Name: Proyección de imagen multimodal jerárquica de secciones seriadas para encontrar dianas celulares específicas dentro de grandes volúmenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprende a identificar dianas celulares específicas en tejidos mediante tomografía de matrices combinando microscopía de luz y SEM de alta resolución. Este protocolo jerárquico facilita el estudio de la ultraestructura en biología celular, neurociencia y patología.

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Este trabajo fue apoyado por beca FKZ 13GW0044 del Ministerio Federal alemán de educación e investigación, proyecto MorphiQuant-3D. Agradecemos a Carolin Bartels para soporte técnico.

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KIT ha recibido reembolsos por Boeckeler Instruments para el suministro de un modelo funcional del soporte del sustrato. Marlene Thaler es empleado de ZEISS microscopio GmbH, fabricante de los sistemas del microscopio mencionados en este artículo. Además, ZEISS ofrece ciertas soluciones como paquetes de soluciones de Atlas de ZEISS para una amplia gama de aplicaciones en proyección de imagen de gran superficie, 3D para instrumentos SEM y FIB-SEM. Otros autores no tienen nada que revelar.

Se demostró un flujo de trabajo para apuntar las células específicas dentro de un tejido por multimodal en jerárquica: una muestra embebido en resina se rebana para arriba en arreglos de discos de secciones seriadas, que se colocan sobre un sustrato conductor de utilizar un sustrato diseñado. Después de etiquetar con un fluoróforo y la proyección de imagen en la FLM, el volumen reconstruido se utiliza para seleccionar las células diana. Después de la coloración adicional rondas con metales pesados para introducir el contraste, estos objetivos son reflejados en varias cientos secciones a nanoescala de resolución en un SEM utilizando una plataforma de software automatizado.
Para la producción de matrices densamente con varias cintas largas, un soporte de sustrato similar a la descrita aquí es necesario. Una persona calificada y paciente puede ser capaz de conectar varias cintas a un sustrato de silicio, semi sumergido en el barco de cuchillo y recuperar la matriz reduciendo gradualmente el nivel de agua hasta que las cintas están sentados sobre el sustrato. Sin embargo, en la nuestra experiencia, existe una tendencia a romper la formación cuando el sustrato está tocando cualquier parte del barco de cuchillo (cf. nota en 1.3.2 en protocolo). Además, este procedimiento es mucho más difícil con sustratos recubiertos de ITO: (1) debido a la transparencia del vidrio de ITO, es difícil ver la orilla del agua donde los extremos de las cintas deben ser Unido; y (2) porque la superficie revestida de ITO es mucho más áspera que la oblea de silicio altamente pulido, las cintas tienden a romperse durante la extracción y pequeños fragmentos de algunas secciones pueden flotar, así destruir el orden de las secciones.
El flujo de trabajo de todo también es factible sin correlación a los datos de la FLM. En este caso, toma de datos en el SEM tenga que realizarse en varias sesiones. Una reconstrucción 3D inicial o por lo menos evaluación de datos de baja o media resolución puede ser necesaria identificar los objetivos. Además, pueden aplicar manchas histológicas convencionales para brightfield LM (no requiriendo FLM). Por supuesto, otras opciones6,7,8 son anticuerpo etiquetado en las matrices, como ya quedó demostrado en el libro inicial en18, genéticamente codificado proteínas fluorescentes (XFPs) o la inclusión de etiquetado con la preservación de la fluorescencia durante la preparación de la muestra.
Una limitación general del método discutido es el uso de secciones de un grosor determinado y el muestreo discreto resultante del volumen 3D: resolución en Z sólo puede ser tan bueno como el espesor de las secciones desde el SEM recoge sólo datos de la superficie de la sección (d según la energía primaria energía/aterrizaje seleccionado). Esto significa que el volumen 3D resultante tiene vóxeles anisotrópica, por ej., 5 x 5 x 100 nm3 si 100 secciones de nm y un tamaño de pixel de imagen de 5 nm se utilizan. Para las entidades muy pequeñas en un rango de tamaño por debajo de 1 μm, esto puede no ser suficiente para una verdadera Descripción ultraestructural. Una limitación más técnica es la precisión de la etapa que se utiliza en el SEM para automatizado la proyección de imagen. Debido a esto, es necesario elegir un ROI mayor que las especificaciones de la exactitud de la etapa para garantizar que el área de la blanco completo es reflejado.
En comparación con SBF-SEM y FIB-SEM como métodos de proyección de imagen de bloque cara, correlativos en tiene la desventaja definitiva de vóxeles anisotrópicos, como se describe anteriormente. Con FIB-SEM, vóxeles isótropos de 5 x 5 x 5 nm3 pueden ser obtenido cuando una corrección de deriva adecuado es en el lugar.
Diferencias en el volumen reconstruido debido a la pérdida de las secciones durante la preparación de matrices pueden ser también una preocupación que no se encuentra con SBF-SEM o FIB-SEM. Con estabilización de buena cinta de pegamento, generalmente es sólo un tema para el último tramo de una cinta: pueden dañarse al lanzar desde el filo de la navaja con la pestaña. Sin embargo, en nuestra experiencia, la pérdida de una sección en cada tramos de 20-50 no influyen en registro de la imagen.
Por otro lado, la posibilidad de la mancha matrices confiere buena señal y contraste para la proyección de imagen de SEM, incluso en muestras débil metalizadas tales como la alta presión congelado ápices se muestra a continuación. Por lo tanto, no es necesario comprometer la conservación óptima ultraestructural por fijación química y numerosos pasos de metalización. Además, muestras de rutina del laboratorio de patología con grados intermedios de la metalización de entregan datos excelente10. Tal un realce de contraste la inclusión no es posible para SBF-SEM y FIB-SEM en general. Además, puesto que estos métodos son destructivos, es decir, consumir la muestra durante la proyección de imagen, jerárquico en sitios y diferentes resoluciones de imagen o proyección de imagen repetida en los puntos más adelante en el tiempo es imposible. En principio, volúmenes ilimitados, de gran campo de imagen (por ejemplo, hasta varios milímetros para cerebro de ratón todo en connectomics) crearon por mosaicos de costura, y un gran número de secciones puede ser adquirido por AT, mientras que en el FIB-SEM, campo de imagen más allá de 100 μm μm x 100 son difíciles de alcanzar con instrumentos de rutina.
Más automatización del AT-flujo de trabajo descrito sería una ventaja definitiva, ya que los métodos antes mencionados SBF-SEM y FIB-SEM realizan seccionamiento y la proyección de imagen en el mismo instrumento en una forma totalmente automatizada. Existe un tipo de automatización de la sección: ATUMtome la12 puede generar y recolectar miles de secciones, pero el uso de la cinta del Kapton como un sustrato de tales matrices difíciles de imagen en un FLM. Sobre el cubreobjetos recubierto ITO usado aquí, proyección de imagen de resolución súper incluso debería ser posible. Un objetivo adicional, muy accesible para la automatización sería la grabación de las pilas de datos FLM. Por otro lado, automatización puede ser cara y excepto el soporte del sustrato, el flujo de trabajo presentado aquí (en cuanto a hardware) sólo cuenta con instrumentación generalmente disponible en una rutina EM laboratorio o base, que bajo nivel de acceso.

Para la reconstrucción de grandes volúmenes de tejido en resolución ultraestructural de los diferentes métodos de proyección de imagen basada en SEM han sido usadas1: exámenes amplios están disponibles por ejemplo., SBF-SEM2, FIB-SEM3y matriz Tomografía (a)4. Mientras que para este último método la muestra del material se conserva como un conjunto de secciones seriadas en un substrato, SBF-SEM y FIB-SEM son métodos destructivos, trabajando en el bloque de muestra y consumirla durante proyección de imagen. Debido a la carga de la resina en el SEM, también dependen fuertemente metalizada muestra bloques5.
Por otra parte, identificar ciertas células o estructuras de interés dentro de una muestra de tejido puede beneficiar particularmente de correlativa luz y microscopia electrónica (CLEM)6,7,8. Utilizando FLM para apuntar excluye la aplicación de grandes cantidades de metales pesados ya que esto sería apagar la señal de la fluorescencia del9. Para dichas muestras ligeramente metalizados único, AT es el método de elección desde matrices pueden ser fácilmente posterior tinción con metales pesados después de la proyección de imagen de LM. Por otra parte, casi cualquier tipo de muestra puede utilizarse para AT, incluso rutinarias muestras desde el patólogo tesoro pecho10.
Otra gran ventaja del AT es el potencial de jerárquico11 o proyección de imagen de resolución múltiple12: no es necesario a la imagen todo en alta resolución, como metas pueden seleccionarse en una modalidad diferente (por ejemplo, FLM) o en baja resolución imágenes de SEM. Sólo las regiones interesantes de una población de tejido o células en alta resolución de imagen ahorra espacio de almacenamiento de datos digitales y produce pequeños conjuntos de datos de la imagen, que son más fáciles de manejar. Aquí, el flujo de trabajo de AT se demuestra utilizando una muestra más bien débil metalizada: alta presión congelados a raíz de la planta (Arabidopsis thaliana) incrustado en resina hidrofílica.
Se explicó cómo los arreglos son preparados, manchados y reflejados en FLM y SEM, y cómo se colocan las pilas de imágenes. Además, se ilustra cómo la reconstrucción 3D del volumen FLM se puede utilizar para seleccionar celdas específicas para la proyección de imagen en el SEM en escala nanométrica resolución.

<table><tbody><tr><td>Instrumentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotomo</td><td>RMC</td><td>PT-PC</td><td>Alternativa: Leica UC7</td></tr><tr><td>Soporte de sustrato</td><td>RMC</td><td>ASH-100</td><td>Alternativa:</td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td> casero <td>Diener</td><td>Zepto 40kHz</td><td>Alternativas: Ted Pella Pelco u otro limpiador de plasma de sobremesa Parámetros de ejemplo para Diener Zepto con generador de 40kHz (0-100W); 0,5 mbar, 5 sccm (aire), 10% de rendimiento&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio óptico de fluorescencia de campo amplio</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td>Alternativas: Leica, Nikon, Olympus</td></tr><tr><td>Juego de filtros de fluorescencia</td><td>Zeiss</td><td>43 HE (Cy3/DsRed)</td><td></td></tr><tr><td>Lente de objetivo</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Neofluar 40x</td><td>&nbsp; 0.75 NA</td></tr><tr><td>Estación de trabajo decente capaz de manejar datos</td><td></td><td></td><td></td>de imagen de tamaño GB</tr><tr><td>FESEM</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td>Alternativas: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Sectioning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de afeitar</td><td>Plano</td><td>T585-V</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillo de diamante para recortar 45&deg;</td><td>Diatome</td><td>DTB45</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillo de diamante para recortar 90&°;</td><td>Diatome</td><td>DTB90</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillo de diamante Jumbo para seccionar</td><td>Oblea</td><td>de DUJ3530</td><td></td></tr><tr><td>silicona Diatome (piezas)</td><td>Si-Mat</td><td></td><td>Dopaje a medida: P/Bor, orientación: < 100>, espesor: 525 &plusmn; 25 y micro; m, resistividad: 1-30 &Omega;-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td></tr><tr><td>cubreobjetos recubiertos de ITO</td><td>Balzers</td><td>Tipo Z</td><td>22 &veces; 22 &veces; 0,17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td></tr><tr><td>Soporte de aluminio</td><td>Custom Made 76</td><td></td><td>&times; 26 mm</td></tr><tr><td>Pinzas de oblea</td><td>Ideal-tek</td><td>34A.SA</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de muñón</td><td>Dumont</td><td>0103-2E1/2-PO-1</td><td>Dumoxel-H 2E 1/2</td></tr><tr><td>Trazador de diamantes</td><td>Plano</td><td>T5448</td><td></td></tr><tr><td>Pestañas/pelo de gato muy suave</td> Alternativa <td>hecha a</td><td></td> sí misma<td>: Cepillo plano</td></tr><tr><td>Adhesivo de contacto Pattex</td><td></td> hecho a <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>mano</tr> Pattex PCL3C Kraftkleber Classic (el amarillento)<tr><td>Fixogum</td><td>Marabu</td><td>290110001</td><td>para la fijación del sustrato al soporte</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva</td><td>3M</td><td>851</td><td>para la fijación del sustrato al soporte</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Bernd Kraft</td><td>07029.4000</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Carl Roth</td><td>4436</td><td>diluyente para la mezcla de cola</td></tr><tr><td>Rotihistol</td><td>Carl Roth</td><td>6640</td><td>alternativo, diluyente a base < limoneno</td></tr> <tr><td>fuerte>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Software</td>Procesamiento de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>imágenes</td><td>Código abierto</td><td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td><td></td></tr><tr><td>Adquisición de imágenes</td><td>Zeiss</td><td>Atlas 5 AT (módulo para Zeiss SEM)</td><td>Alternativa para la adquisición automatizada de imágenes: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidiumioyoduro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Solución madre: 1,5 mM en azida de sodio al 0,1 %</td></tr><tr><td>Acetato de uranio</td><td>Servicios Científicos</td><td>E22400</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de plomo (II)</td><td></td><td>107398</td><td></td></tr><tr><td>citrato de sodio trihidratado</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>gránulos de NaOH</td><td>Merck 106469</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solución de NaOH 1M</td><td>Bernd Kraft</td><td>01030.3000</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio</td><td>Duran</td><td>23 755 56</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</strong</td><td>>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Montaje</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stubs Plano</td><td></td><td>G301F</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de carbono</td><td>Plano</td><td>G3347</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de cobre</td><td>Plano</td><td>G3397</td><td>adhesivo de doble cara, conductor</td></tr><tr><td>Pintura plateada</td><td>Plano</td><td>G3692</td><td>Acheson Elektrodag 1415M</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Soluciones/mezclas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezcla adhesiva para bloques</td><td></td><td></td> de recubrimiento <td>Adhesivo de contacto Pattex /xileno como diluyente, relación 1:3. (Alternativa al xileno: Rotihistol)</td></tr><tr><td>Citrato</td><td></td><td></td> de plomo Reynolds <td>50 mL: Disuelva 1.33 g de nitrato de plomo (II) en 10 mL de dH2O. Disuelva 1.76 g de citrato trisódico dihidratado en 10 ml de mezcla dH2O. ambos y agregue 1 M de hidróxido de sodio hasta que la solución esté clara. Llene con dH2O hasta 50 mL.</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td><td>de tinción con yoduro de propidio</td><td>Prepare una dilución 1:1500 de stock en Vortex dH2O. para una mezcla adecuada.</td></tr><tr>Acetato <td></td><td></td><td>de uranilo acuoso</td><td>Disuelva el acetato de uranilo al 3 % en dH2O (mezclar bien).</td></tr></tbody></table>

proyección de imagen multimodal jerárquica de secciones seriadas para encontrar dianas celulares específicas dentro de grandes volúmenes

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Dirigidos a células específicas en resolución ultraestructural dentro de una población de mezclado de la célula o un tejido pueden lograrse mediante la proyección de imagen jerárquica utilizando una combinación de luz y microscopia electrónica. Muestras incrustadas en resina son seccionadas en matrices consisten en cintas de cientos de secciones ultrafinas y depositadas sobre trozos de oblea de silicio o cubreobjetos conductively cubierto. Arreglos de discos son imagen en baja resolución usando un consumidor digital como cámara del smartphone o microscopio de luz (LM) para una visión rápida área grande o un microscopio de fluorescencia de campo ancho (fluorescencia microscopía (FLM)) después de etiquetar con fluoróforos. Después de la tinción con metales pesados, arreglos de discos son imagen en un microscopio electrónico de barrido (SEM). Selección de objetivos es posible de reconstrucciones 3D generadas por FLM o de reconstrucciones 3D hacen de las pilas de imágenes de SEM en resolución intermedia si no hay marcadores fluorescentes están disponibles. Para el análisis ultraestructural, objetivos seleccionados finalmente se registran en el SEM en alta resolución (píxeles de imagen de algunos nanómetros). Se demuestra una herramienta de manejo de la cinta que puede ser adaptada a cualquier ultramicrótomo. Ayuda con matriz producción y eliminación del sustrato desde el barco de cuchilla de seccionamiento. Una plataforma de software que permite la proyección de imagen automatizada de matrices en el SEM se discute. En comparación con otros métodos de generación de datos de gran volumen EM, como la cara de bloque serie SEM (SBF-SEM) o viga de ion enfocada SEM (FIB-SEM), este enfoque tiene dos ventajas importantes: (1) la muestra embebido en resina se conserva, aunque en una versión en rodajas. Puede ser teñido de diferentes maneras y reflejada con diferentes resoluciones. (2) como las secciones pueden ser post-manchadas, no es necesario utilizar muestras fuertemente teñidas de bloque con metales pesados para introducir contraste para la proyección de imagen de SEM o bloques de representación de los tejidos conductores. Esto hace que el método aplicable a una amplia variedad de materiales y cuestiones biológicas. Materiales especialmente con prefijo por ejemplo, de los bancos de la biopsia y laboratorios de patología, puede directamente ser incrustado y reconstruido en 3D.

El flujo de trabajo descrito aquí (figura 1) se inicia con una muestra en un bloque de resina. Durante la preparación de la muestra, algunos metales pesados debe ser introducido en el tejido, pero no es necesario utilizar protocolos optimizados para Encapado de metal algo fuerte. Figura 1A muestra una raíz de la planta (Berro) bloque manchada convencionalmente con 1% OsO4 y 1% acetato de uranilo, mientras que la raíz de Arabidopsis en la figura 1B es solamente débil había metalizado usando 0,5% acetato de uranilo. El tipo de muestra esta última es ideal para acercamientos correlativos como algunos metales pesados tienden a apagar de la fluorescencia. Con un soporte dedicado de sustrato (figura 2), matrices de varias cien secciones pueden ser producido (figura 1). Después de etiquetado fluorescente, tales arreglos son reflejadas en un estándar amplio campo FLM (figura 1), luego teñidas con soluciones de metales pesados y reflejadas en un SEM en diferentes resoluciones (Figura 1E–G).
Herramientas importantes para la generación reproducible de arreglos de discos, particular cuando la coloque varias cintas de barco de cuchilla de micrótomo sobre un sustrato, son el soporte del sustrato (figura 2A, diseñado en laboratorio de los autores) y un diamante de Jumbo cuchillo con un barco lo suficientemente grande para acomodar portaobjetos (figura 2B). Un menisco plano, permitiendo la buena observación de las cintas, es necesario y puede lograrse mediante plasma limpieza del sustrato: una pequeña gota de agua destilada no forman una estructura en forma de lente en el sustrato como en la figura 2 (sustrato), pero una película fina (Figura 2D, sustrato de plasma activada). En estas condiciones, a la parte seca de un cubreobjetos recubierto ITO las cintas son fácilmente visualizada (Figura 2E) y puede ser observado y controlado durante la extracción del sustrato del agua.
Por ejemplo, arreglos de discos de teñidos con ioduro de propidio para etiquetar las paredes celulares de plantas fueron reflejadas con un estándar amplio campo FLM (Figura 3A). Puesto que las secciones son sólo 100 nm de espesor, incluso demasiado tinción como se muestra a continuación presenta poco desenfoque. Después del registro, se seleccionaron las dos células totalmente incluidas en el volumen reconstruido de la pila de la imagen (figura 3B) para la proyección de imagen de alta resolución en 3D (véase también Suplementario S1 de la película). Tras tinción adicional con uranilo acetato, citrato de plomo, los arreglos de discos se reflejada en la SEM. figura 3 C muestra un resumen, con píxeles de imagen de 60 nm; el cuadrado oscuro en el centro de la imagen indica la posición donde ejecutaron a las funciones de enfoque automático, y la dosis adicional condujo a contaminación ligera. Caso de ROIs en esas secciones seriales (rodajas de 51 a 248 de 435 rebanadas en total) que contiene las células de dos destino seleccionadas en la pila de la FLM se registraron entonces con un tamaño de pixel de imagen nm 5 (figura 3D; vea también Suplementario S2 de película).
Automatizado la proyección de imagen jerárquica de las matrices en el SEM se describe aquí se hizo con la solución de la plataforma de software y hardware ZEISS Atlas 5. En primer lugar, un resumen de toda la serie fue creado con el detector SE muy grande (1.000 nm) de la imagen píxeles y tiempo de permanencia muy baja (Figura 4A). Un ROI que sólo el tejido puesto en la primera sección, propaga al resto de las secciones de la matriz. Este conjunto de sección se registró entonces con 60 píxeles de imagen nm utilizando un mayor tiempo de permanencia (Figura 4B). Finalmente, se estableció un sistema de sitio, que contiene las células dos blanco más uno "capa" de alrededor de las células para tener en cuenta la imprecisión de la etapa, con los siguientes parámetros: tiempo de detector de ESB (dispersión de retorno selectivo de energía), imagen de nm 5 píxeles, muy largo (40 μs) Moran ( Figura 4). Zoom a una imagen tan muestra detalle subcelular (figura 4) como las vacuolas (V), mitocondrias (M), núcleo (N) y el retículo endoplasmático (flechas). Vea también el Suplemento S3 película de zoom de un resumen de la matriz de todo al detalle subcelular de una célula diana.
La matriz que se muestra a continuación (200 secciones) más un adicional de 250 secciones tomó alrededor de 8 h para producir, una noche a la mancha para que la LM y un día grabar (manualmente) en la FLM. Post coloración toma aproximadamente 1-2 h en total, dependiendo del número de matrices individuales. Para la grabación de SEM, un par de horas se requiere para configurar el funcionamiento de Atlas, y grabación automatizada fue 3-4 h para el conjunto de sección intermedia de la resolución (tamaño de píxel de 60 nm) (secciones de 200, 450 x 200 μm2) y cerca de 5 días para la alta resolución (5 nm tamaño de píxel) ROI que contiene las células de la dos blanco (200 secciones, 55 x 30 μm2). Tenga en cuenta que debido al bajo contenido en metal de la muestra que se muestra aquí, una muy lenta velocidad de exploración que se utiliza para alcanzar una buena detección de señal a ruido, que implicaba (para los detectores disponibles en la actualidad) un tiempo de permanencia de 40 μs para el ROI de alta resolución.
Hay varios pasos en el flujo de trabajo todo propenso a errores: idealmente deben ser cintas más o menos recto y se coloca en el orden correcto (figura 5A). Sin embargo, se producen a menudo doblado (figura 5B), curvadas (figura 5) o incluso rotos cintas. Esto puede resultar debido a recorte incorrecto (principal y posterior bordes no paralelos) o pegamento no uniformemente aplicada, sino también de una muestra asimétrica o desigual infiltrada. Especialmente molestas son las muestras que contienen componentes muy duros y suaves. Los componentes de este último pueden ser difíciles infiltrarse como la pared celular de las raíces de la planta que se muestra a continuación (figura 5). En ese caso, los pliegues (flecha) fácilmente pueden ser causados por la compresión variable y relajación durante el seccionamiento. Para automatizado de proyección de imagen en el SEM, cintas curvas no son un gran problema, ya que el ROI se puede girar para acomodar la curvatura de la cinta.
Otro paso fundamental en el protocolo es tinción: lavado insuficiente puede dar lugar a residuos en la sección (figura 5E, F) y en el peor de los casos, cubrir el área más interesante (círculo en una de las celdas de dos destino en figura 5F). También, polvo (figura 5, las partículas de la dispersión de la luz fuertemente) introducido en el barco de cuchillo, por ejemplo, con un portador de sustrato sucio, puede causar serios problemas: en la FLM, el polvo puede ser altamente fluorescente (cf. lonchas de película suplementario S1) a tal punto que algunos algoritmos de registro no funcionan. Sin embargo, la función de "alinear" en TrakEM17 puede manejar tantas pilas como se muestra en Suplementario S1 de la película.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> Figura 1: flujo de trabajo para la proyección de imagen jerárquica correlativo. A partir de una muestra incrustado en un bloque de resina (A, muestra fuertemente metalizada), la muestra es primera recortada (B, muestra débil metalizado) y luego las matrices consisten en varias cintas de secciones seriadas (C), colocado aquí en un Cubreobjetos recubierto ITO, se producen utilizando un ultramicrótomo. Después de la tinción con un colorante fluorescente, montones de imágenes se registran en un amplio campo FLM (D). Después sales de tinción más rondas con metales pesados, pilas se reflejada en un SEM (E–G) en diferentes resoluciones (tamaños de pixel de la imagen). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> Figura 2: herramientas para la preparación de matrices. Soporte de sustrato montado de micromanipuladores con siete ejes de movimiento conectado a un ultramicrótomo estándar (A): los tornillos, con círculos, son verticales (1) y (2) el movimiento horizontal y de inclinación (3) sustrato portador de la . El cuchillo del diamante enorme con un barco de gran tamaño para dar cabida a grandes sustratos (flecha), aquí con un pedazo de oblea de silicio activado por plasma montado en un portador de aluminio tamaño de diapositiva (B). Gotas de 20 μl de agua destilada colocaron sobre un substrato de la oblea de silicio sin tratar (C) o sobre un sustrato de plasma activada (D). Cuatro cintas flotando en el barco de cuchillo, unido a un cubreobjetos recubierto ITO por sus extremos inferiores. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> Figura 3: correlación de los datos de LM con SEM datos. Descripciones (A, C) y las células diana (B, D) grabado con FLM (A, B) y SEM (C, D). (B) es un zoom de software y los datos originales se registraron con un objetivo de X 40 sobre un chip de cámara 1.388 x 1.040 píxeles, mientras que (C) se registra con 60 tamaño de pixel de la imagen de nm y (D) con 5 nm píxeles tamaño de la imagen, que ilustra el verdadero aumento de resolución en el SEM. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> Figura 4: jerárquica de proyección de imagen en el SEM con ZEISS Atlas 5 a Resumen de una matriz grabada con 1.000 píxeles nm usando el detector SE (A). Sección fija con el ROI colocó sobre el tejido en cada sección y registró con píxeles de 60 nm (B). Sitio se establece con un ROI serial colocó en las células diana y registró con píxeles de imagen de 5 nm (C). Cuando utilice el zoom en estas imágenes de alta resolución (D), compartimientos de la membrana intracelular como vacuolas (V), núcleo (N), mitocondrias (M) y el retículo endoplasmático (flechas) se hacen visibles. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> Figura 5: problemas típicos. 1. derivados del proceso de seccionamiento: cintas a cubreobjetos recubierto ITO son idealmente recta (A), pero irregular compresión durante el seccionamiento pueden causar doblado (B) o cintas curvadas (D) o incluso los pliegues (C). 2. causado por manejo de substrato y cintas en el agua, por ejemplo, durante el seccionamiento y la coloración: luz de dispersión de partículas en el substrato (D), borde de gotitas en sección (círculo en E), o la suciedad manchada hacia fuera sobre tejido debido a la inadecuada lavado después de la tinción (F). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Suplementario S1 de la película: pila de imagen FLM. 435 imágenes alineación en Fiji16 usando TrakEM17 y guardado como archivo de película (.avi). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Suplementario S2 película: pila de imagen SEM. 210 imágenes alinean en Fiji16 usando TrakEM17. La pila original (300 imágenes) de este conjunto de datos fue 15 GB. Para reducir el tamaño de la pila de 3,3 GB (después de la alineación y el cultivo a sólo las dos células de destino), fue escalado en x y y por un factor de 0.2 con Fiji y luego guardado como .avi película. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Suplemento S3 de película: zoom con niveles de resolución diferentes en el SEM. Película creada en y exportada desde el software de Atlas 5 en formato. MP4. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo está dirigido a células específicas en el tejido para la proyección de imagen en resolución de nanoescala utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM). Gran número de secciones seriadas del material biológico embebido en resina es primero reflejada en un microscopio de luz para identificar el destino y luego de manera jerárquica en la SEM.

Proyección de imagen multimodal jerárquica de secciones seriadas para encontrar dianas celulares específicas dentro de grandes volúmenes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

El objetivo general de este flujo de trabajo es identificar ciertos objetivos para la obtención de imágenes ultraestructurales dentro de un tejido mediante microscopía óptica seguida de imágenes 3D en un SEM a muy alta resolución. El flujo de trabajo de imágenes presentado aquí puede ayudar a responder preguntas clave sobre la ultraestructura celular o tisular en una serie de campos, como la biología celular, la biología del desarrollo, la neurociencia o incluso la patología. La principal ventaja de la técnica, que en realidad se basa en la tomografía de matrices, es que el corte del tejido en matrices de secciones seriadas facilita la identificación de las estructuras objetivo, incluso cuando inicialmente están enterradas dentro del volumen de muestra original.La tomografía de matriz se introdujo originalmente en un contexto de neurociencia, pero también se puede aplicar a una amplia gama de otros sistemas, incluidas bacterias, plantas, animales e incluso muestras de pacientes en un entorno de patología. Las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque recolectar muchas secciones en serie es muy difícil. Trabajar sin soporte adicional puede causar la pérdida de secciones o el desorden de las cintas.Con un cepillo pequeño formado por unos pocos pelos fijados a un palillo de dientes, cubra cuidadosamente los lados delantero y trasero de un bloque previamente recortado con una mezcla adhesiva. Realice este paso rápidamente porque el solvente de esta mezcla se evapora en segundos. Mientras las muestras se secan, corte trozos de obleas de silicona hasta un tamaño que quepa en el bote de cuchillos y márquelos con un trazador de diamantes.A continuación, limpie la oblea de silicona manualmente con isopropanol y un pañuelo sin pelusa. Fije el sustrato a un extremo de la placa portadora con un adhesivo removible. Una vez fraguado, el plasma activa el sustrato mediante una descarga incandescente con aire para obtener una superficie hidrófila.Con el sustrato montado más cerca del borde de la cuchilla, inserte el soporte en la abrazadera del soporte del sustrato. A continuación, inserte un cuchillo de diamante gigante en el portacuchillos y ajuste el ángulo de separación a cero grados. Luego, llene el bote de cuchillos con agua destilada.Acérquese al cuchillo de modo que esté a uno o dos milímetros de la muestra. Luego, baje el sustrato al agua con los tornillos uno a tres del soporte del sustrato. Compruebe que la línea de agua esté situada en el tercio superior del sustrato.Debido a que es difícil ver la distancia al suelo cuando se usa una oblea de silicona, baje el sustrato hasta que sienta que toca el piso. Luego, levante el sustrato un poco. Asegúrese de que ni el sustrato ni el portador toquen el bote de cuchillas mientras cortan.A continuación, utilice una jeringa o pipeta para ajustar el nivel del agua en el barco. Mientras observa a través de los binoculares, agregue o retire agua hasta que el área completa de la superficie del agua muestre un reflejo homogéneo de la iluminación de luz superior del ultramicrótomo. Una vez completada la configuración, comience a seccionar la muestra.Cuando se hayan cortado varias secciones, detenga el proceso de corte y suelte la cinta del filo de la cuchilla acariciando suavemente el borde de la cuchilla con una pestaña o un pelo de gato muy suave. Manipule la cinta hacia el sustrato y empuje suavemente la primera sección de la cinta para unirla a la parte seca del sustrato. Continúe seccionando la muestra y fijando las cintas al sustrato.Comience en un lado del sustrato y muévase gradualmente hacia el otro con cada nueva cinta. Cuando el sustrato esté completamente cubierto con cintas, levante suavemente el sustrato del bote de cuchillas con los tornillos del micromanipulador del soporte del sustrato. Deje que la matriz de cintas se seque y, a continuación, guárdela en un entorno libre de polvo.Después del secado, retire el sustrato adhesivo lo antes posible del soporte. A continuación, tiña la muestra para microscopía óptica como se describe en el protocolo de texto adjunto y realiza la toma de imágenes. A continuación, tiñe la muestra para microscopía electrónica y móntala en trozos de aluminio con una almohadilla de carbono pegajosa.Ahora visualice estas matrices en el microscopio electrónico de barrido de emisión de campo. Para evitar la carga, utilice energías de electrones primarios de tres kV o menos y una corriente de haz entre 50 y 800 picoamperios. Cuando utilice cubreobjetos de vidrio recubiertos de ITO, conecte la superficie conductora al soporte del microscopio con cinta de cobre y pintura plateada.El primer paso en la cascada de imágenes jerárquicas es generar una visión general de la matriz de tal manera que se puedan reconocer las secciones individuales. Primero defina las cuatro esquinas de su matriz graficando una imagen de cada esquina con un aumento bajo, aproximadamente 100x, luego cree un ROI que encierre toda la matriz. Asigne un protocolo de imágenes a este ROI con los siguientes parámetros.Utilice el detector de electrones secundarios para obtener imágenes de alta velocidad con un tiempo de permanencia corto de alrededor de 0,2 microsegundos. Elija un tamaño de píxel de imagen grande y un tamaño de mosaico de 2000 por 2000 píxeles. El resultado es una imagen muy ruidosa, pero incluso aquí, el tejido dentro de la sección es visible.A continuación, genere un conjunto de secciones creando una región de interés, delineando solo el tejido de la primera sección. Clónelo en todas las secciones subsiguientes con la herramienta de tampón. Gire las regiones de interés cuando sea necesario para acomodar las cintas dobladas.Asigne un protocolo a la sección que mejor muestre la subestructura del tejido. Aquí, se utilizó un tamaño de píxel intermedio de 60 nanómetros, un tamaño de mosaico de 12000 por 12000 píxeles y un tiempo de permanencia de 3,2 microsegundos. Debido a la mala calidad, se creó un segundo conjunto de secciones que delineaba unas pocas celdas seleccionadas utilizando un tamaño de píxel más pequeño y un detector más sensible.Ahora es posible reconocer muy bien las dos células objetivo. Cree un conjunto de sitios dentro del conjunto de secciones que contiene la estructura de destino para imágenes SEM de mayor resolución. Haga que la región de interés sea lo suficientemente grande como para tener en cuenta la precisión preconfigurada.Verifique y ajuste las posiciones de los sitios. El ajuste automático es necesario cuando se crean imágenes de muchas secciones. Es importante colocar las regiones de interés para que el centro no se asiente sobre material vacío sin detalles estructurales, por ejemplo, vacuolas.A continuación, defina la configuración de enfoque automático y compruebe el rendimiento de la imagen a lo largo de una cinta en una pequeña región de interés que esté cerca del sitio del que se tomarán las imágenes. A continuación, defina un protocolo de imagen para la adquisición de SEM de alta resolución. Para ver los compartimentos de membrana, elija un tamaño de píxel de imagen entre tres y cinco nanómetros.Seleccione un tiempo de permanencia en función del detector para que la imagen no sea demasiado ruidosa. Dado que la fase tiene que recorrer una gran distancia entre la grabación de esta y esta sección, defina los valores de foco en al menos la primera sección de cada cinta de opciones mediante la opción de protocolo de comprobación. A continuación, inicie la adquisición automática de imágenes SEM en toda la serie de regiones objetivo de interés.Cuando termine, exporte los datos adquiridos como una serie de imágenes, preferiblemente en formato TIF. Importe series de imágenes a Fiji como una pila virtual. A continuación, recorte la pila para su posterior procesamiento recortando el área lo más cerca posible de la estructura de interés.Además, ajuste el brillo y el contraste y guarde la pila. Una vez recortado y optimizado, abra un nuevo TrakEM desde el menú Archivo. Haga clic con el botón derecho del ratón en el campo de la imagen e importe la pila en TrakEM como un sector por capa.Al hacer clic con el botón derecho, elija Alinear capas. Elija mínimos cuadrados como modo, establezca el rango del primero al último y elija ninguno como referencia. A continuación, seleccione los valores de configuración predeterminados y elija Rígido como la transformación deseada.Cuando el registro se haya completado y sea satisfactorio, guarde el conjunto de datos alineados haciendo clic con el botón derecho y eligiendo Exportar. Haga una imagen plana, establezca el rango desde la primera hasta la última imagen y deje que el software muestre la pila resultante. Cuando termine, guarde la pila en formato TIF.Después de la preparación, la matriz de secciones aparece como una matriz que consta de varias cintas de secciones en serie. Esta sección muestra una descripción general de la punta de la raíz de una arabidopsis, teñida con yoduro de propidio. Las secciones secuenciales de esta muestra se alinearon como se describe en el protocolo y se combinaron para mostrar la muestra en 3D como un solo archivo de película.Aquí, se pueden ver las dos células objetivo que luego se visualizarán con una resolución nanométrica en el SEM. Después de una tinción adicional con acetato de uranilo y citrato de sangre, las matrices se obtuvieron imágenes en el microscopio electrónico. Esta imagen estática muestra la sección de la muestra fotografiada por primera vez con una resolución de 20 nanómetros y en la segunda ronda de imágenes, con una resolución de cinco nanómetros.Aquí, 210 imágenes secuenciales del microscopio electrónico se alinearon y recortaron como se describe en el protocolo. El video se enfoca solo en dos celdas y muestra cómo las vacuolas dentro de las celdas están dispuestas y, a veces, conectadas en 3D. Las imágenes jerárquicas automatizadas de las matrices en el SEM que se muestran aquí pueden proporcionar un mapeo continuo a diferentes niveles de resolución, desde una descripción general de toda la matriz hasta detalles subcelulares.Con el mayor aumento, las vacuolas, las mitocondrias, el núcleo y el retículo endoplásmico son reconocibles. Una vez dominado, la colocación de cintas de sección una al lado de la otra en un sustrato típico se puede hacer en unas pocas horas si se realiza correctamente. Esto puede proporcionar cientos de secciones en un sustrato para la obtención de imágenes.El tiempo de obtención de imágenes para un número tan grande de secciones puede variar de un microscopio a otro, más aún si sus instrumentos de imagen favoritos tienen diferentes niveles de automatización. Es interesante notar que el flujo de trabajo general se puede combinar fácilmente con otras técnicas de imagen, como la tinción histográfica estándar o incluso la candoluminiscencia, o simplemente se puede usar como herramienta independiente para la obtención de imágenes artoestructurales de grandes volúmenes. Otro aspecto de este flujo de trabajo es la fácil accesibilidad.Los estudios iniciales son factibles sin herramientas adicionales ni automatización, es decir, sin grandes inversiones. Después de ver este vídeo, debería tener una buena idea sobre el flujo de trabajo y cómo se pueden utilizar las imágenes multimodales y jerárquicas para apuntar e obtener imágenes de estructuras interesantes en un gran volumen 3D a diferentes niveles de resolución.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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