Monitorización óptica y electrofisiológica simultánea de células neuronales en cortes de cerebro

Comience perfundiendo un líquido cefalorraquídeo artificial aireado o aCSF sobre una rejilla de malla en una cámara de perfusión.

Transfiera un corte de cerebro que contenga neuronas que expresan proteínas fluorescentes y fíjelo con un dispositivo con cable de platino.

Gire la rejilla de malla para alinearla.

Baje la sonda multicanal hacia el corte.

Ajuste el cubo de filtro para la visualización de proteínas fluorescentes.

Gire la rebanada para alinear la sonda.

Ajuste la altura de la sonda por debajo de la superficie del tejido.

Ahora, perfunde el aCSF y concéntrate en las neuronas marcadas con fluorescencia.

Usando un objetivo de alta potencia, concéntrese en el tejido y ajuste la luz de excitación.

Use un filtro de luz apropiado para observar la fluorescencia en las neuronas.

Ajuste la lente del objetivo para crear espacio para la pipeta de parche y aplique presión positiva.

A continuación, coloque la pipeta cerca de la neurona para formar un hoyuelo de membrana.

Finalmente, aplique una succión débil para crear un sello de membrana, seguido de una succión fuerte para romper la membrana y obtener registros eléctricos de la neurona objetivo.

Para colocar la sonda multicanal en el portaobjetos de tejido cerebral ex vivo, perfundir ACSF experimental burbujeó a tres a seis mililitros por minuto y transfirió el corte cerebral que contiene el área de interés a la rejilla de malla en la cámara de perfusión del microscopio. Ancle el corte de cerebro con un arpa de platino. Gire la rejilla de malla de modo que la línea de contactos del electrodo en el extremo distal de la sonda multicanal sea aproximadamente perpendicular a la superficie PL.

Bajo iluminación de campo amplio y control fino del micromanipulador, baje la sonda multicanal hacia la superficie de la rebanada. Enganche el cubo de filtro apropiado para la visualización de la proteína reportera fluorescente expresada en los terminales axónicos de los aferentes corticales.

Si es necesario, gire la rebanada para alinear con mayor precisión la sonda con la superficie PL. Coloque la sonda justo por encima del plano del corte, 200 micrómetros por debajo de la posición objetivo final a lo largo del eje x, dejando al menos un canal fuera del área de tejido que se está registrando. Lentamente, inserte la sonda en la rebanada a lo largo de su eje longitudinal.

Para minimizar el daño al tejido, solo avance la sonda en la medida en que las puntas afiladas sean visibles debajo de la superficie del tejido. Cambie la fuente experimental de ACSF a una solución de control en bolsas e identifique la celda marcada con fluorescencia para el registro de pinza de parche dirigido. Restrinja la apertura al diámetro más pequeño y active el objetivo de inmersión en agua de alta potencia, teniendo cuidado de evitar el contacto entre la sonda multicanal y la lente del objetivo. Enfoca el tejido.

Centre la luz sobre un área de tejido adyacente a la sonda multicanal, pero sin superponerla. Active el conjunto de filtros adecuado para permitir la obtención de imágenes de las células que expresan el marcador fluorescente dependiente de Cre. Levante la lente del objetivo para crear un amplio espacio para bajar una pipeta de parche.

Cargue una pipeta de parche con solución interna y móntela en el soporte del electrodo. Use una jeringa de un mililitro para aplicar presión positiva correspondiente a aproximadamente 0.1 mililitros de aire. Baje la pipeta de parche en la solución, enfocando la punta bajo guía visual, y obtenga un registro de células completas de la célula objetivo.