Proyección de imagen multimodal jerárquica de secciones seriadas para encontrar dianas celulares específicas dentro de grandes volúmenes

El objetivo general de este flujo de trabajo es identificar ciertos objetivos para la obtención de imágenes ultraestructurales dentro de un tejido mediante microscopía óptica seguida de imágenes 3D en un SEM a muy alta resolución. El flujo de trabajo de imágenes presentado aquí puede ayudar a responder preguntas clave sobre la ultraestructura celular o tisular en una serie de campos, como la biología celular, la biología del desarrollo, la neurociencia o incluso la patología. La principal ventaja de la técnica, que en realidad se basa en la tomografía de matrices, es que el corte del tejido en matrices de secciones seriadas facilita la identificación de las estructuras objetivo, incluso cuando inicialmente están enterradas dentro del volumen de muestra original.

La tomografía de matriz se introdujo originalmente en un contexto de neurociencia, pero también se puede aplicar a una amplia gama de otros sistemas, incluidas bacterias, plantas, animales e incluso muestras de pacientes en un entorno de patología. Las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque recolectar muchas secciones en serie es muy difícil. Trabajar sin soporte adicional puede causar la pérdida de secciones o el desorden de las cintas.

Con un cepillo pequeño formado por unos pocos pelos fijados a un palillo de dientes, cubra cuidadosamente los lados delantero y trasero de un bloque previamente recortado con una mezcla adhesiva. Realice este paso rápidamente porque el solvente de esta mezcla se evapora en segundos. Mientras las muestras se secan, corte trozos de obleas de silicona hasta un tamaño que quepa en el bote de cuchillos y márquelos con un trazador de diamantes.

A continuación, limpie la oblea de silicona manualmente con isopropanol y un pañuelo sin pelusa. Fije el sustrato a un extremo de la placa portadora con un adhesivo removible. Una vez fraguado, el plasma activa el sustrato mediante una descarga incandescente con aire para obtener una superficie hidrófila.

Con el sustrato montado más cerca del borde de la cuchilla, inserte el soporte en la abrazadera del soporte del sustrato. A continuación, inserte un cuchillo de diamante gigante en el portacuchillos y ajuste el ángulo de separación a cero grados. Luego, llene el bote de cuchillos con agua destilada.

Acérquese al cuchillo de modo que esté a uno o dos milímetros de la muestra. Luego, baje el sustrato al agua con los tornillos uno a tres del soporte del sustrato. Compruebe que la línea de agua esté situada en el tercio superior del sustrato.

Debido a que es difícil ver la distancia al suelo cuando se usa una oblea de silicona, baje el sustrato hasta que sienta que toca el piso. Luego, levante el sustrato un poco. Asegúrese de que ni el sustrato ni el portador toquen el bote de cuchillas mientras cortan.

A continuación, utilice una jeringa o pipeta para ajustar el nivel del agua en el barco. Mientras observa a través de los binoculares, agregue o retire agua hasta que el área completa de la superficie del agua muestre un reflejo homogéneo de la iluminación de luz superior del ultramicrótomo. Una vez completada la configuración, comience a seccionar la muestra.

Cuando se hayan cortado varias secciones, detenga el proceso de corte y suelte la cinta del filo de la cuchilla acariciando suavemente el borde de la cuchilla con una pestaña o un pelo de gato muy suave. Manipule la cinta hacia el sustrato y empuje suavemente la primera sección de la cinta para unirla a la parte seca del sustrato. Continúe seccionando la muestra y fijando las cintas al sustrato.

Comience en un lado del sustrato y muévase gradualmente hacia el otro con cada nueva cinta. Cuando el sustrato esté completamente cubierto con cintas, levante suavemente el sustrato del bote de cuchillas con los tornillos del micromanipulador del soporte del sustrato. Deje que la matriz de cintas se seque y, a continuación, guárdela en un entorno libre de polvo.

Después del secado, retire el sustrato adhesivo lo antes posible del soporte. A continuación, tiña la muestra para microscopía óptica como se describe en el protocolo de texto adjunto y realiza la toma de imágenes. A continuación, tiñe la muestra para microscopía electrónica y móntala en trozos de aluminio con una almohadilla de carbono pegajosa.

Ahora visualice estas matrices en el microscopio electrónico de barrido de emisión de campo. Para evitar la carga, utilice energías de electrones primarios de tres kV o menos y una corriente de haz entre 50 y 800 picoamperios. Cuando utilice cubreobjetos de vidrio recubiertos de ITO, conecte la superficie conductora al soporte del microscopio con cinta de cobre y pintura plateada.

El primer paso en la cascada de imágenes jerárquicas es generar una visión general de la matriz de tal manera que se puedan reconocer las secciones individuales. Primero defina las cuatro esquinas de su matriz graficando una imagen de cada esquina con un aumento bajo, aproximadamente 100x, luego cree un ROI que encierre toda la matriz. Asigne un protocolo de imágenes a este ROI con los siguientes parámetros.

Utilice el detector de electrones secundarios para obtener imágenes de alta velocidad con un tiempo de permanencia corto de alrededor de 0,2 microsegundos. Elija un tamaño de píxel de imagen grande y un tamaño de mosaico de 2000 por 2000 píxeles. El resultado es una imagen muy ruidosa, pero incluso aquí, el tejido dentro de la sección es visible.

A continuación, genere un conjunto de secciones creando una región de interés, delineando solo el tejido de la primera sección. Clónelo en todas las secciones subsiguientes con la herramienta de tampón. Gire las regiones de interés cuando sea necesario para acomodar las cintas dobladas.

Asigne un protocolo a la sección que mejor muestre la subestructura del tejido. Aquí, se utilizó un tamaño de píxel intermedio de 60 nanómetros, un tamaño de mosaico de 12000 por 12000 píxeles y un tiempo de permanencia de 3,2 microsegundos. Debido a la mala calidad, se creó un segundo conjunto de secciones que delineaba unas pocas celdas seleccionadas utilizando un tamaño de píxel más pequeño y un detector más sensible.

Ahora es posible reconocer muy bien las dos células objetivo. Cree un conjunto de sitios dentro del conjunto de secciones que contiene la estructura de destino para imágenes SEM de mayor resolución. Haga que la región de interés sea lo suficientemente grande como para tener en cuenta la precisión preconfigurada.

Verifique y ajuste las posiciones de los sitios. El ajuste automático es necesario cuando se crean imágenes de muchas secciones. Es importante colocar las regiones de interés para que el centro no se asiente sobre material vacío sin detalles estructurales, por ejemplo, vacuolas.

A continuación, defina la configuración de enfoque automático y compruebe el rendimiento de la imagen a lo largo de una cinta en una pequeña región de interés que esté cerca del sitio del que se tomarán las imágenes. A continuación, defina un protocolo de imagen para la adquisición de SEM de alta resolución. Para ver los compartimentos de membrana, elija un tamaño de píxel de imagen entre tres y cinco nanómetros.

Seleccione un tiempo de permanencia en función del detector para que la imagen no sea demasiado ruidosa. Dado que la fase tiene que recorrer una gran distancia entre la grabación de esta y esta sección, defina los valores de foco en al menos la primera sección de cada cinta de opciones mediante la opción de protocolo de comprobación. A continuación, inicie la adquisición automática de imágenes SEM en toda la serie de regiones objetivo de interés.

Cuando termine, exporte los datos adquiridos como una serie de imágenes, preferiblemente en formato TIF. Importe series de imágenes a Fiji como una pila virtual. A continuación, recorte la pila para su posterior procesamiento recortando el área lo más cerca posible de la estructura de interés.

Además, ajuste el brillo y el contraste y guarde la pila. Una vez recortado y optimizado, abra un nuevo TrakEM desde el menú Archivo. Haga clic con el botón derecho del ratón en el campo de la imagen e importe la pila en TrakEM como un sector por capa.

Al hacer clic con el botón derecho, elija Alinear capas. Elija mínimos cuadrados como modo, establezca el rango del primero al último y elija ninguno como referencia. A continuación, seleccione los valores de configuración predeterminados y elija Rígido como la transformación deseada.

Cuando el registro se haya completado y sea satisfactorio, guarde el conjunto de datos alineados haciendo clic con el botón derecho y eligiendo Exportar. Haga una imagen plana, establezca el rango desde la primera hasta la última imagen y deje que el software muestre la pila resultante. Cuando termine, guarde la pila en formato TIF.

Después de la preparación, la matriz de secciones aparece como una matriz que consta de varias cintas de secciones en serie. Esta sección muestra una descripción general de la punta de la raíz de una arabidopsis, teñida con yoduro de propidio. Las secciones secuenciales de esta muestra se alinearon como se describe en el protocolo y se combinaron para mostrar la muestra en 3D como un solo archivo de película.

Aquí, se pueden ver las dos células objetivo que luego se visualizarán con una resolución nanométrica en el SEM. Después de una tinción adicional con acetato de uranilo y citrato de sangre, las matrices se obtuvieron imágenes en el microscopio electrónico. Esta imagen estática muestra la sección de la muestra fotografiada por primera vez con una resolución de 20 nanómetros y en la segunda ronda de imágenes, con una resolución de cinco nanómetros.

Aquí, 210 imágenes secuenciales del microscopio electrónico se alinearon y recortaron como se describe en el protocolo. El video se enfoca solo en dos celdas y muestra cómo las vacuolas dentro de las celdas están dispuestas y, a veces, conectadas en 3D. Las imágenes jerárquicas automatizadas de las matrices en el SEM que se muestran aquí pueden proporcionar un mapeo continuo a diferentes niveles de resolución, desde una descripción general de toda la matriz hasta detalles subcelulares.

Con el mayor aumento, las vacuolas, las mitocondrias, el núcleo y el retículo endoplásmico son reconocibles. Una vez dominado, la colocación de cintas de sección una al lado de la otra en un sustrato típico se puede hacer en unas pocas horas si se realiza correctamente. Esto puede proporcionar cientos de secciones en un sustrato para la obtención de imágenes.

El tiempo de obtención de imágenes para un número tan grande de secciones puede variar de un microscopio a otro, más aún si sus instrumentos de imagen favoritos tienen diferentes niveles de automatización. Es interesante notar que el flujo de trabajo general se puede combinar fácilmente con otras técnicas de imagen, como la tinción histográfica estándar o incluso la candoluminiscencia, o simplemente se puede usar como herramienta independiente para la obtención de imágenes artoestructurales de grandes volúmenes. Otro aspecto de este flujo de trabajo es la fácil accesibilidad.

Los estudios iniciales son factibles sin herramientas adicionales ni automatización, es decir, sin grandes inversiones. Después de ver este vídeo, debería tener una buena idea sobre el flujo de trabajo y cómo se pueden utilizar las imágenes multimodales y jerárquicas para apuntar e obtener imágenes de estructuras interesantes en un gran volumen 3D a diferentes niveles de resolución.