Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

El objetivo general de este procedimiento es detectar las transcripciones de ARN en el interior de las células y los tejidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología celular y del desarrollo, como dónde dentro de una célula, un tejido o un embrión se encuentra un ARN. La principal ventaja de esta técnica es que detecta distribuciones espaciales de ARN con altos niveles de resolución y sensibilidad y a un bajo coste en comparación con otros métodos.

Inicialmente desarrollamos este protocolo para estudiar las distribuciones subcelulares de tantos ARN de Drosophila como fuera posible. Esto fue con el fin de determinar la extensión y diversidad de las distribuciones subcelulares. Comenzamos el proyecto trabajando con embriones, pero luego adaptamos y optimizamos el protocolo para poder trabajar en un alto rendimiento con tejidos disecados de larvas y moscas.

El aspecto más difícil del procedimiento es el número de pasos y el consiguiente potencial de error, así como la necesidad de garantizar la ausencia de ARN durante la producción de la sonda. Para facilitar el rendimiento y la rentabilidad, los procedimientos que se muestran en este video utilizan placas de microtitulación de 96 pocillos para todos los pasos. También es fácil adaptar este método a miembros de muestra más pequeños cortando las placas en tiras de ocho o 12 pocillos.

Comience diluyendo 10 microlitros de un cultivo bacteriano durante la noche en 90 microlitros de agua destilada doble esterilizada en autoclave en cada pocillo de una nueva placa de PCR de 96 pocillos. Desnaturaliza el ADN a 95 grados centígrados en un termociclador durante cinco minutos. Coloque inmediatamente el plato sobre hielo durante al menos cinco minutos.

Configure las reacciones de PCR en una nueva placa de PCR de 96 pocillos. Utilice los cebadores universales apropiados y alícuotas de 48 microlitros de la mezcla maestra de PCR en cada pocillo. Agregue dos microlitros de cada plantilla de ADN plasmídico desnaturalizado por pocillo.

Realice la amplificación en una máquina de PCR de 96 pocillos. Cuando se complete la amplificación, precipite el producto de PCR con la mezcla de acetato de sodio y etanol. Almacene las muestras durante 30 minutos a menos 80 grados centígrados.

Centrifugar la placa de 96 pocillos a 2.250 veces g a cuatro grados Celsius durante 45 a 60 minutos. Usando una pipeta de colector de vacío de ocho canales que tiene una estructura que evita que las puntas vayan al fondo de los pozos al aspirar los pellets, retire con cuidado el sobrenadante. Lavar una vez con 160 microlitros de etanol frío al 70%.

Centrifugar a 2.250 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Invierta suavemente la placa de 96 pocillos sobre una toalla de papel para eliminar las últimas gotas de líquido en cada pocillo y seque al aire los gránulos de ADN a temperatura ambiente durante una hora. Resuspender el ADN precipitado en 25 microlitros de agua libre de RNasa.

Comprobar el tamaño y el rendimiento de los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Configure las reacciones de transcripción in vitro agregando los componentes apropiados a cada pocillo en una nueva placa de PCR de 96 pocillos. Agregue 7.5 microlitros de molde de ADN a cada pocillo correspondiente.

Cubra la placa con cinta de sellado. Incube la placa a 37 grados centígrados durante 3-1/2 a cuatro horas. A continuación, agregue a cada pozo una mezcla maestra compuesta por agua bidestilada tratada con DEPC, 100% etanol y acetato de sodio tres molares.

Almacene a menos 80 grados centígrados durante 30 minutos. Centrifugar la placa y lavar los pocillos como se muestra anteriormente. Vuelva a suspender la sonda precipitada en 25 microlitros de agua bidestilada tratada con DEPC.

Las sondas de ARN antisentido recién sintetizadas se ejecutaron en un gel de agarosa al 1% para verificar la integridad y el rendimiento. Según la intensidad de la banda, el rendimiento se puede caracterizar como rendimiento bajo, rendimiento típico o rendimiento alto. Después de usar cinco microlitros de cada sonda para la electroforesis en gel de agarosa, mezcle los 20 microlitros restantes con 100 microlitros de solución de hibridación y almacene a menos 80 grados Celsius hasta que lo necesite.

Para comenzar este procedimiento, coloque de 20 a 30 larvas en una placa de Petri que contenga PBS frío en una solución fija uno y enfríe en hielo durante dos minutos para reducir la motilidad de las larvas. Diseccionar las larvas bajo el alcance de disección. Use un par de pinzas afiladas para abrir cuidadosamente la parte anterior y apretar los tejidos de la parte posterior a la anterior.

Después de un máximo de 15 minutos, transfiera los tejidos disecados a un tubo de 1,5 mililitros para su fijación y colóquelos en hielo. Retire el PBS y agregue 800 microlitros de solución fija uno. Incubar en una batidora de sobremesa durante 30 minutos junto con otras previamente recogidas en pañuelos de fijación.

Enjuague los pañuelos una vez con 800 microlitros de PBTT y mantenga el tubo en hielo mientras se recolectan y fijan los pañuelos adicionales. Agrupe todos los tejidos diseccionados en un solo tubo de plástico de 15 mililitros que contenga malla en la tapa del tubo. Aspire el exceso de líquido a través de la malla de la tapa.

Lavar con 10 mililitros de PBTT y enjuagar con 10 mililitros de PBS. Para apagar la actividad endógena de la peroxidasa del rábano picante, agregue cinco mililitros de peróxido de hidrógeno al 0,3% en PBS e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Lavar dos veces con 10 mililitros de PBTT.

Permeabilizar los tejidos añadiendo 10 mililitros de acetona preenfriada al 80% e incubando a menos 20 grados centígrados durante 10 minutos. Lavar dos veces con 10 mililitros de PBTT para rehidratar los tejidos. Después de lavar los pañuelos como se describe en el protocolo de texto, almacene en solución de hibridación a menos 20 grados centígrados.

Si no se usa al día siguiente, el conjunto del filtro debe reemplazarse con una tapa normal. Alícuota de unos 20 microlitros por pocillo de tejidos en una placa de PCR de 96 pocillos sobre hielo. Con una pipeta múltiple de ocho canales, retire la solución de hibridación de los tejidos.

Agregue 100 microlitros de solución de hibridación recién desnaturalizada a cada pocillo y cúbralo con cinta selladora. Prehibridar los tejidos a 56 grados centígrados utilizando una unidad de calentamiento de baño seco que contenga perlas de metal durante un mínimo de 2-1/2 a tres horas. Desnaturalizar 100 microlitros de la sonda preparada en una placa de PCR de 96 pocillos a 80 grados centígrados durante cinco minutos.

Deje enfriar inmediatamente sobre hielo durante cinco minutos. Retire la solución de prehibridación de los tejidos y agregue sondas específicas de genes desnaturalizados a cada muestra. Cubra con cinta de sellado de aluminio e hibrida a 56 grados centígrados debajo de perlas de metal en una unidad de calentamiento de baño seco durante 16 a 18 horas durante la noche.

Antes de comenzar el procedimiento de detección de la sonda, precaliente todas las soluciones necesarias en la unidad de calentamiento a 56 grados Celsius. Transfiera cuidadosamente los tejidos hibridados a una placa de 96 pocillos que se adapte a un colector de vacío de placa múltiple. Los pocillos de estas placas tienen fondos de membrana que permiten la eliminación del contenido al vacío.

Retire las sondas de la placa de 96 pocillos y lave las muestras con mezclas de solución de hibridación y PBTT según los pasos indicados en esta tabla en la unidad de calentamiento a 56 grados centígrados. Después del tercer lavado con PBTT, retire la placa de 96 pocillos de la unidad de calentamiento, retire la solución de PBTT y bloquee los pañuelos con PBTTB en una batidora de mesa a temperatura ambiente durante 20 minutos. Agregue 100 microlitros de solución de anticuerpos por pocillo e incube durante dos horas en el mezclador de muestras de sobremesa.

Después de enjuagar con PBTTB como se describe en el protocolo de texto, agregue 100 microlitros de solución de peroxidasa de rábano picante estreptavidina por pocillo e incube a temperatura ambiente durante 1-1/2 horas. Lave dos veces con PBTTB durante cinco minutos por lavado. Después de esto, incube los tejidos con la solución de DAPI como se describe en el protocolo de texto.

Comience este procedimiento incubando las muestras con solución de tiramida e incube las muestras durante dos horas en el mezclador de sobremesa en la oscuridad. Retire la solución de tiramida de los tejidos una vez finalizada la incubación. Después de lavar con PBT y PBS como se describe en el protocolo de texto, agregue 150 microlitros de medio de montaje antidecoloración por pocillo.

Mantenga las muestras a cuatro grados centígrados durante la noche para permitir que los tejidos se hundan hasta el fondo del pocillo o tubo. Al día siguiente, monte las muestras en un portaobjetos de microscopio y séllelas con un cubreobjetos. Por último, tome imágenes de las muestras con un microscopio de fluorescencia.

Se muestran ejemplos de resultados obtenidos utilizando este procedimiento para embriones tempranos de Drosophila y embriones tardíos de Drosophila con señales en amnioserosa, músculos y el sistema nervioso central. En cada panel se muestra el nombre del gen con el que se hibridó la sonda. A continuación se muestran ejemplos de tejidos larvarios del tercer estadio, túbulos de Malpighi, intestino medio, glándula salival y músculo.

Por último, se muestran imágenes representativas de ovario adulto y testículos adultos. Una vez dominada y si se realiza de manera eficiente, esta técnica se puede realizar en tan solo dos días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar en un banco libre de RNasa con puntas, tubos, placas y soluciones libres de RNasa y usar guantes.

Si vas a trabajar con un gran número de muestras o sondas, no te apresures en el procedimiento. Y también es una buena idea idear trucos para que no olvides dónde estás. Cuando sigues este procedimiento, también puedes combinarlo con otros métodos, como la detección de múltiples sondas, sondas con proteínas o marcadores celulares.

Con ellos se puede responder a preguntas adicionales como los patrones de expresión relativa, las identidades de las células y los compartimentos subcelulares, y los efectos en diferentes antecedentes genéticos o enfermedades. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la mayoría de los tipos de hibridación in situ en cualquier tipo de tejido o embrión. No olvide que trabajar con reactivos como el formaldehído, el peróxido de hidrógeno y la formamida puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como la manipulación y eliminación adecuadas al realizar el procedimiento.