Name: Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Aprende hibridación in situ fluorescente de alta resolución en embriones y tejidos de Drosophila mediante amplificación de señal de tiramida. Este protocolo permite detectar ARN con alta sensibilidad y bajo coste.

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Fondos para este proyecto fue proveído por una beca a HMK por los institutos canadienses de salud investigación (concesión 133473 fregona).

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li>
<li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li>
<li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li>
<li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li>
<li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilk%2C+R+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22">Current Protocols Essential Laboratory Techniques</a>. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).</li>
<li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Localization%3A+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li>
<li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li>
<li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li>
</ol>

Autores tienen intereses financieros que compiten.

El protocolo descrito proporciona un método altamente reproducible, sensible y económico para la detección de ARN más en fijos Drosophila embriones o tejidos. Aunque un poco más complicado que el más tradicionalmente utilizan método de fosfatasa alcalina de la detección de la sonda, la resolución obtenida por los peces es mucho mayor y la sensibilidad es comparable o mejor 7,8. Utilizando placas de microtitulación total o parcial, pueden utilizarse los protocolos de análisis a gran escala o limitados de genes de interés. Cabe señalar que las puntas de prueba generados pueden detectar todos o empalme de transcripción múltiples formas a menos que las puntas de prueba están diseñados más específicamente (es decir, solo exones). Aunque hemos probado tan pequeñas como 200 nucleótidos con razonable éxito de sondas, sondas más pequeñas suelen ser menos efectivas y pueden ser menos específicas. Claramente, este Protocolo no es apropiado para la detección de pequeños intrones, exones, o procesado microRNAs.
Aunque este enfoque utiliza un paso enzimático para aumentar la fuerza de las señales, intensidad de la señal parece ser proporcional a la expresión del gen Diana en una relativamente lineal y amplia gama de niveles de expresión. A mayor aumento, la señal se ve como orificio o puntos dentro de las células y tejidos. Para transcripciones relativamente raras se ven solo unos orificio pequeño. Medida que aumenta la abundancia de transcripción, estos crecen en número y tamaño. Como sola molécula peces (smFISH), único orificio pequeño puede corresponder también a RNAs sola y debe también ser fácilmente cuantificado utilizando el software de la proyección de imagen y la informática. Comparaciones de imágenes publicadas obtenidas mediante smFISH con imágenes que nos hemos curado para los objetivos de la misma sugieren que la general, la sensibilidad y la resolución de los dos métodos son relativamente similares, aunque esto debe ser probado por comparaciones más rigurosas. Teniendo en cuenta el gasto mucho más alto de smFISH, el método que aquí debe dar resultados similares a una fracción del costo. Sin embargo, si el objetivo es detectar pequeñas transcripciones o partes distintas de las transcripciones, se recomienda smFISH.
Debido al menor tamaño de algunas sondas FISH, este método también puede ser mejor para penetrar los tejidos que son grandes o que tengan barreras significativas. Sin embargo, el uso de mayores niveles de detergente y ajustes fijación y permeabilización del tejido parece que han solucionado este problema. Por último, aunque desarrollado para los tejidos de la Drosophila , los buffers detergentes alta aquí descritos para los tejidos disecados también deberían funcionar para los tejidos, así como la mayoría otros organismos y embriones de Drosophila .

Nuevos métodos de detección del RNA del genoma como RNA-seq han expandido enormemente nuestro conocimiento de Cuándo y dónde se expresan los genes y en qué niveles1. Sin embargo, estos ofrecen relativamente pobre resolución temporal y espacial. RNA el hibridación in situ permite la distribución espacial de las transcripciones para ser observada visualmente en los tejidos fijos, revelando así los detalles de la localización celular y subcelular2. Mediante hibridación in situ fluorescente (FISH) permite más resolución espacial que permite el uso de técnicas de microscopía de gran alcance, tales como microscopia de confocal y luz la hoja3. Marcadores fluorescentes como DAPI pueden utilizarse también para establecer relaciones subcelulares4. PECES también facilita la observación de varios RNAs y proteínas al mismo tiempo con claras indicaciones de superposición en el nivel subcelular. Únicos reactivos y pasos necesarios para el etiquetado doble pueden encontrarse en las siguientes referencias3,5.
Los procedimientos descritos aquí utilizan las placas de microtitulación de 96 pozos para todos los pasos, incluyendo la producción de la plantilla de cDNA (colony PCR), producción de sonda de RNA (con transcripción de escorrentía dependiente de la polimerasa T7, T3 o SP6), hibridación in situ , y desarrollo de la señal fluorescente. Un número suficiente de embriones o tejidos se agregó a cada pozo de la placa de 96 pocillos para permitir la evaluación de consistencia y variabilidad. Pues bien, cada uno recibe una sonda diferente. Después del desarrollo de la señal, embriones o tejidos de cada pozo se vistió en portaobjetos individuales para el análisis microscópico.
El uso de amplificación de la señal de tyramide (TSA) para la detección de la sonda produce señales robustas con excepcional resolución subcelular 5,6,7,8. La localización subcelular de RNAs es un importante mecanismo regulador 9 que parece ocurrir con casi todos RNAs 4,10,11. Estos análisis también han mostrado que muchos expedientes que no son detectados por RNA-seq son fácilmente detectados por peces 8. La adaptación de RNA en situ hibridación para placas de 96 pocillos permite el análisis de genes hasta 96 de interés en un momento (se utilizan más si más placas), posibilitando el análisis de grandes conjuntos de datos. Cortando las placas en secciones más pequeñas, el método se adapta fácilmente a pocas muestras. El protocolo siempre es apropiado para el análisis de distribuciones de RNA en la mayoría de los tipos de tejidos. Aunque no se muestra, es adaptable a no - tejidos deDrosophila así.

<table><tbody><tr><td>15 ml Tubos de centrífuga cónicos de polipropileno</td><td>Frogga Bio</td><td>TB15-500</td><td>Certificado Libre de DNasa y RNasa</td></tr><tr><td>2x PCR Master Mix con colorante (Ambiogene)</td><td>Biomart (Canadá)</td><td>141106-1K</td><td>Certificado Libre de DNasa y RNasa</td></tr><tr><td>50 ml Tubos de centrífuga cónicos de polipropileno</td><td>Frogga Bio</td><td>TB50-500</td> Placa de filtración de 96 <td>pocillos sin DNasa y RNasa</td></tr><tr><td>(1,2 mmm, PVDF hidrófilo membrana</td><td>EMD MILLIPORE</td><td>MSBVS1210</td><td>Se utiliza para eliminar liguid del fondo de la placa con tejidos flotantes Placa de</td></tr><tr><td>PCR de 96 pocillos (200 &mu; l)</td>Filtro de jeringa <td>Denville</td><td>C18096-10</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc (0,2 u)</td><td>PALL</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa Acrodisc (0,45 u)</td><td>PALL</td><td>PN4614</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>Placas de almacenamiento de ensayo AXYGEN de 96 pocillos</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P96-450V-C</td><td>Para almacenar existencias de glicerol bacteriano</td></tr><tr><td>AXYGEN Aluminio Sellos de placas</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-PCR-AS-200</td><td>Para sellar placas</td></tr><tr><td>AXYGEN Puntas de diámetro ancho (200 ul)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-T205-WB-C</td><td>Para transferir muestras</td></tr><tr><td>Biotina-SP (espaciador largo) Fracción IgG Monoclonal de ratón Anti-Digoxina</td><td>Jackson ImmunoResearch Lab</td><td>200062156</td><td>Anticuerpo primario para in situ (conc. de stock 1 mg/ml, conc. de trabajo 2,5 &mu; g/ml o dilución 1/400.</td></tr><tr><td>MARCA Colector de 8 canales (esterilizable en autoclave)</td><td>BrandTech Scientific Inc.</td><td>704526</td><td>Para eliminar líquidos de la parte superior de las placas de PCR de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C1919</td><td>Concentración de existencias 34 mg/ml disueltos y 0,2&mu; m filtrado en 100 % EtOH (usar como 1/1000)</td></tr><tr><td>Cianina 3 Tiramida (Cy3-TSA)</td><td>Hecho en</td><td></td> casa <td>Se puede pedir a Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D2522</td><td>Reactivo antidecoloración en medios de montaje</td></tr><tr><td>Digoxigenina-11-uridina-5'-trifosfato</td><td>Roche</td><td>11-209-256-910</td><td></td></tr><tr><td>Jaula de recogida de embriones</td><td>Inicio hecho</td><td>N/A</td><td>Tamaño: 75 cm X 75 cm X 75 cm hecho con polimetacrilato de metilo</td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5804</td><td>Eppendorf</td><td>Modelo 5804</td><td>Centrífuga para placas de 96 pocillos en rotor A-Z-DWP</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Bioshop</td><td>FOR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY002.4</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.500</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>Stock: 50 mg/ml. Concentración de trabajo 1 mg/ml en solución de hibridación</td></tr><tr><td>Lab Armor Beads</td><td>DiaMed</td><td>LAA42370-001 Llenado en</td><td>unidad de calefacción</td></tr><tr><td>Labnet Gyro M Mini mezclador nutante</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-998-347</td><td>Mezcla de muestras</td></tr><tr><td>Malla - 100 micones</td><td>FlyStuff</td><td>57-103</td><td>Para la recolección de embriones</td></tr><tr><td>Malla - 800 micras</td><td>SEFAR - Nytex</td><td>06-780/53</td><td>Para atrapar tejido suelto / se puede utilizar para un tubo especial en la figura 4.</td></tr><tr><td>Micro cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>Tamaño: 22 X 22 mm</td></tr><tr><td>Micro portaobjetos,frstd</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Tamaño: 25 X 75 mm</td></tr><tr><td>Colector de vacío de placa multipocillo</td><td>Pall Corporation</td><td>N/P 5017</td><td>Retire el líquido del fondo de la placa de filtro de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Bioshop</td><td>PAR070.500</td><td>Máquina</td></tr><tr>de<td>PCR</td> de fijación <td>Bio-Rad</td><td>Modelo: DNA Engine PTC-200</td><td>Placa de 96 pocillos PCR y desnaturalización de sonda</td></tr><tr><td>Solución de ácido pícrico</td><td>Sigma-aldrich</td><td>80456</td><td>Para fijación de tejidos I solución</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCL)</td><td>Bioshop</td><td>POC308</td><td></td></tr><tr><td>Tapa de PP para placas de 96 pocillos, 100/caja</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P-LID-PP</td><td>Tapa para almacenar placas</td></tr><tr><td>Progene desechables Depósitos de reactivos (50 ml, estériles)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>825-1-50-5S Manipulación de</td><td>líquidos</td></tr><tr><td>Progene Perforable Papel de aluminio</td><td>UltiDent</td><td>Scientific 87-CFILM-AL</td><td>Seal Placa de 96 pocillos, libre de DNasa y RNasa</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2308- 5MG</td><td>Perpermeabilización embrionaria</td></tr><tr><td>RiboLock Inhibidor de la ribonucleasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 Unit/ul</td></tr><tr><td>Juego de trifosfato de ribonucleósido (NTP)</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td>sonda de ARN siera siera</td></tr> agua <tr><td>libre de ARN</td><td>GIBCO</td><td>10977015-500ml</td><td>sonda de ARN sierba</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>Eliminar la contaminación por ARNasa</td></tr><tr><td>ADN monocatenario de testículos de salmón</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9156</td><td>Para solución de hibridación</td></tr><tr><td>Leche desnatada (potencia descremada)</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td>La concentración de trabajo es del 1 % en 1 X PBT o PBTT como reactivo bloqueante</td></tr><tr><td>Acetato de sodio (NaOAc) 3 M, pH = 5,2 (libre de RNasa)</td><td>Bioshop</td><td>SAA333</td> La <td>concentración de trabajo es del 10 % (v/v) para la precipitación de ADN o ARN</td></tr><tr><td>SP6 ARN polimerasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td>20 Unit/ul</td></tr><tr><td>Granalla de acero inoxidable para baño de arena</td><td>VWR</td><td>13259-274.</td><td>Para llenar la unidad de calefacción</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico y fuente de luz de cuello de cisne</td><td>Modelo Leica</td><td>: MZ6</td><td>Disección de tejidos y montaje</td></tr><tr><td>de estreptavidina, peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado</td><td>Sondas moleculares</td><td>S911</td><td>Stock de anticuerpos secundarios: 1 mg/ml, uso de dilución 1/1000 (1 &mu; g/ml) para in situ.</td></tr><tr><td>T3 ARN polimerasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td>20 Unidad/ul</td></tr><tr><td>T7 ARN polimerasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td>20 Unidad/ul</td></tr><tr><td>Estación de punta (10 ul)</td><td>Axygen</td><td>T-300-STK-S</td><td>Certificado DNasa y sin RNasa</td></tr><tr><td>Estación de punta (200 ul)</td><td>Sorbio</td><td>27770T</td><td>Certificado Puntas libres de DNasa y RNasa</td></tr><tr><td>( 1ml)</td><td>Sorbio</td><td>10200</td><td>Certificado Libre de DNasa y RNasa</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td> La <td>concentración de trabajo es del 0,3% en 1 X PBT para tejido in situ</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td> La <td>concentración de trabajo es del 0,1% en 1 X PBT para el embrión in situ</td></tr><tr><td>Papel de filtro cualitativo Whatman, Grado 3</td><td>Sigma-aldrich</td><td>WHA1003917</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td>Preparación</fuerte></td></tr><tr><td>DABCO (1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano) glicerol anti-decoloración medios de montaje</td><td></td><td></td><td>DABCO (1,25 g), glicerol (35 ml o v/v 70 %) y 1 X PBS (15 ml, o v/v 30 %). Manténgalo oscuro y mecerlo en una habitación fría. tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>1 X PBT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS con 1 ml Tween 20 (0,1 %)</td></tr><tr><td>1 X PBTT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS con 1 ml Tween 20 (0,1 %) y 3 ml de Triton-X-100 (0,3 %)</td></tr><tr><td>1 X PBTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 % Leche desnatada en 1 X</td></tr><tr><td>PBT 1 X PBTTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 % Leche desnatada en 1 X PBTT</td></tr></tbody></table>

alta resolución fluorescente in situ hibridación en embriones de drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de tyramide

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

En nuestros esfuerzos para determinar los patrones de expresión y localización subcelular de Drosophila RNAs en todo el genoma y en una variedad de tejidos, hemos desarrollado numerosas modificaciones y mejoras a nuestro fluorescente original in situ protocolo de hibridación (FISH). Para facilitar el rendimiento y la rentabilidad, se realizan todos los pasos, desde la generación de la sonda de detección de señal, utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos de exón. Digoxygenin (Cave)-sondas con antisense RNA son producidas utilizando clones de cDNA o DNA genomic como plantillas. Después de la fijación del tejido y permeabilización, sondas son hibridadas de las transcripciones de interés y luego detectado usando una sucesión de anticuerpos anti-DIG conjugado con biotina, estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) y conjugado fluorescente tyramide, que en presencia de HRP, produce un intermediario altamente reactivo que se une a regiones densas del electrón de proteínas inmediatamente adyacentes. Estos pasos de localización y de amplificación producen una señal robusta y altamente localizada que facilita tanto localización celular y subcelular de la transcripción. Los protocolos proporcionados han sido optimizados para producir señales muy específicas en una variedad de tejidos y etapas de desarrollo. Para variaciones adicionales que permiten la detección simultánea de múltiples transcripciones, o transcripciones y proteínas, al mismo tiempo, dispones de referencias.

La figura 6 muestra ejemplos de los resultados obtenidos usando este procedimiento. Los paneles superiores 3 muestran ejemplos de embriones de Drosophila tempranos (figura 6, paneles A-C), el próximo 3 paneles muestran ejemplos de embriones de Drosophila con señales en diferentes tejidos (amnioserosa, músculos y sistema nervioso central, respectivamente (figura 6, paneles D-F). A continuación son ejemplos de estadio 3 tejidos larvales (figura 6, los paneles de G-J). Paneles de K y L muestran imágenes representativas de adultos gónadas (ovario y testículo, respectivamente). Cientos de imágenes se han subido y anotado en nuestra página 'fluorescente en situ mosca de la fruta base de datos' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
Figura 1. Esquema de fluorescente en situ del hibridación (pescado) protocolo clave equipo y. (A) amplificación PCR de cDNA. (B) In vitro transcripción para generar específicos de gen antisentido DIG - etiquetado de sondas de RNA en una placa de 96 pocillos (foto de la placa que se muestra en b). (C) y (D): adultos (hembra: relación hombre 2:1. 300-400 moscas/botella) moscas se les permite aparearse durante 3-4 días. Embriones de una colección durante la noche alimentos de harina estándar a 25 ° C se transfieren a una caja de plástico bien ventilada (1 L de alimentos de harina de maíz en un recipiente de tamaño: 8 "X 8" X 3" LWH) o a nuevas botellas, mantener una adecuada densidad larvaria. Para la colección de tejidos, polvo de levadura activa debe ser asperjado sobre los alimentos a las 24, 48 h después de la postura (AEL). (E a H): Fluorescente en situ hibridación experimentos realizados durante 3 días consecutivos. Para embriones o tejidos que no flotan, utilice una placa de PCR de 96 pocillos como se muestra en la fotografía b con aspirador de 8 canales (foto c). Para los tejidos que flotan, como la mayoría de los tejidos larval, utilice una placa de filtro de fondo (foto d) y eliminar el líquido desde la parte inferior con un aspirador colector de baja presión (foto e). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
Figura 2. Determinación del rendimiento de la sonda de RNA. Recién sintetizado sondas antisense RNA observadas en gel de agarosa 1% (5 μl/carril). El rendimiento se puede categorizar (basado en la intensidad de la banda) como 'rendimiento bajo' en rutas 3 y 10, rendimiento de típico en los carriles 1, 4, 5, 6 y 8, 'alto rendimiento' en pistas 2, 7, 9, 11 y 12. Para muestras con 'típicos rendimientos', utilice 10-15 μl de la sonda diluir en 100 μl de solución de hibridación para cada experimento en situ . Diluir las muestras con 'alto rendimiento' de la sonda con solución de hibridación adicional según la intensidad de la banda en relación con la intensidad de un 'típico ' de la sonda. Objetivo tienen concentraciones de aproximadamente igual probe final en cada pozo. La flecha señala a una de las sondas de RNA la banda superior de cada carril es la plantilla original de ADN. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
Figura 3. Principales pasos para una colección de embriones en gran escala y de. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
Figura 4. Tubo casero para eliminar el líquido de los tejidos larvales o flotantes. Algunos tejidos larvales y adultos flotan en solución durante la fijación. Esta sencilla herramienta consiste en una malla de nylon por una 200 μL cortar la punta, seguido por una punta de 1 mL como un adaptador para conectar a un aspirador. Líquido se puede quitar sin perder cualquier tejido. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
Figura 5. Amplificación de la señal de Tyramide. (1) sonda de RNA antisentido DIG marcado se hibridiza con sentido endógeno RNA. (2) inmuno afinidad de unión entre anticuerpo primario conjugado con biotina y DIG-UTP. (3) HRP había conjugado estreptavidina biotina de ATA. (4) HRP cataliza la reacción de Cianina 3-tyramide y peróxido de hidrógeno para formar a radicales de breve duración Cianina 3-tyramide. (5) radicales de Cianina 3-tyramide se unen a residuos de tirosina en proteínas cercanas. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
Figura 6. Representante en situ imágenes hibridación. Cada panel muestra un ejemplo de un RNA diferentes (mostrado en cian) y núcleos teñidos con DAPI (mostrado en rojo). (A-C) Ejemplos de los primeros embriones de Drosophila . (D, F) Ejemplos de finales embriones de Drosophila . (G-J) Ejemplos de 3er instar tejidos de larvas de Drosophila (túbulos malphigian del midgut, glándulas salivales y el músculo respectivamente). (K) ovario adulto. (L) testículo adulto. Cada panel muestra el nombre del gen que la sonda se cruza por hibridación a. Barras de la escala = 10 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El RNA se describe en situ hibridación protocolo permite la detección de RNA en todo Drosophila embriones o tejidos disecados. Utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos y amplificación de la señal tyramide, transcripciones pueden ser detectadas en el rendimiento, sensibilidad y alta resolución y a un costo relativamente bajo.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar transcritos de ARN in situ dentro de células y tejidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología celular y del desarrollo, como por ejemplo dónde dentro de una célula, un tejido o un embrión se encuentra un ARN determinado. La principal ventaja de esta técnica es que detecta las distribuciones espaciales de ARN con altos niveles de resolución y sensibilidad, y a un bajo costo en comparación con otros métodos.Desarrollamos inicialmente este protocolo para estudiar las distribuciones subcelulares de tantos ARN de Drosophila como fuera posible. Esto se hizo con el fin de determinar el grado y la diversidad de las distribuciones subcelulares. Comenzamos el proyecto trabajando con embriones, pero posteriormente adaptamos y optimizamos el protocolo para poder trabajar de forma de alto rendimiento con tejidos disecados de larvas y moscas.El aspecto más difícil del procedimiento es la cantidad de pasos y el consiguiente potencial de error, así como la necesidad de garantizar la ausencia de ARN durante la producción de la sonda. Para facilitar el rendimiento y la eficacia en costos, los procedimientos mostrados en este video utilizan placas microtituladoras de 96 pocillos en todos los pasos. También es fácil adaptar este método a un número menor de muestras cortando las placas en tiras de ocho o doce pocillos.Comience diluyendo 10 microlitros de un cultivo bacteriano de crecimiento nocturno en 90 microlitros de agua doblemente destilada y autoclavada en cada pocillo de una nueva placa de PCR de 96 pocillos. Desnaturalice el ADN a 95 grados Celsius en un termociclador durante cinco minutos. Coloque inmediatamente la placa sobre hielo durante al menos cinco minutos.Preparar las reacciones de PCR en una nueva placa de PCR de 96 pocillos. Usar los cebadores universales apropiados y distribuir 48 microlitros de la mezcla maestra de PCR en cada pocillo. Añadir dos microlitros de cada molde de ADN plasmídico desnaturalizado por pocillo.Realice la amplificación en una máquina de PCR de 96 pocillos. Cuando la amplificación esté completa, precipite el producto de PCR con una mezcla de acetato de sodio y etanol. Almacene las muestras durante 30 minutos a menos 80 grados Celsius.Centrifugar la placa de 96 pocillos a 2.250 × g a cuatro grados Celsius durante 45 a 60 minutos. Utilizando una pipeta de ocho canales con sistema de vacío que tiene una estructura que evita que las puntas lleguen al fondo de los pocillos al aspirar los pellets, retirar cuidadosamente el sobrenadante. Lavar una vez con 160 microlitros de etanol frío al 70 %.Centrifugar a 2.250 ×g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Invertir suavemente la placa de 96 pocillos sobre una toalla de papel para eliminar las últimas gotas de líquido en cada pocillo y secar al aire los pellet de ADN a temperatura ambiente durante una hora. Suspender el ADN precipitado en 25 microlitros de agua libre de RNasa.Compruebe el tamaño y el rendimiento de los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Prepare las reacciones de transcripción in vitro añadiendo los componentes apropiados a cada pocillo en una nueva placa de PCR de 96 pocillos. Añada 7,5 microlitros de la plantilla de ADN a cada pocillo correspondiente.Cubra la placa con cinta selladora. Incube la placa a 37 grados Celsius durante tres horas y media a cuatro horas. A continuación, agregue a cada pocillo una mezcla maestra compuesta por agua doblemente destilada tratada con DEPC, etanol al 100 % y acetato de sodio tres molar.Almacene a menos 80 grados Celsius durante 30 minutos. Centrifugue la placa y lave los pocillos como se mostró anteriormente. Reuspenda la sonda precipitada en 25 microlitros de agua doblemente destilada tratada con DEPC.Las sondas de ARN antisentido recién sintetizadas se separaron en un gel de agarosa al 1% para verificar su integridad y rendimiento. Según la intensidad de la banda, el rendimiento puede clasificarse como bajo, típico o alto. Después de utilizar cinco microlitros de cada sonda para la electroforesis en gel de agarosa, mezcle los 20 microlitros restantes con 100 microlitros de solución de hibridación y almacénelos a menos 80 grados Celsius hasta su uso.Para comenzar este procedimiento, coloque de 20 a 30 larvas en una placa de Petri que contenga solución fijadora en PBS frío y enfríe en hielo durante dos minutos para reducir la motilidad larval. Diseque las larvas bajo el microscopio estereoscópico. Utilice un par de pinzas finas para abrir cuidadosamente la región anterior y exprimir los tejidos de posterior a anterior.Después de un máximo de 15 minutos, transfiera los tejidos disecados a un tubo de 1,5 mililitros para la fijación y colóquelo sobre hielo. Retire el PBS y agregue 800 microlitros de solución fijadora. Incube en un agitador de banco durante 30 minutos junto con otros tejidos previamente recolectados que estén en proceso de fijación.Lave los tejidos una vez con 800 microlitros de PBTT y mantenga el tubo en hielo mientras se recogen y fijan tejidos adicionales. Reúna todos los tejidos diseccionados en un único tubo plástico de 15 mililitros que contenga una malla en la tapa. Aspire el exceso de líquido a través de la malla en la tapa.Lave con 10 mililitros de PBTT y enjuague con 10 mililitros de PBS. Para inhibir la actividad de peroxidasa endógena de rábano picante, añada cinco mililitros de peróxido de hidrógeno al 0,3 % en PBS e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Lave dos veces con 10 mililitros de PBTT.Permeabilice los tejidos añadiendo 10 mililitros de acetona al 80% previamente enfriada e incube a menos 20 grados Celsius durante 10 minutos. Lave dos veces con 10 mililitros de PBTT para rehidratar los tejidos. Después de lavar los tejidos según se describe en el protocolo del texto, almacénelos en solución de hibridación a menos 20 grados Celsius.Si no se utiliza al día siguiente, el ensamblaje del filtro debe reemplazarse con una tapa normal. Aliquotar aproximadamente 20 microlitros por pocillo de tejidos en una placa PCR de 96 pocillos sobre hielo. Utilizando una pipeta multicanal de ocho canales, retirar la solución de hibridización de los tejidos.Añada 100 microlitros de solución de hibridación recién desnaturalizada a cada pocillo y cúbralo con cinta sellante. Prehibridar los tejidos a 56 grados Celsius utilizando una unidad de calentamiento en baño seco que contenga perlas metálicas durante un mínimo de 2-1/2 a tres horas. Desnaturalice 100 microlitros de la sonda preparada en una placa PCR de 96 pocillos a 80 grados Celsius durante cinco minutos.Enfriar inmediatamente en hielo durante cinco minutos. Retire la solución de pre-hibridación de los tejidos y agregue las sondas específicas para el gen, desnaturalizadas, a cada muestra. Cubra con cinta selladora de aluminio e hibride a 56 grados Celsius bajo perlas metálicas en una unidad de calentamiento seco durante 16 a 18 horas durante la noche.Antes de comenzar el procedimiento de detección de la sonda, caliente previamente todas las soluciones necesarias en la unidad de calentamiento a 56 grados Celsius. Transfiera cuidadosamente los tejidos hibridados a una placa de 96 pocillos que se ajuste a un sistema de vacío para placas de múltiples pocillos. Los pocillos de estas placas tienen fondos de membrana que permiten la eliminación del contenido mediante vacío.Retire las sondas de la placa de 96 pocillos y lave las muestras con mezclas de solución de hibridación y PBTT según los pasos indicados en esta tabla en la unidad de calentamiento a 56 grados Celsius. Después del tercer lavado con PBTT, retire la placa de 96 pocillos de la unidad de calentamiento, elimine la solución de PBTT y bloquee los tejidos con PBTTB en un mezclador de banco a temperatura ambiente durante 20 minutos. Añada 100 microlitros de solución de anticuerpo por pocillo e incube durante dos horas en el mezclador de muestras de banco.Después de lavar con PBTTB según se describe en el protocolo escrito, añada 100 microlitros de solución de estreptavidina peroxidasa de rábano picante por pocillo e incube a temperatura ambiente durante 1 hora y media. Lave dos veces con PBTTB durante cinco minutos por lavado. A continuación, incube los tejidos con la solución de DAPI según se describe en el protocolo escrito.Comience este procedimiento incubando las muestras con la solución de tiramida e incube las muestras durante dos horas en el mezclador de banco a oscuras. Retire la solución de tiramida de los tejidos una vez finalizada la incubación. Después de lavar con PBT y PBS según se describe en el protocolo escrito, agregue 150 microlitros de medio de montaje antifade por pocillo.Mantenga las muestras a cuatro grados Celsius durante la noche para permitir que los tejidos se depositen en el fondo de la placa o tubo. Al día siguiente, monte las muestras en un portaobjetos microscópico y séllelas con una cubreobjetos. Por último, obtenga imágenes de las muestras utilizando un microscopio de fluorescencia.Se muestran ejemplos de resultados obtenidos mediante este procedimiento en embriones tempranos de Drosophila y embriones tardíos de Drosophila con señales en la amnioserosa, los músculos y el sistema nervioso central. El nombre del gen al que se hibridó la sonda se muestra en cada panel. A continuación, se presentan ejemplos de tejidos de larvas de tercer estadio, túbulos de Malpighi, intestino medio, glándula salival y músculo.Por último, se muestran imágenes representativas de ovario adulto y testículos adultos. Una vez dominada y si se realiza de forma eficiente, esta técnica puede completarse en tan solo dos días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar en una mesa libre de RNasas, con puntas, tubos, placas y soluciones libres de RNasas, y utilizar guantes.Si está trabajando con un gran número de muestras o sondas, no se apresure durante el procedimiento. También es recomendable idear trucos para no olvidar en qué punto se encuentra. Cuando siga este procedimiento, puede combinarlo con otros métodos, como la detección de múltiples sondas, sondas con proteínas o marcadores celulares.Con estos, puede responder preguntas adicionales, como los patrones de expresión relativos, las identidades de células y compartimentos subcelulares, y los efectos en diferentes contextos genéticos o enfermedades. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo realizar la mayoría de los tipos de hibridación *in situ* en cualquier tipo de tejido o embrión. No olvide que trabajar con reactivos como el formaldehído, el peróxido de hidrógeno y la formamida puede ser extremadamente peligroso, y siempre deben tomarse precauciones como el manejo y la disposición adecuados durante la realización del procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Todo el montaje hibridación in situ es una de las técnicas más utilizadas en la biología del desarrollo. Aquí se presenta una alta resolución de doble fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para analizar el patrón de expresión precisa de un solo gen y para determinar la superposición de los dominios de expresión de dos genes. Se incluye un yoduro de propidio nuclear tinción de contraste para destacar la organización del tejido.

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Mesoscópica fluorescencia tomografía opera más allá de los límites de penetración de los tejidos de seccionamiento microscopía de fluorescencia. La técnica se basa en la iluminación multi-proyección y una descripción del transporte de fotones. Se demuestra en vivo de todo el cuerpo visualización en 3D de la morfogénesis de las buenas prácticas agrarias-que expresa ala discos imaginales...

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Aquí se describe un fluorescente de todo el...

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Se describe un montaje de todo el hibridación in situ procedimiento multi-objetivo cromogénico (MC-DESEO) en embriones de Drosophila intactos permitiendo la detección simultánea y específica de tres patrones de distribución de ARNm diferentes contrastando precipitados de color.

Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación para comparar dominios de expresión génica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

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Aquí, se presenta un protocolo para la implementación de microscopía de expansión en embriones tempranos de Drosophila para lograr imágenes de superresolución utilizando un microscopio confocal convencional de barrido láser.

Uso de microscopía de expansión para agrandar físicamente embriones de Drosophila de montaje completo para obtener imágenes de superresolución

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Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide (Video) | JoVE Journal

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

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