G2-seq: Una alto rendimiento basado en la secuencia técnica para identificar replicación tardía de regiones del genoma

El objetivo general de este procedimiento para la secuenciación profunda de ADN de células que se han clasificado en flujo de acuerdo con la fase del ciclo celular es identificar regiones del genoma que se replican extremadamente tarde en el ciclo celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la replicación del ADN, como qué regiones del genoma tienen problemas para completar la replicación del ADN y, por lo tanto, son particularmente vulnerables a los reordenamientos del genoma. La principal ventaja de esta técnica es que, a pesar de ser muy sencilla desde el punto de vista experimental, proporciona una visión sorprendentemente rica de la dinámica de la replicación genómica.

Para empezar, inocule tubos de ensayo de 15 mililitros que contengan ocho mililitros de YEPD con células de levadura de interés. Es aceptable un medio sintético o rico. Cultive las células durante la noche durante al menos 12 horas para recolectarlas durante su distribución real en fase logarítmica.

Al día siguiente, cuando los cultivos estén a una densidad de cinco a 15 millones de células por mililitro, centrifugar las células y volver a suspenderlas en 1,5 mililitros de etanol al 70%. A continuación, transfiera la suspensión a un tubo de microfuga de 1,6 mililitros y deje que las células se incuben a temperatura ambiente durante una hora o durante al menos tres horas en hielo. Después de la inoculación, centrifugar las células y volver a suspenderlas en un mililitro de citrato de sodio.

Por último, sonique brevemente las células dos veces. A continuación, repita el ciclo de centrifugación y vuelva a suspender la levadura en un mililitro de citrato de sodio que contenga RNasa. Deje que la RNasa reaccione con la levadura a 50 grados centígrados durante una hora o durante la noche a 37 grados centígrados en un bloque de calor o en un baño de agua.

Después del tratamiento con RNasa, agregue 50 microlitros de solución de proteinasa K a la mezcla y continúe la reacción durante una hora a 50 grados centígrados. A continuación, centrifuga las células y vuelve a suspenderlas en un mililitro de citrato de sodio. A continuación, centrifugar las células y aspirar el sobrenadante con un vacío.

Luego, con luz tenue, vuelva a suspender las células en un mililitro de citrato de sodio con tinción de ácido nucleico verde. Ahora incube en la levadura en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente. Para continuar, cuente las celdas usando un clasificador de celdas con datos de emisión de 530 nanómetros.

Clasifíquelos según su contenido de ADN en sus fases del ciclo celular, G1 S, G2 temprano y G2 tardío. Recolecta al menos 1,6 millones de células haploides de cada fase. Inmediatamente después de clasificar las celdas, gírelas hacia abajo durante 20 minutos. Aspire el sobrenadante y congele el pellet a 20 grados centígrados bajo cero para su almacenamiento.

Hemos descubierto que el paso más crítico para este procedimiento es simplemente girar las células hacia abajo inmediatamente después de recolectarlas, una hora como máximo después de la clasificación. Esta extracción se basa en un kit de extracción de ADN genómico de levadura. Comience agregando 120 microlitros de tampón de digestión y cinco microlitros de enzima lítica de levadura.

A continuación, mezcle las células en la mezcla de reacción utilizando un vórtice e incube la mezcla a 37 grados centígrados durante 40 a 60 minutos. A continuación, agregue 120 microlitros de tampón de lisis y agite la mezcla a alta velocidad durante 10 a 20 segundos. A continuación, añada 250 microlitros de cloroformo y durante un minuto mezcle bien el contenido del tubo.

A continuación, gire el tubo a máxima velocidad durante dos minutos. A continuación, transfiera el sobrenadante a la columna de unión al ADN. Haga girar el sobrenadante a través de la columna utilizando un ciclo de centrifugación de velocidad máxima de un minuto.

Para lavar el ADN en la membrana de la columna, transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección y aplique 300 microlitros de tampón de lavado de ADN. A continuación, repita la centrifugación a máxima velocidad durante un minuto. Repite este paso de lavado una vez más.

Para recolectar el ADN, transfiera la columna de espín a un tubo nuevo. Agregue 60 microlitros de agua y espere de uno a tres minutos. A continuación, centrifugar la columna a máxima velocidad durante 10 segundos para aislar el agua que contiene el ADN eluido.

Ahora agregue entre cinco y 195 microlitros de tampón de alta sensibilidad de ADN bicatenario que contiene reactivo en una concentración de uno a 200. A continuación, mida la fluorescencia de la muestra para calcular el rendimiento. Espere recolectar entre 10 y 50 nanogramos de ADN.

Ahora utiliza la sonicación para romper el ADN en fragmentos de entre 250 y 350 pares de bases. A continuación, utilice un kit estándar para preparar una biblioteca de ADN y secuenciarla utilizando al menos 10 millones de 50 pares de bases en lecturas de un solo extremo. El procedimiento descrito se utilizó para identificar sitios de replicación tardía en levaduras en ciernes.

Las células normales se compararon con las que carecían de Sir2, una proteína desacetilasa. Los datos brutos contenían grandes picos, principalmente debido a la presencia de elementos TY. Estos picos se eliminaron limitando las profundidades de lectura a 2,5 veces la profundidad roja mediana de cada muestra.

A continuación, los datos desenriquecidos se suavizaron con una ventana deslizante de 20 kb. Finalmente, los datos se normalizaron y se trazaron como proporciones a los niveles en G1. Una celda completamente no replicada aparecería en 0.5 y una celda completamente replicada aparecería en uno. En estos datos del cromosoma siete, había evidencia de una región de replicación tardía conocida en el mutante Sir2.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar aquellas regiones del genoma que son las últimas en completar la replicación del ADN y que, por lo tanto, son particularmente vulnerables a las roturas del ADN y otros problemas asociados con la replicación tardía.