Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra

El objetivo general de este análisis de RNASeq en muestras de larvas de pez cebra es identificar perfiles de expresión génica para embriones y larvas de pez cebra y hacer declaraciones comparativas cuantitativas sobre los cambios en la expresión génica entre muestras. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en cualquier campo para el que los embriones o larvas de pez cebra son informativos, como cómo la supresión de un gen objetivo da lugar a cambios en la expresión génica o una interrupción de ciertas vías en relación con otras afecciones. La principal ventaja de esta técnica es que el pez cebra es susceptible a la producción de un gran número de animales, y los datos del transcriptoma del animal completo se pueden obtener fácilmente.

Además, el aislamiento de tipos específicos de células se puede lograr con facilidad mediante la clasificación de animales transgénicos. Lain Hostelley, estudiante de posgrado, y Jessica Nesmith, investigadora postdoctoral de mi laboratorio, demostrarán los procedimientos. Para empezar, se cultivan embriones hasta los tres meses de edad, que es la madurez reproductiva.

Separe dos peces machos adultos y tres hembras de la cepa deseada en tanques de apareamiento divididos de agua dulce del sistema la noche anterior a la recolección de embriones. A la mañana siguiente, después de que se enciendan las luces, retire el divisor y permita que los peces se apareen naturalmente hasta que se observen embriones en el fondo del tanque. Recoja los embriones en intervalos de 30 minutos en placas de Petri separadas de medio embrionario hasta que se recoja el número deseado.

Para estadificar los embriones, cultive en grupos de 50 a 75 por placa de Petri de 10 centímetros para promover el tiempo de desarrollo constante de todos los embriones. Luego, mantenga las placas a 28,5 grados centígrados. Mida la edad del embrión utilizando el número de somitas después de la segmentación hasta aproximadamente 24 horas después de la fertilización, o HPF, y separe los embriones en función de la edad de desarrollo.

Después de sacrificar embriones en la etapa deseada de acuerdo con el protocolo de texto, transfiera un grupo de 20 embriones a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros marcado. A continuación, retire el exceso de medio embrionario del tubo de microcentrífuga. Agregue 200 microlitros de reactivo de lisis al tubo.

Y utilizar un mortero para homogeneizar mecánicamente los embriones. A continuación, añada 800 microlitros adicionales de reactivo de lisis para llevar el volumen total a un mililitro. Para extraer el ARN, agregue reactivo de lisis a la muestra recolectada e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos.

Agregue 0,2 mililitros de cloroformo por cada 1 mililitro de reactivo de lisis utilizado e invierta los tubos a mano durante 15 segundos. Después de incubar las muestras a temperatura ambiente durante dos o tres minutos, centrifugue las muestras a 12.000 veces G y 4 grados Celsius durante 15 minutos. Transfiera la fase acuosa separada a un tubo nuevo y agregue 0,5 mililitros de isopropanol por cada 1 mililitro de reactivo de lisis utilizado.

Después de incubar los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos, centrifugue las muestras durante 10 minutos. A continuación, agregue etanol al 75% al ARN y centrifugue los tubos a 7.500 veces G y 4 grados Celsius durante 5 minutos. Retire completamente el sobrenadante y deje que la muestra se seque al aire a temperatura ambiente.

Luego, vuelva a suspender el ARN en 15 a 30 microlitros de agua tratada con DEPC. Para purificar el ARN de alta calidad después de extraer el gránulo y lavar la muestra de acuerdo con el protocolo de texto, utilice un espectrofotómetro de absorción para analizar la concentración y la pureza del ARN extraído. Asegúrese de que el valor de 260 sobre 230 sea aproximadamente 2,0 antes de enviar las muestras de ARN a un proveedor o cuerpo para el análisis de cambios en la expresión génica y RNASeq basados en la cuantificación de las lecturas de secuenciación.

Para comparar una sola condición experimental con un control, abra los datos de los genes expresados diferencialmente en un software de gestión de hoja de cálculo. Seleccione la flecha desplegable junto al botón de ordenación y seleccione la ordenación personalizada dentro de la hoja de cálculo. En la ventana que aparece, seleccione la casilla debajo de la columna y elija ordenar por la columna LFC.

En la columna ordenar por, asegúrese de que los valores estén seleccionados. En la columna de orden, seleccione ordenar de mayor a menor y haga clic en Aceptar. Para determinar los genes expresados diferencialmente que se encuentran en dos condiciones experimentales, en la hoja de cálculo experimental frente a la de control, seleccione la primera celda de una columna vacía.

A continuación, escribe la siguiente ecuación en la celda. Presione enter o return para ejecutar la ecuación. Seleccione la celda que contiene la ecuación y haga clic en el cuadro en la esquina inferior derecha de la celda.

Mantenga pulsado el ratón y arrastre el área seleccionada hasta el fondo de la columna hasta seleccionar el último ID de entidad para copiar la ecuación en cada celda de la columna. Seleccione de nuevo la ordenación personalizada y añada un segundo nivel de ordenación haciendo clic en el icono más de la esquina inferior izquierda. En el primer nivel, ordenar por, en columna, seleccione duplicar.

En ordenar por, seleccionar valores y, en orden, seleccionar Z para A.In el segundo nivel y, a continuación, por, en columna, seleccione LFC. En Ordenar en, seleccione valores y, en Orden, seleccione de mayor a menor y seleccione Aceptar. Para eliminar los paréntesis de la columna de símbolos genéticos antes de continuar, seleccione toda la columna que contiene símbolos genéticos.

Seleccione editar y, a continuación, reemplazar en el menú desplegable de archivos. Escriba paréntesis abierto, estrella, paréntesis cerrado, en la barra de búsqueda de la ventana de reemplazo, y alquile el reemplazo con barra vacía. Seleccione Reemplazar todo para quitar todas las instancias de paréntesis.

Para determinar las vías enriquecidas, copie los símbolos genéticos deseados en el portapapeles. Vaya a ConsensusPathDB y, a continuación, seleccione análisis de conjuntos de genes en la barra lateral izquierda de la página web, seguido de análisis de sobrerrepresentación. En el cuadro Pegar una lista de identificadores de genes y proteínas, pegue la lista de genes.

Seleccione el símbolo del gen en el cuadro de tipo de identificador de gen/proteína y haga clic en continuar. En la sección Conjuntos basados en rutas, seleccione la casilla situada junto a Rutas según lo definido por las bases de datos de rutas. Seleccione buscar conjuntos enriquecidos para obtener la lista de vías que contienen genes en la lista de entrada.

Seleccione todas las rutas enriquecidas para visualizarlas en una red de rutas seleccionando cada casilla junto a los nombres de las rutas o, en seleccionar en el encabezado de columna sobre los cuadros de selección, haga clic en todo. A continuación, seleccione visualizar conjuntos seleccionados. Para ajustar los filtros de superposición relativa y candidatos compartidos, seleccione cualquiera de las casillas de la parte superior central de la página e introduzca el porcentaje deseado, la superposición relativa o el número de candidatos compartidos y, a continuación, seleccione aplicar.

Para determinar las ontologías de genes enriquecidos, copie los símbolos de genes del grupo respectivo en el portapapeles. Vaya a la herramienta de análisis GO Enrichment en el Gene Ontology Consortium. En el lado izquierdo de la página, debajo de sus identificaciones de genes, pegue la lista de símbolos de genes en el cuadro.

Debajo del cuadro ID de genes, seleccione el término go, proceso biológico. A continuación, selecciona danio rerio debajo del cuadro de términos de avance y haz clic en enviar. Realizar QRT PCR y comparar con RNASeq, según el protocolo de texto.

La secuenciación del ARN extraído de las larvas inyectadas con Morpholinos contra alms1 o bbs1 reveló los genes que estaban regulados hacia arriba y hacia abajo de manera única en los modelos Alstrom y BBS, así como los genes que se cambiaron significativamente en ambos modelos. Para dilucidar con mayor claridad el perfil molecular del modelo de Alstrom, se identificaron las vías y ontologías génicas enriquecidas en los genes expresados diferencialmente. Como se muestra aquí, se regularon al alza 31 vías en total.

Aparte del amplio grupo de metabolismo, las vías más afectadas fueron el sistema inmunitario innato y adaptativo, con 32 y 20 genes respectivamente. Los eventos de señalización del receptor de células B posteriores también se enriquecieron. Varias vías de señalización también se enriquecieron entre los genes regulados al alza, lo que es consistente con la asociación del síndrome de Alstrom con la disfunción primaria del cilio.

Además, se regularon al alza tres vías asociadas con la secreción de insulina, los ácidos grasos unidos a GPR40, los ácidos grasos libres y la acetilcolina. Finalmente, se enriquecieron seis términos GO entre los genes regulados al alza en el modelo de Alstrom, incluida la diferenciación de eritrocitos, la homeostasis de los eritrocitos, la homeostasis de las células mieloides y los procesos homeostáticos. Una vez dominado, el análisis de la ruta y los términos GO se puede realizar en menos de una hora.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la selección de los parámetros de la vía y los valores de corte son las consideraciones más importantes para interpretar los resultados de las comparaciones de expresión de RNASeq. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la aplicación con líneas mutantes y el análisis del transcriptoma de tipos de células individuales para responder a preguntas adicionales, como el perfil del transcriptoma de los tipos de células y los cambios en la expresión génica bajo el control de genes específicos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar los datos transcriptómicos del pez cebra generados por RNASeq para la identificación de cambios significativos en la expresión génica entre muestras experimentales.