G2-seq: Una alto rendimiento basado en la secuencia técnica para identificar replicación tardía de regiones del genoma

El objetivo general de este procedimiento para la secuenciación profunda de ADN a partir de células que han sido clasificadas por citometría de flujo según la fase del ciclo celular es identificar regiones del genoma que se replican extremadamente tarde en el ciclo celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la replicación del ADN, como cuáles regiones del genoma tienen dificultades para completar la replicación del ADN y, por lo tanto, son particularmente vulnerables a reordenamientos genómicos. La principal ventaja de esta técnica es que, aunque es muy sencilla desde el punto de vista experimental, proporciona una visión sorprendentemente detallada de la dinámica de la replicación genómica.

Para comenzar, inocule tubos de ensayo de 15 mililitros que contengan ocho mililitros de YEPD con células de levadura de interés. Puede utilizarse un medio sintético o rico. Incube las células durante la noche durante al menos 12 horas para recolectarlas durante su distribución en fase logarítmica real.

Al día siguiente, cuando los cultivos alcancen una densidad de cinco a 15 millones de células por mililitro, centrifugar las células y resuspenderlas en 1,5 mililitros de etanol al 70 %. A continuación, transferir la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,6 mililitros y dejar que las células incuben a temperatura ambiente durante una hora o durante al menos tres horas en hielo. Después de la inoculación, centrifugar las células y resuspenderlas en un mililitro de citrato de sodio.

Finalmente, sonicar brevemente las células dos veces. A continuación, repetir el ciclo de centrifugación y resuspender la levadura en un mililitro de citrato de sodio que contenga RNasa. Dejar que la RNasa reaccione con la levadura a 50 grados Celsius durante una hora o durante la noche a 37 grados Celsius en un bloque térmico o en un baño de agua.

Después del tratamiento con RNasa, agregue 50 microlitros de solución de proteinasa K a la mezcla y continúe la reacción durante una hora a 50 grados Celsius. Luego, centrifugue las células y re suspenda las células en un mililitro de citrato de sodio. A continuación, centrifugue las células y aspire el sobrenadante utilizando un vacío.

Luego, en luz tenue, resuspenda las células en un mililitro de citrato de sodio con tinción verde de ácidos nucleicos. A continuación, incube la levadura a oscuras durante una hora a temperatura ambiente. Para continuar, cuente las células utilizando un citómetro de flujo con datos de emisión de 530 nanómetros.

Ordénelos según su contenido de ADN en las fases del ciclo celular: G1, S, G2 temprana y G2 tardía. Recolecte al menos 1,6 millones de células haploides de cada fase. Inmediatamente después de ordenar las células, centrifúgelas durante 20 minutos. Aspire el sobrenadante y congele el sedimento a menos 20 grados Celsius para su almacenamiento.

Hemos descubierto que el paso más crítico de este procedimiento consiste simplemente en centrifugar rápidamente las células inmediatamente después de recolectarlas, como máximo una hora tras la clasificación. Esta extracción se basa en un kit de extracción de ADN genómico de levadura. Comience añadiendo 120 microlitros de tampón de digestión y cinco microlitros de enzima lítica de levadura.

Luego, mezcle las células en la mezcla de reacción utilizando un vórtex e incube la mezcla a 37 grados Celsius durante 40 a 60 minutos. A continuación, agregue 120 microlitros de tampón de lisis y vortexee la mezcla a alta velocidad durante 10 a 20 segundos. Luego, agregue 250 microlitros de cloroformo y mezcle completamente el contenido del tubo durante un minuto.

A continuación, centrifugue el tubo a velocidad máxima durante dos minutos. Luego, transfiera el sobrenadante a la columna de unión al ADN. Haga pasar el sobrenadante a través de la columna mediante una centrifugación de un minuto a velocidad máxima.

Para lavar el ADN en la membrana de la columna, transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección y agregue 300 microlitros de tampón de lavado de ADN. Luego repita la centrifugación a velocidad máxima durante un minuto. Repita este paso de lavado una vez más.

Para recolectar el ADN, transfiera la columna de centrifugación a un tubo nuevo. Añada 60 microlitros de agua y espere de uno a tres minutos. Luego, centrifugue la columna a velocidad máxima durante 10 segundos para aislar el agua que contiene el ADN eluido.

Ahora agregue entre cinco y 195 microlitros de tampón de ADN de doble cadena de alta sensibilidad que contenga el reactivo en una concentración de uno a 200. Luego, mida la fluorescencia de la muestra para calcular el rendimiento. Espere obtener entre 10 y 50 nanogramos de ADN.

Ahora use sonicación para fragmentar el ADN en fragmentos de entre 250 y 350 pares de bases. Luego, utilice un kit estándar para preparar una biblioteca de ADN y secuenciarla utilizando al menos 10 millones de lecturas simples de 50 pares de bases. El procedimiento descrito se utilizó para identificar sitios de replicación tardía en levadura brotante.

Se compararon células normales con aquellas que carecían de Sir2, una proteína desacetilasa. Los datos brutos contenían grandes picos, principalmente debido a la presencia de elementos TY. Estos picos se eliminaron limitando las profundidades de lectura a 2,5 veces la profundidad mediana de lectura para cada muestra.

Los datos desprovistos de picos se suavizaron luego con una ventana deslizante de 20 kb. Finalmente, los datos se normalizaron y representaron como proporciones respecto a los niveles en G1. Una célula completamente no replicada aparecería en 0,5 y una célula completamente replicada aparecería en uno. En estos datos del cromosoma siete, se observó evidencia de una región conocida de replicación tardía en el mutante Sir2.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar aquellas regiones del genoma que son las últimas en completar la replicación del ADN y que, por lo tanto, son particularmente vulnerables a roturas de ADN y otros problemas asociados con la replicación tardía.