ODELAY: Un método a gran escala para la cuantificación multiparamétrica del crecimiento de la levadura

El objetivo general de ODELAY es medir los fenotipos de crecimiento de células individuales que se convierten en colonias de una manera de alto rendimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en microbiología, genética y biología de sistemas, como los efectos de las perturbaciones genéticas y las interacciones farmacológicas en los fenotipos de crecimiento de cualquier microorganismo formador de colonias. La principal ventaja de ODELAY es que permite al investigador observar y cuantificar directamente la heterogeneidad poblacional entre un gran número de individuos.

Antes de montar el molde de agar, limpie los moldes acrílicos con etanol al 70% y séquelos con aire forzado. Hay tres piezas inferiores y dos piezas verticales. Para comenzar el montaje del molde de agar, tome las tres piezas inferiores y múntelas de modo que las dos piezas idénticas se intercalen con la tercera pieza.

Use dos clips de carpeta pequeños para sujetar las piezas base a cada lado. Coloque los montantes en el molde asegurándose de que la curva láser esté colocada correctamente. Coloque un portaobjetos de vidrio limpio y seco en el molde y manténgalo en su lugar mientras coloca un segundo portaobjetos de vidrio en el otro lado.

Sujete el conjunto con un clip de encuadernación más grande. Sujete ambos portaobjetos con clips de carpeta más grandes, asegurándose de que cada clip de carpeta superior esté en contacto con el portaobjetos de vidrio superpuesto al acrílico. Antes de llenar el molde ensamblado con agar fundido, asegúrese de que los bordes estén sellados pipeteando unos 70 microlitros de medio de agar fundido a lo largo del lado interior del molde.

Llene el molde sin atrapar burbujas de aire en el interior pipeteando lentamente el agar fundido a lo largo del borde del molde. Una vez que se llene el molde, deje que se enfríe a unos 23 grados centígrados de temperatura ambiente durante 40-60 minutos. El siguiente paso es la separación del molde.

Comience quitando el clip de carpeta inferior. A continuación, retira la parte inferior del molde que consta de las tres piezas intercaladas. Sujete las diapositivas comprimiéndolas y luego retire los clips de carpeta con cuidado.

Coloque el molde en el borde de la mesa de trabajo de modo que el lado del molde con el punto azul quede hacia arriba. Coloque ambos pulgares debajo del acrílico y los dedos índices en la parte superior hacia el borde interior del molde y empuje lenta y cuidadosamente hacia arriba con los pulgares contra el molde como si girara el espaciador del molde alrededor de su borde inferior. Aplique una presión constante pero que aumente lentamente.

Debe aparecer una rotura y una burbuja de aire a lo largo de una línea donde el vidrio superior cubre el espaciador del molde. Después de ver la línea de rotura inicial, continúe empujando hacia arriba con ambos pulgares y aplique presión constante. El agar debe comenzar a desprenderse del vidrio.

Continúa girando el molde hacia arriba. A medida que el vaso se libera por completo, agárralo y retíralo por completo del molde. A continuación, retire la otra pieza del molde con un movimiento similar para levantar la pieza sin mover el agar.

Coloque los portaobjetos en una caja de punta estéril con un poco de agua estéril de alta pureza en el fondo. Cierre la caja y guárdela a 4 grados centígrados durante la noche para usarla al día siguiente. Comience este procedimiento preparando las cepas en una placa de 96 pocillos como se describe en el protocolo de texto.

Uso de un lector de placas para medir la densidad óptica a 600 nanómetros de cada cultivo. A continuación, utilice un protocolo de dilución automatizado para diluir los cultivos en la placa hasta una densidad óptica de 600 nanómetros de aproximadamente 0,1. Una vez que se configura el programa de dilución, cargue las placas, los tubos y las puntas en la plataforma del robot de manejo de líquidos según lo indicado por el diseño de la plataforma.

Haga clic en el botón de reproducción para ejecutar el programa de dilución. Seleccione el número correcto de puntas de 50 microlitros y el número correcto de puntas de 300 microlitros. Una vez finalizada la dilución, retire la placa de dilución del robot y cultive la placa a 30 grados centígrados manteniendo la humedad para evitar que la placa se seque durante cinco o seis horas.

Aproximadamente una o dos horas antes de que se complete la incubación de la placa de cultivo, encienda las cámaras de incubación para el microscopio y permita que se equilibren a 30 grados centígrados. Diluir el cultivo por segunda vez a una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,01 a 0,02 utilizando el mismo protocolo de dilución automatizado. Cubra la placa de dilución con un sello metálico para congelador y sonique en un baño de hielo durante 30 segundos con la placa flotando en agua helada.

Etiquete cuatro placas de fondo plano de 96 pocillos como uno, dos, tres y cuatro. Transfiera 150 microlitros de cada cultivo sonicado de la placa de dilución a las placas de fondo plano siguiendo este patrón. Los pozos A1 a D6 en los pozos C4 a F9 de la Placa Uno.

Los pozos A7 a D12 en los pozos C4 a F9 de la Placa Dos. Los pozos E1 a H6 en los pozos C4 a F9 de la Placa Tres. Y los pozos E7 a H12 en los pozos C4 a F9 de la Placa Cuatro.

Para comenzar este procedimiento, coloque el portaobjetos de agarosa correctamente en la cámara del portaobjetos. A continuación, coloque las placas de fondo plano de 96 pocillos sobre la mesa en orden de su cuadrante. Placas Uno, Dos, Tres y Cuatro de izquierda a derecha.

Coloque las puntas en cuatro cajas de puntas vacías de modo que los 24 pozos interiores de cada caja de propinas estén ocupadas con puntas. En una quinta caja, coloque una punta en la posición C10 y las puntas con el extremo cortado en las posiciones A1, A12, H1 y H12. Estas cuatro puntas de corte proporcionarán estabilidad a la abrazadera de la placa de la punta.

Coloque el primer punzón de punta en el sitio de inicio del programa de detección de control del robot para perforar un agujero en la agarosa que se utilizará más tarde para alinear la coordenada de origen. Coloque la placa uno en el robot de manejo de líquidos para detectar el primer cuadrante. Retire la tapa y continúe con el programa de manchado.

Verifique que todos los puntos estén presentes. Vacíe las puntas usadas en el contenedor de riesgo biológico y coloque las puntas nuevas en el robot. Espere unos 30 segundos para que las manchas se sequen hasta aproximadamente un milímetro de diámetro y luego continúe con el programa.

Cambie la Placa Uno por la Placa Dos y continúe con el programa de manchado. Cuando se hayan detectado los cuatro cuadrantes y las manchas estén secas, vuelva a colocar la tapa de la cámara deslizante y dé la vuelta al aparato. Coloque un portaobjetos de vidrio en la parte superior de la cámara del portaobjetos.

Primero cargue la cámara de portaobjetos en el microscopio. La microscopía de lapso de tiempo se realiza mediante la ejecución de un script diseñado a medida. Haga clic en el obturador para abrir el obturador de luz transmitida y luego en el botón de enfoque para iniciar la alta velocidad de la cámara.

Haga clic en Ir a Origen" y mueva el escenario para encontrar la marca de origen que se perforó en el agar, luego muévase ligeramente hacia la derecha para enfocarse en las células detectadas en el área E7. Vuelve al punzón de origen y céntralo en el campo de visión. Establezca el origen en este valor pulsando el botón "Establecer". Muévase a la posición H18 y enfoque con el tornillo hexagonal más cercano a esa ubicación.

A continuación, muévase a la posición L7 y enfoque con el tornillo hexagonal más cercano a esa ubicación. Finalmente, muévase a la posición E7 y enfoque usando el tornillo hexagonal más cercano a esa ubicación. Compruebe el enfoque en el centro y en los bordes en los puntos E12, H12 y L12 Ajuste el rango de enfoque automático si los valores z de enfoque indicados por el valor z son mayores que más o menos el rango de enfoque automático.

Presione el botón "Reset" y luego presione ODELAY. Elija el directorio para guardar los datos. El microscopio recogerá datos durante 48 horas o hasta que se cierre el programa.

Estas imágenes representativas de lapso de tiempo muestran células de levadura creciendo en medio sólido como cero horas, tres horas, seis horas y nueve horas después del manchado. Aquí se muestra un conjunto de datos representativo que compara dos cepas de levadura después de procesar las imágenes de lapso de tiempo. Los tiempos de duplicación relativamente uniformes reflejan el deslizamiento de agarosa bien preparado, sin embargo, los tiempos de retraso varían considerablemente debido a los ajustes de enfoque automático que no son óptimos.

Aquí se muestra un conjunto de datos más consistente en el que todos los tiempos de duplicación parecen superponerse bien y los tiempos de retraso parecen ser consistentes. Una vez dominado, la configuración de ODELAY se puede realizar en tres o cuatro horas si se realiza correctamente. Los pasos más críticos para las mediciones repetibles de ODELAY son la preparación del medio de manera consistente y evitar la deformación mecánica del medio mientras se separan los portaobjetos.

ODELAY es un ensayo muy sensible. Por ejemplo, puede observar defectos de crecimiento en cepas de levadura sensibles a la temperatura a temperatura ambiente, mientras que los ensayos puntuales de uso común requieren cultivar levadura a 37 grados centígrados para revelar un defecto de crecimiento. Si bien ODELAY se ha desarrollado en levaduras, el método es aplicable a cualquier organismo formador de colonias, incluidos los patógenos, para explorar una amplia gama de condiciones ambientales y genéticas para comprender el comportamiento de los microorganismos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar ODELAY para medir los fenotipos de crecimiento de microorganismos unicelulares que forman colonias en medios sólidos. No hay que olvidar que trabajar con microorganismos puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipos de protección personal adecuados para los organismos estudiados.