la placa ( A ). Colocar las placas de los pasos 3.8.1 para el manchado en la placa de agarosa ( B ). También, arreglar las puntas para que la caja de la izquierda más la punta tiene una punta en la posición C10 y luego cuatro otras puntas con sus extremos cortados para que no choque el titular de la placa ( C ). Coloque las puntas restantes en cuatro cajas de manera que las 24 posiciones de las puntas interiores estén ocupadas ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Interfaz gráfica de usuario de ODELAY. Una captura de pantalla de la interfaz gráfica de usuario para &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). Esta interfaz permite controlar la cámara y ajustar los ajustes de iluminación del microscopio para los modos epifluorescente y de campo brillante. Las flechas rojas apuntan a los botones de enfoque y transmisión que activan la cámara para adquirir imágenes rápidamente y abrir el obturador de la luz transmitida, respectivamente. Las flechas azules se utilizan para mover el escenario para el origen y, a continuación, establecer el origen con el botón &quot;Go Origin&quot; y el botón &quot;Set&quot;. Las flechas verdes apuntan a &quot;Reset&quot; y &quot;ODELAY !!!&quot; Que restablecen los modos de imagen ODELAY a las condiciones actuales e inician la recopilación de imágenes ODELAY. Imágenes en tiempo transcurrido de la levadura que crece en medio sólido a 0, 3, 6 y 9 h después del manchado ( B ). Una captura de pantalla de la interfaz gráfica de usuario para &quot;ODELAY_IPT.m&quot; o th<html> E Herramienta de procesamiento de imágenes ODELAY ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> Figura 4: Ejemplo de salida ODELAY. Este conjunto de datos compara las cepas BY4741 y BY4742 en los medios YPD. Esta figura es un ejemplo de una diapositiva de agarosa bien preparada; Sin embargo, las configuraciones de enfoque automático no son óptimas. Los datos presentados en cada columna, de izquierda a derecha, son: la capacidad de carga en Log 2 del área de la colonia; Tiempo de duplicación, dado en min; Y el tiempo de retardo, dado en min. En este ejemplo, los tiempos de duplicación de todos los puntos en la placa de agar se alinean bien con una pequeña cantidad de aumento del tiempo de duplicación hacia la columna. Sin embargo, los tiempos de retraso varían considerablemente en este conjunto de datos._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> Figura 5: Ejemplos de la curva de crecimiento. Este ejemplo demuestra cómo un enfoque inicial deficiente puede hacer que el tiempo de retardo estimado (t lag ) aumente ( A ), mientras que la posición adyacente muestra un tiempo de retardo más corto ( B ). T d es el tiempo de duplicación en min, y t lag es el tiempo de retardo en min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> Figura 6: Ejemplo de experimento de prueba bien ejecutado. AnXample de la cepa BY4742 probada después de reemplazar una bombilla halógena de tungsteno con un iluminador de diodo y asegurarse de que el autofoco está ajustado correctamente. Todos los tiempos de duplicación parecen superponerse bien y los tiempos de retraso parecen ser consistentes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Presentamos un método para cuantificar los fenotipos de crecimiento de células de levadura individuales a medida que crecen en colonias en medios sólidos usando microscopía de lapso de tiempo denominada Evaluación de Duplicación de células vivas de levaduras (ODELAY). La heterogeneidad de la población de células genéticamente idénticas que crecen en colonias puede observarse y cuantificarse directamente.

ODELAY: Un método a gran escala para la cuantificación multiparamétrica del crecimiento de la levadura

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

El objetivo general de ODELAY es medir los fenotipos de crecimiento de células individuales que forman colonias, de manera de alto rendimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en microbiología, genética y biología de sistemas, como los efectos de perturbaciones genéticas e interacciones de fármacos sobre los fenotipos de crecimiento de cualquier microorganismo formador de colonias. La principal ventaja de ODELAY es que permite al investigador observar y cuantificar directamente la heterogeneidad poblacional entre un gran número de individuos.Antes de armar el molde de agar, limpie los moldes de acrílico con etanol al 70 % y séquelos utilizando aire forzado. Hay tres piezas inferiores y dos piezas verticales. Para comenzar el ensamblaje del molde de agar, tome las tres piezas inferiores y ensámblelas de manera que las dos piezas idénticas enmarquen la tercera pieza.Utilice dos sujetadores pequeños para fijar las piezas base en cada lado. Coloque los elementos verticales en el molde asegurándose de que la curva láser esté correctamente posicionada. Coloque una portaobjetos limpia y seca sobre el molde y sosténgala en su lugar mientras coloca una segunda portaobjetos en el otro lado.Sujete el conjunto con una pinza de papel grande. Sujete ambas laminillas con pinzas de papel grandes, asegurándose de que cada pinza superior esté en contacto con la laminilla de vidrio, solapando el acrílico. Antes de llenar el molde ensamblado con agar fundido, asegúrese de que los bordes estén sellados pipeteando aproximadamente 70 microlitros de medio de agar fundido a lo largo del lado interno del molde.Llene el molde sin atrapar burbujas de aire en su interior, pipeteando lentamente el agar fundido a lo largo del borde del molde. Una vez lleno el molde, déjelo enfriar a una temperatura ambiente de aproximadamente 23 grados Celsius durante 40-60 minutos. El siguiente paso es la separación del molde.Comience por retirar la grapa inferior. Luego retire la parte inferior del molde, que consta de las tres piezas superpuestas. Sostenga las laminillas comprimiéndolas y luego retire cuidadosamente las grapas. Coloque el molde en el borde de la mesa de trabajo de manera que el lado del molde con el punto azul quede hacia arriba. Coloque ambos pulgares debajo del acrílico y los primeros dedos en la parte superior, hacia el borde interno del molde, y empuje lentamente y con cuidado hacia arriba con los pulgares contra el molde, como si hiciera girar el espaciador del molde sobre su borde inferior. Aplique presión constante pero gradualmente creciente.Debe aparecer una ruptura y una burbuja de aire a lo largo de la línea donde el vidrio superior cubre el espaciador del molde. Tras observar la línea inicial de ruptura, continúe empujando hacia arriba con ambos pulgares y aplique presión constante. El agar debería comenzar a desprenderse del vidrio.Continúe pivotando el molde hacia arriba. Cuando el vidrio se suelte por completo, tómelo y retírelo completamente del molde. Luego, retire la otra pieza del molde utilizando un movimiento similar para levantarla sin mover el agar.Coloque los portaobjetos en una caja estéril para puntas con algo de agua estéril de alta pureza en el fondo. Cierre la caja y almacénela a 4 grados Celsius durante la noche para su uso al día siguiente. Inicie este procedimiento preparando las cepas en una placa de 96 pocillos según se describe en el protocolo escrito.Utilice un lector de placas para medir la densidad óptica a 600 nanómetros de cada cultivo. A continuación, utilice un protocolo de dilución automatizado para diluir los cultivos en la placa hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nanómetros de aproximadamente 0,1. Una vez configurado el programa de dilución, coloque las placas, tubos y puntas en la plataforma del robot de manipulación de líquidos según se indica en el diseño de la plataforma.Haga clic en el botón de reproducción para ejecutar el programa de dilución. Seleccione el número correcto de puntas de 50 microlitros y el número correcto de puntas de 300 microlitros. Cuando la dilución haya terminado, retire la placa de dilución del robot y cultive la placa a 30 grados Celsius, manteniendo la humedad para evitar que la placa se seque durante cinco a seis horas.Aproximadamente una o dos horas antes de que finalice la incubación de la placa de cultivo, encienda las cámaras de incubación para el microscopio y déjelas equilibrar a 30 grados Celsius. Diluya el cultivo por segunda vez hasta una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,01 a 0,02 utilizando el mismo protocolo de dilución automatizado. Cubra la placa de dilución con un sello metálico para congelador y sométala a ultrasonidos en un baño de hielo durante 30 segundos con la placa flotando en agua con hielo.Etiquete cuatro placas de 96 pocillos con fondo plano como uno, dos, tres y cuatro. Transfiera 150 microlitros de cada cultivo sonicado desde la placa de dilución a las placas de fondo plano siguiendo este patrón: los pocillos A1 a D6 a los pocillos C4 a F9 de la Placa Uno.Los pozos A7 a D12 a los pozos C4 a F9 de la Placa Dos. Los pozos E1 a H6 a los pozos C4 a F9 de la Placa Tres. Y los pozos E7 a H12 a los pozos C4 a F9 de la Placa Cuatro.Para comenzar este procedimiento, coloque correctamente la placa de agarosa en la cámara para portaobjetos. A continuación, coloque las placas de 96 pocillos con fondo plano sobre la mesa en orden según su cuadrante. Placa Uno, Placa Dos, Placa Tres y Placa Cuatro de izquierda a derecha.Coloque puntas en cuatro cajas de puntas vacías de manera que los 24 pozos internos de cada caja estén ocupados con puntas. En una quinta caja, coloque una punta en la posición C10 y puntas con el extremo cortado en las posiciones A1, A12, H1 y H12. Estas cuatro puntas cortadas proporcionarán estabilidad para la pinza de la placa de puntas.Coloque la primera punta perforadora en el sitio inicial del programa de control de impresión del robot para hacer un orificio en el agarosa que se utilizará posteriormente para alinear la coordenada de origen. Coloque la Placa Uno en el robot de manipulación líquida para imprimir el primer cuadrante. Retire la tapa y continúe con el programa de impresión.Verifique que todos los puntos estén presentes. Vacíe las puntas usadas en el recipiente de bioseguridad y coloque puntas nuevas en el robot. Espere aproximadamente 30 segundos para que los puntos sequen hasta un diámetro de alrededor de un milímetro y luego continúe con el programa.Sustituya la Placa Uno por la Placa Dos y continúe con el programa de inoculación. Cuando se hayan inoculado los cuatro cuadrantes y las gotas estén secas, coloque la tapa de la cámara para portaobjetos y gire el aparato. Coloque un portaobjetos de vidrio en la parte superior de la cámara para portaobjetos.Coloque primero la cámara de la placa en el microscopio. La microscopía de lapso de tiempo se realiza ejecutando un script diseñado personalizado. Haga clic en el obturador para abrir el obturador de luz transmitida y luego en el botón de enfoque para iniciar la alta velocidad de la cámara.Haga clic en Ir al origen y mueva la platina para encontrar la marca de origen que fue perforada en el agar, luego muévala ligeramente hacia la derecha para enfocar las células colocadas en el área E7. Regrese a la perforación de origen y colóquela en el centro del campo de visión. Establezca el origen a este valor presionando el botón Establecer. Muévase a la posición H18 y enfoque utilizando el tornillo hexagonal más cercano a esa ubicación.Luego, muévase a la posición L7 y enfoque utilizando el tornillo hexagonal más cercano a esa ubicación. Finalmente, muévase a la posición E7 y enfoque utilizando el tornillo hexagonal más cercano a esa ubicación. Verifique el enfoque en el centro y en los bordes en los puntos E12, H12 y L12, y ajuste el rango de enfoque automático si los valores z del enfoque, indicados por el valor z, son mayores que más o menos el rango de enfoque automático.Pulse el botón Reiniciar y luego pulse ODELAY. Elija el directorio donde guardar los datos. El microscopio recopilará datos durante 48 horas o hasta que se cierre el programa.Estas imágenes representativas de lapso de tiempo muestran células de levadura creciendo en medio sólido a las cero horas, tres horas, seis horas y nueve horas después de la siembra. Se muestra aquí un conjunto de datos representativo que compara dos cepas de levadura tras el procesamiento de las imágenes de lapso de tiempo. Los tiempos de duplicación relativamente uniformes reflejan la preparación adecuada del portaobjetos de agarosa; sin embargo, los tiempos de latencia varían considerablemente debido a ajustes de enfoque automático que no son óptimos.Un conjunto de datos más consistente se muestra aquí, en el cual todos los tiempos de duplicación parecen solaparse bien y los tiempos de latencia parecen ser consistentes. Una vez dominada, la configuración de ODELAY puede realizarse en tres o cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Los pasos más críticos para obtener mediciones repetibles de ODELAY son preparar el medio de manera consistente y evitar deformar mecánicamente el medio mientras se separan las laminillas.ODELAY es un ensayo muy sensible. Por ejemplo, puede observar defectos de crecimiento en cepas de levadura sensibles a la temperatura a temperatura ambiente, mientras que los ensayos basados en puntos comúnmente utilizados requieren el cultivo de levaduras a 37 grados centígrados para revelar un defecto de crecimiento. Aunque ODELAY ha sido desarrollado en levaduras, el método es aplicable a cualquier organismo formador de colonias, incluidos patógenos, para explorar una amplia gama de condiciones genéticas y ambientales y comprender el comportamiento de los microorganismos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar ODELAY para medir los fenotipos de crecimiento de microorganismos unicelulares que forman colonias en medios sólidos. No olvide que trabajar con microorganismos puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar equipo de protección personal adecuado para los organismos estudiados.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Envejecimiento cronológico en la levadura se refiere a la pérdida de la viabilidad celular asociado con el tiempo en la fase estacionaria. Aquí se describe un método de alto rendimiento para determinar cuantitativamente la levadura abarcan la vida cronológica.

Cuantificar cronológico levadura Duración de la vida por consecuencia de células envejecidas

Análisis de aptitud cuantitativa (QFA) es una serie complementaria de los métodos experimentales y computacionales para la estimación de eficacias de cultivos microbianos. QFA estima el efecto de mutaciones genéticas, medicamentos u otros tratamientos aplicados en el crecimiento de microbios. Los experimentos de escala a partir del análisis de las culturas individuales enfocada a miles de culturas paralelas se pueden diseñar.

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Se presenta un protocolo sencillo para obtener películas de microscopía de fluorescencia de las células de levadura en crecimiento, y un paquete de software basado en GUI para extraer los datos de series de tiempo de una sola célula. El análisis incluye linaje automático y la asignación por división de tiempo integrado con inspección visual y manual de conservación de los datos de seguimiento.

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Dos métodos complementarios basados ​​en citometría de flujo y microscopía se presentan que permiten la cuantificación, a nivel de una sola célula, de la dinámica de la expresión génica inducidos por la activación de una vía MAPK en la levadura.

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Aquí describimos un ensayo biológico robusto para cuantificar la tasa relativa de proteólisis por el sistema ubiquitina-proteasoma. La lectura del ensayo es la tasa de crecimiento de la levadura en cultivo líquido, que depende de los niveles celulares de una proteína reportera que comprende una señal de degradación fusionada con un marcador metabólico esencial.

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Los fenotipos de crecimiento de levadura se miden con precisión a través de imágenes de lapso de tiempo altamente paralelas de células inmovilizadas que crecen en microcolonías. Simultáneamente, se puede monitorear la tolerancia al estrés, la expresión proteica y la localización de proteínas, generando conjuntos de datos integrados para estudiar cómo las diferencias ambientales y genéticas, así como la heterogeneidad de la expresión génica entre las células isogénicas, modulan el crecimiento.

Imágenes en vivo de alto rendimiento de microcolonias para medir la heterogeneidad en crecimiento y expresión génica

Presentamos un protocolo para la identificación y cuantificación de las principales clases de metabolitos solubles en agua en la levadura Saccharomyces cerevisiae. El método descrito es versátil, robusto y sensible. Permite la separación de isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de metabolitos solubles en agua entre sí.

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Aprende el método ODELAY para cuantificar fenotipos de crecimiento en levadura mediante microscopía de lapso de tiempo. Esta técnica permite observar la heterogeneidad poblacional en células individuales de Saccharomyces cerevisiae.

ODELAY: Un método a gran escala para la cuantificación multiparamétrica del crecimiento de la levadura

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