Name: Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprenda a realizar análisis RNASeq en embriones y larvas de Danio rerio para identificar perfiles de expresión génica y comparar cambios cuantitativos entre muestras experimentales.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El enfoque se describe en este protocolo ofrece una estrategia relativamente rápida y rentable para el análisis a nivel de transcriptoma de animales enteros o de poblaciones celulares específicas ordenadas. El pez cebra proporciona un modelo ventajoso para este tipo de estudio debido a la facilidad y rapidez en la generación de grandes cantidades de a partir de material, la facilidad de la aplicación de genética o ambientales condiciones experimentales y la disponibilidad de una gran espectro de líneas transgénicas repor...

Análisis comparativo de expresión génica global es una herramienta valiosa para identificar nuevos genes que contribuyen a los fenotipos observados. Tales análisis normalmente dependen de evaluación cuantitativa de la abundancia de transcripción comparada entre experimentales y control de muestras. Enfoques específicos, tales como qRT-PCR son relativamente rápido y preciso para la investigación de los cambios de expresión de gen único. La secuencia de RNA (RNASeq) ofrece un enfoque amplio, libre de hipótesis para identificar cambios significativos en la expresión génica entre las muestras, lo que es ahora el estándar para tales investigaciones a través de sistemas experimentales.
Pez cebra han surgido como un modelo prominente en muchas áreas de la enfermedad. Originalmente desarrollado para su utilidad en estudios de Biología del desarrollo, debido a su alta fecundidad y relativamente bajo costo de mantenimiento, uso experimental del pez cebra ha evolucionado para incluir una amplia gama de fenotipos de embrionario a etapas adultas así como un amplia gama de molecular ensayos de1,2,3. De hecho, estas ventajas hacen estudios mecanísticos moleculares rápido y rentable debido a la facilidad de adquirir grandes cantidades de material combinado con la facilidad de manipulación genética y ambiental en todas las etapas de la vida. Por otra parte, la naturaleza transparente de larvas y embriones de pez cebra lo hacen ideal para la generación de células y tejidos específicos reportero transgénicos líneas visualización en vivo de células discretas las poblaciones4. Explotación de dichas líneas permite análisis de expresión génica global en tipos específicos de la célula aislados basados en la expresión del gen reportero.
Aquí presentamos un protocolo integral para análisis de expresión génica global usando RNASeq después de cultivo de embriones de pez cebra. Manipulación genética experimental, incluyendo morfolino (MO)-caída de base gen transitoria o la edición del genoma mediada por CRISPR, se presentan en otras partes5,6,7. Por lo tanto, centrarse en un protocolo detallado para el aislamiento del ARN de embriones enteros o clasificado transgénicas células expresando reportero seguidas por simple análisis computacional de resultados RNASeq utilizando herramientas de la vía y términos de gene ontology (GO). Por último, hemos incluido una estrategia para la validación de los cambios de expresión génica por PCR (qRT-PCR) de la transcriptasa inversa cuantitativa. Estos protocolos son aplicables a los embriones de pez cebra sujetados a una amplia gama de condiciones experimentales, incluyendo comparación de mutantes genéticos o las condiciones ambientales.

<table><tbody><tr><td><reactivos comerciales > fuerte</reactivo de</td> lisis > <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriZol</td><td>Thermo Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>tampón de disociación</td><td>TrypLE</td><td>Gibc</td><td>12604013</td> o 1</tr><tr><td>tampón de disociación</td><td>FACSMax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td> 2</tr><tr><td>agua tratada con DEPC</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Conversión de ADNc FirstStrand</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1621</td><td>kit de conversión de ADNc</td></tr><tr><td>2X SYBR Green Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>tampón QRT-PCR Master Mix</td></tr><tr><td>FACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-105-9042</td><td></td></tr><tr><td>cloroformo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>acetato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td><fuerte> Nombre</td><td>Compañía</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>Cepas de pez cebra</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuebingen</td><td>ZIRC</td><td>ZL57</td><td></td></tr><tr><td>ins2a:mCherry</td><td>ZIRC</td><td>ZL1483</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 micras filtro de células</td><td>Sigma</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubo</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>hemocitómetro</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tanques de acoplamiento 1.0L Juego de tanques de cruce</td><td>Acuanear</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo FACS 5 mL tubo de polipropileno</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Consensus Path DB</td><td>Análisis</td> de enriquecimiento de http://cpdb.molgen.mpg.de/ <td></td><td></td></tr><tr><td>GO</td><td>http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en rnaseq gen de pez cebra

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

El análisis de los cambios de expresión génica global es una herramienta valiosa para la identificación de nuevas vías subyacen fenotipos observados. El pez cebra es un excelente modelo para la evaluación rápida de transcriptoma conjunto de poblaciones de todo animal o individuales de la célula debido a la facilidad de aislamiento de ARN de grandes cantidades de animales. Aquí se presenta un protocolo para el análisis de expresión génica global en embriones de pez cebra, mediante secuenciación del RNA (RNASeq). Se describe la preparación del ARN de embriones enteros o de poblaciones celulares obtenidas mediante célula clasificación en animales transgénicos. También se describe un enfoque para el análisis de datos RNASeq identificar vías enriquecidas y términos de Ontology del Gene (vaya) en conjuntos de datos de expresión génica global. Por último, proporcionamos un protocolo para la validación de los cambios de expresión génica utilizando transcriptasa inversa cuantitativa PCR (qRT-PCR). Estos protocolos pueden utilizarse para el análisis comparativo de control y grupos experimentales del pez cebra para identificar cambios de expresión de gene nuevo y proporcionan la penetración molecular en fenotipos de interés.

Clasificación de diferencialmente expresados Genes:
Para identificar genes diferencialmente expresados en la etapa larvaria del pez cebra modelos de síndrome de Alström y de síndrome de Bardet-Biedl (BBS), dirigido cualquiera alms1 o transcripciones bbs1 inyectando previamente validaron MOs En bloqueo de empalme embriones de pez cebra de tipo salvaje de16,17</su...

Este protocolo presenta un enfoque para el análisis del transcriptoma completo de embriones de pez cebra, larvas, o clasificar las células. Se incluyen aislamiento de RNA, análisis de la vía de datos RNASeq y qRT-PCR-based validación de los cambios de expresión génica.

Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

El objetivo general de este análisis de RNASeq en muestras de larvas de pez cebra es identificar los perfiles de expresión génica en embriones y larvas de pez cebra y realizar afirmaciones cuantitativas comparativas sobre los cambios en la expresión génica entre muestras. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en cualquier campo en el que los embriones o larvas de pez cebra sean informativos, como por ejemplo cómo la supresión de un gen específico provoca cambios en la expresión génica o la alteración de ciertas vías metabólicas en comparación con otras condiciones. La principal ventaja de esta técnica es que el pez cebra es adecuado para la producción de un gran número de individuos, y los datos del transcriptoma completo del organismo se pueden obtener fácilmente.Además, el aislamiento de tipos celulares específicos puede lograrse fácilmente mediante la clasificación de animales transgénicos. Las personas que demostrarán los procedimientos serán Lain Hostelley, una estudiante de posgrado, y Jessica Nesmith, una investigadora postdoctoral de mi laboratorio. Para comenzar, cultive embriones hasta los tres meses de edad, que es la madurez reproductiva.Separar dos peces

sample-preparation-analysis-rnaseq-based-gene-expression-data-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El aislamiento de alta calidad, intacta ARN es un paso esencial en los protocolos de laboratorio de muchos. Este sentido, demuestran la extracción de RNA a partir de embriones de pez cebra conjunto y la síntesis de ADNc para su posterior aplicación en diversos procedimientos experimentales, incluyendo el análisis de microarrays de expresión génica.

Aislamiento del ARN de síntesis embrionarias pez cebra y el cDNA de análisis de expresión génica

Microarrays de genes son herramientas poderosas en el perfil de expresión génica a nivel de todo el genoma. Esta tecnología tiene aplicación en una variedad de disciplinas biológicas como la biología del desarrollo y la toxicología. En este video, se detalla un protocolo para el análisis global de la expresión génica utilizando microarrays de oligonucleótidos de una plataforma completa para el pez cebra.

Gene mundial y Análisis de Expresión utilizando una plataforma de microarrays de oligonucleótidos de pez cebra

El artículo describe un protocolo para generar embriones de pez cebra a través del apareamiento natural y la clasificación de sus etapas de desarrollo. El protocolo se utiliza además para el análisis de células β pancreáticas mediante el uso de peces transgénicos.

Apareamiento y estadificación de los huevos: un método para generar embriones y clasificarlos por etapa de desarrollo

Para analizar los perfiles de expresión de genes cardiacos durante el desarrollo del corazón del pez cebra, el ARN total tiene que ser extraído de corazones aislados. A continuación, presentamos un protocolo de recogida funcionales corazones / batiendo por disección manual de rápida a partir de embriones de pez cebra para obtener ARNm específico del corazón.

A gran escala de pez cebra embrionario del corazón Disección de Análisis transcripcional

Este protocolo describe un método para aislar células individuales de embriones de pez cebra, enriquecer para obtener células de interés, capturar células de pez cebra en sistemas multiplex de células individuales basados en microfluidos y evaluar la expresión génica de células individuales.

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

Pez cebra han utilizado recientemente como un sistema de modelo en vivo para el estudio de tiempo de replicación del ADN durante el desarrollo. Aquí está detallada de los protocolos para el uso de embriones de pez cebra para sincronización de replicación de perfil. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para el estudio de la sincronización de replicación en mutantes, tipos de células individuales, modelos de la enfermedad y otras especies.

Perfiles de sincronización de replicación de ADN utilizando el pez cebra como un sistema de modelo en Vivo

Presentamos un protocolo para aislar a las neuronas, macrófagos y microglia del cerebro de pez cebra larvas bajo condiciones fisiológicas y patológicas. Al aislamiento, el RNA se extrae de estas células a analizar su perfil de expresión génica. Este protocolo permite la colección de ARN de alta calidad para realizar análisis posteriores como qPCR y transcriptómica.

Aislamiento y extracción de ARN de las neuronas, macrófagos y Microglia de cerebros de larvas de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo de tuberculosis humana modelo en un pez cebra adulto utilizando su patógeno natural marinum de la micobacteria. Extraen ADN y ARN de los órganos internos del pez cebra infectado pueden utilizarse para revelar que el total de micobacterias cargas en los peces y la respuesta inmune del hospedador con qPCR.

Modelado de la Tuberculosis de Mycobacterium marinum infección pez cebra adulto

La regeneración del músculo esquelético es impulsada por las células madre musculares residentes en el tejido, que se ven afectadas en muchas enfermedades musculares, como la distrofia muscular, y esto resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. Aquí, describimos un protocolo que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.

Examinando la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular

El pez cebra dirigido a electrófilos y oxidantes reactivos (Z-REX) es un método basado en la biología química para la investigación de la señalización reactiva de moléculas pequeñas. Esta técnica se puede aplicar a peces vivos de diferentes etapas de desarrollo. Aquí, combinamos ensayos estándar en pez cebra con Z-REX para el análisis de la vía de señalización.

Monitoreo de respuestas de señalización en el objetivo en larvas de pez cebra - Z-REX desenmascara mecanismos precisos de fármacos electrofílicos y metabolitos

Aquí, presentamos un protocolo para marcar proteínas con una etiqueta de proteína de fluorescencia en larvas de pez cebra, un sistema in vivo recientemente desarrollado y modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baja abundancia en pez cebra.

Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

Aprenda a realizar análisis RNASeq en embriones y larvas de Danio rerio para identificar perfiles de expresión génica y comparar cambios cuantitativos entre muestras experimentales.

Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra

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