ODELAY: Un método a gran escala para la cuantificación multiparamétrica del crecimiento de la levadura

El objetivo general de ODELAY es medir los fenotipos de crecimiento de células individuales que forman colonias, de manera de alto rendimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en microbiología, genética y biología de sistemas, como los efectos de perturbaciones genéticas e interacciones de fármacos sobre los fenotipos de crecimiento de cualquier microorganismo formador de colonias. La principal ventaja de ODELAY es que permite al investigador observar y cuantificar directamente la heterogeneidad poblacional entre un gran número de individuos.

Antes de armar el molde de agar, limpie los moldes de acrílico con etanol al 70 % y séquelos utilizando aire forzado. Hay tres piezas inferiores y dos piezas verticales. Para comenzar el ensamblaje del molde de agar, tome las tres piezas inferiores y ensámblelas de manera que las dos piezas idénticas enmarquen la tercera pieza.

Utilice dos sujetadores pequeños para fijar las piezas base en cada lado. Coloque los elementos verticales en el molde asegurándose de que la curva láser esté correctamente posicionada. Coloque una portaobjetos limpia y seca sobre el molde y sosténgala en su lugar mientras coloca una segunda portaobjetos en el otro lado.

Sujete el conjunto con una pinza de papel grande. Sujete ambas laminillas con pinzas de papel grandes, asegurándose de que cada pinza superior esté en contacto con la laminilla de vidrio, solapando el acrílico. Antes de llenar el molde ensamblado con agar fundido, asegúrese de que los bordes estén sellados pipeteando aproximadamente 70 microlitros de medio de agar fundido a lo largo del lado interno del molde.

Llene el molde sin atrapar burbujas de aire en su interior, pipeteando lentamente el agar fundido a lo largo del borde del molde. Una vez lleno el molde, déjelo enfriar a una temperatura ambiente de aproximadamente 23 grados Celsius durante 40-60 minutos. El siguiente paso es la separación del molde.

Comience por retirar la grapa inferior. Luego retire la parte inferior del molde, que consta de las tres piezas superpuestas. Sostenga las laminillas comprimiéndolas y luego retire cuidadosamente las grapas.

Coloque el molde en el borde de la mesa de trabajo de manera que el lado del molde con el punto azul quede hacia arriba. Coloque ambos pulgares debajo del acrílico y los primeros dedos en la parte superior, hacia el borde interno del molde, y empuje lentamente y con cuidado hacia arriba con los pulgares contra el molde, como si hiciera girar el espaciador del molde sobre su borde inferior. Aplique presión constante pero gradualmente creciente.

Debe aparecer una ruptura y una burbuja de aire a lo largo de la línea donde el vidrio superior cubre el espaciador del molde. Tras observar la línea inicial de ruptura, continúe empujando hacia arriba con ambos pulgares y aplique presión constante. El agar debería comenzar a desprenderse del vidrio.

Continúe pivotando el molde hacia arriba. Cuando el vidrio se suelte por completo, tómelo y retírelo completamente del molde. Luego, retire la otra pieza del molde utilizando un movimiento similar para levantarla sin mover el agar.

Coloque los portaobjetos en una caja estéril para puntas con algo de agua estéril de alta pureza en el fondo. Cierre la caja y almacénela a 4 grados Celsius durante la noche para su uso al día siguiente. Inicie este procedimiento preparando las cepas en una placa de 96 pocillos según se describe en el protocolo escrito.

Utilice un lector de placas para medir la densidad óptica a 600 nanómetros de cada cultivo. A continuación, utilice un protocolo de dilución automatizado para diluir los cultivos en la placa hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nanómetros de aproximadamente 0,1. Una vez configurado el programa de dilución, coloque las placas, tubos y puntas en la plataforma del robot de manipulación de líquidos según se indica en el diseño de la plataforma.

Haga clic en el botón de reproducción para ejecutar el programa de dilución. Seleccione el número correcto de puntas de 50 microlitros y el número correcto de puntas de 300 microlitros. Cuando la dilución haya terminado, retire la placa de dilución del robot y cultive la placa a 30 grados Celsius, manteniendo la humedad para evitar que la placa se seque durante cinco a seis horas.

Aproximadamente una o dos horas antes de que finalice la incubación de la placa de cultivo, encienda las cámaras de incubación para el microscopio y déjelas equilibrar a 30 grados Celsius. Diluya el cultivo por segunda vez hasta una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,01 a 0,02 utilizando el mismo protocolo de dilución automatizado. Cubra la placa de dilución con un sello metálico para congelador y sométala a ultrasonidos en un baño de hielo durante 30 segundos con la placa flotando en agua con hielo.

Etiquete cuatro placas de 96 pocillos con fondo plano como uno, dos, tres y cuatro. Transfiera 150 microlitros de cada cultivo sonicado desde la placa de dilución a las placas de fondo plano siguiendo este patrón: los pocillos A1 a D6 a los pocillos C4 a F9 de la Placa Uno.

Los pozos A7 a D12 a los pozos C4 a F9 de la Placa Dos. Los pozos E1 a H6 a los pozos C4 a F9 de la Placa Tres. Y los pozos E7 a H12 a los pozos C4 a F9 de la Placa Cuatro.

Para comenzar este procedimiento, coloque correctamente la placa de agarosa en la cámara para portaobjetos. A continuación, coloque las placas de 96 pocillos con fondo plano sobre la mesa en orden según su cuadrante. Placa Uno, Placa Dos, Placa Tres y Placa Cuatro de izquierda a derecha.

Coloque puntas en cuatro cajas de puntas vacías de manera que los 24 pozos internos de cada caja estén ocupados con puntas. En una quinta caja, coloque una punta en la posición C10 y puntas con el extremo cortado en las posiciones A1, A12, H1 y H12. Estas cuatro puntas cortadas proporcionarán estabilidad para la pinza de la placa de puntas.

Coloque la primera punta perforadora en el sitio inicial del programa de control de impresión del robot para hacer un orificio en el agarosa que se utilizará posteriormente para alinear la coordenada de origen. Coloque la Placa Uno en el robot de manipulación líquida para imprimir el primer cuadrante. Retire la tapa y continúe con el programa de impresión.

Verifique que todos los puntos estén presentes. Vacíe las puntas usadas en el recipiente de bioseguridad y coloque puntas nuevas en el robot. Espere aproximadamente 30 segundos para que los puntos sequen hasta un diámetro de alrededor de un milímetro y luego continúe con el programa.

Sustituya la Placa Uno por la Placa Dos y continúe con el programa de inoculación. Cuando se hayan inoculado los cuatro cuadrantes y las gotas estén secas, coloque la tapa de la cámara para portaobjetos y gire el aparato. Coloque un portaobjetos de vidrio en la parte superior de la cámara para portaobjetos.

Coloque primero la cámara de la placa en el microscopio. La microscopía de lapso de tiempo se realiza ejecutando un script diseñado personalizado. Haga clic en el obturador para abrir el obturador de luz transmitida y luego en el botón de enfoque para iniciar la alta velocidad de la cámara.

Haga clic en Ir al origen y mueva la platina para encontrar la marca de origen que fue perforada en el agar, luego muévala ligeramente hacia la derecha para enfocar las células colocadas en el área E7. Regrese a la perforación de origen y colóquela en el centro del campo de visión. Establezca el origen a este valor presionando el botón Establecer. Muévase a la posición H18 y enfoque utilizando el tornillo hexagonal más cercano a esa ubicación.

Luego, muévase a la posición L7 y enfoque utilizando el tornillo hexagonal más cercano a esa ubicación. Finalmente, muévase a la posición E7 y enfoque utilizando el tornillo hexagonal más cercano a esa ubicación. Verifique el enfoque en el centro y en los bordes en los puntos E12, H12 y L12, y ajuste el rango de enfoque automático si los valores z del enfoque, indicados por el valor z, son mayores que más o menos el rango de enfoque automático.

Pulse el botón Reiniciar y luego pulse ODELAY. Elija el directorio donde guardar los datos. El microscopio recopilará datos durante 48 horas o hasta que se cierre el programa.

Estas imágenes representativas de lapso de tiempo muestran células de levadura creciendo en medio sólido a las cero horas, tres horas, seis horas y nueve horas después de la siembra. Se muestra aquí un conjunto de datos representativo que compara dos cepas de levadura tras el procesamiento de las imágenes de lapso de tiempo. Los tiempos de duplicación relativamente uniformes reflejan la preparación adecuada del portaobjetos de agarosa; sin embargo, los tiempos de latencia varían considerablemente debido a ajustes de enfoque automático que no son óptimos.

Un conjunto de datos más consistente se muestra aquí, en el cual todos los tiempos de duplicación parecen solaparse bien y los tiempos de latencia parecen ser consistentes. Una vez dominada, la configuración de ODELAY puede realizarse en tres o cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Los pasos más críticos para obtener mediciones repetibles de ODELAY son preparar el medio de manera consistente y evitar deformar mecánicamente el medio mientras se separan las laminillas.

ODELAY es un ensayo muy sensible. Por ejemplo, puede observar defectos de crecimiento en cepas de levadura sensibles a la temperatura a temperatura ambiente, mientras que los ensayos basados en puntos comúnmente utilizados requieren el cultivo de levaduras a 37 grados centígrados para revelar un defecto de crecimiento. Aunque ODELAY ha sido desarrollado en levaduras, el método es aplicable a cualquier organismo formador de colonias, incluidos patógenos, para explorar una amplia gama de condiciones genéticas y ambientales y comprender el comportamiento de los microorganismos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar ODELAY para medir los fenotipos de crecimiento de microorganismos unicelulares que forman colonias en medios sólidos. No olvide que trabajar con microorganismos puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar equipo de protección personal adecuado para los organismos estudiados.