Name: G2-seq: Una alto rendimiento basado en la secuencia técnica para identificar replicación tardía de regiones del genoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprende a identificar regiones de replicación tardía del genoma mediante citometría de flujo y secuenciación de alto rendimiento en levaduras. Este método simple revela la dinámica de la replicación del ADN y ayuda a estudiar la estabilidad genómica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por beca NIH GM117446 a A.B.

1. preparación de células de flujo Cytometry clasificación
<ol><li>Inocular tubos de ensayo de 15 mL que contiene 8 mL de caldo YEPD tal que los cultivos alcanzan una densidad de 5 x 106 a 1.5 x 107 células por mL después de crecimiento durante la noche (véase la discusión Nota 1).</li>
	<li>Desactivación de las células de levadura (1.400 x g, a temperatura ambiente o 4 ° C) en un tubo de centrífuga de 15 mL tapón durante 5 min, resuspender las células en etanol al de 70% 1.5 mL y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga 1.6 mL, dejando este sit 1 h a temperatura ambiente o por lo menos 3 h de hielo ( se puede almacenar indefinidamente a 4 ° C) (véase punto de discusión (2)).</li>
	<li>Desactivación de las células de levadura en la microcentrífuga (14.000 x g, 4 ° C) durante 1 minuto, resuspender en 1 mL citrato de sodio 50 mM, pH 7.2, giro (14.000 x g, 4 ° C) durante 1 minuto, aspirar el sobrenadante, resuspender en 1 mL citrato de sodio 50 mM, pH 7.2 , que contiene 0.25 mg/mL solución de Rnasa por 1 h a 50 ° C o durante la noche a 37 ° C en baño de agua o bloque de calor.</li>
	<li>Añadir 50 μl proteinasa K solución (20 mg/mL resuspendió en 10 mM Tris, pH 7,5, 2 mM CaCl2, peso de 50% de glicerol de volumen) e incubar 1 h a 50 ° C.</li>
	<li>Desactivación de las células (14.000 x g, 4 º C), resuspender las células en 1 mL citrato de sodio 50 mM, pH 7.2, desactivación (14.000 x g, 4 º C), aspirar el sobrenadante con vacío, resuspender en 1 mL 1 μm ácido nucleico verde tensión resuspendió en citrato de sodio 50 mM , pH 7.2 e incubar en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente, someter a ultrasonidos 2 x 2 s cada (2 vatios de potencia de salida).</li>
</ol>2. celda de clasificación
<ol><li>Utilizando un clasificador de celda, ordenar las células según el contenido de ADN en las fases G1, S, "primera G2" y "G2 tardía", que recoge al menos 1,6 millones células haploides de cada fase del ciclo celular como en la figura 1 (véase punto de discusión (3)).</li>
	<li>Células de transferencia a tubos de microcentrífuga y desactivación de las células durante 20 min a 14.000 xg a 4 ° C en la microcentrífuga y aspirar sobrenadante con vacío (la pelotilla puede guardarse congelada a-20 ° C por tiempo indefinido; véase el punto (4)).</li>
</ol>3. DNA extracción y la preparación de la secuenciación de las bibliotecas
Nota: Los pasos siguientes se basan en "Protocolo" en la extracción de ADN genómico de levadura Kit (véase Tabla de materiales).
<ol><li>Añadir 120 μl de "Tampón de digestión", un tampón patentado que permite enzimas líticas levadura y digerir la pared celular y 5 μl de enzima lítica de la levadura, agite con un vórtex, incubar a 37 ° C durante 40-60 min.</li>
	<li>Añadir 120 μl de tampón de lisis del"," un propiedad tampón que contiene detergente y vórtice dura de 10-20 s.</li>
	<li>Añadir cloroformo μl 250 - mezclar bien durante 1 minuto.</li>
	<li>Girar a la velocidad máxima en una microcentrífuga durante 2 minutos.</li>
	<li>Cargar el sobrenadante a la columna de unión de ADN y centrifugar a máxima velocidad en una microcentrífuga durante 1 minuto.</li>
	<li>Añadir 300 μL de "ADN lavado Tampón", un tampón patentado que contiene etanol y centrifugue durante 1 min a velocidad máxima en una microcentrífuga. Deseche el flujo a través, añadir 300 μL de tampón de lavado de ADN y repita el proceso de lavado.</li>
	<li>Transferir la columna spin a un tubo de microcentrífuga fresco, añadir 60 μL de agua (no TE) - esperar 1-3 minutos y luego centrifugar durante 10 s a fin de eluir el ADN.</li>
	<li>Medir la concentración al añadir 5 μl de ADN a 195 μl del reactivo de alta sensibilidad de dsDNA que ha sido diluido 1: 200 en buffer de alta sensibilidad de dsDNA y luego medir la fluorescencia en un fluorómetro, con 10 μl de estándares suministrados para la calibración; esperar entre 10 y 50 ng de rendimiento total de ADN.</li>
	<li>Someter a ultrasonidos (pico incidente energía 450, Factor de servicio 30%, ciclos por estallar 200, tratamiento tiempo 60 s, 6 de nivel de agua) para romper el ADN en fragmentos de 250-350 bp.</li>
	<li>Preparar una biblioteca utilizando el kit de preparación de muestras de ADN y secuenciarlo (lecturas del solo-fin de bp 50 por lo menos 10 millones) en el instrumento de la secuencia de DNA en modo rápido (ver nota de discusión (5)).</li>
</ol>4. Análisis de la secuencia de datos y generación de replicación de perfiles
<ol><li>Alinear secuencias de genoma de sacCer3 de Saccharomyces cerevisiae con Gsnap12 (ver nota de discusión (6)).</li>
	<li>Determinar por la base par Lee profundidades utilizando "genomeCoverageBed" software13 de Bedtools.</li>
	<li>Quitar puntas artefactuales en profundidades de lectura, si está presente (ver nota de discusión (7)).</li>
	<li>Lisa Lee profundidades por cromosoma usando medias en una kb 20 corredera ventana mediante la función "runMean" en R paquete "caTools" (ver nota de discusión (8)).</li>
	<li>Parcela Lee profundidades en fase S, G2 temprana y tardío G2 como un porcentaje de profundidad leer completamente replicado (ver nota de discusión (9)).</li>
</ol>

<ol><li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li>
<li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li>
<li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+replication+fork+barrier+at+the+3%27+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li>
<li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+dynamics+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li>
<li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li>
<li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li>
<li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li>
<li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+fragile+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li>
<li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li>
<li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li>
<li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li>
<li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment%3A+Enhancements+to+Speed%2C+Accuracy%2C+and+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Mientras que esta técnica es robusta y relativamente directo, una atención especial debería destinarse a los siguientes:
(1) recomendamos que las culturas crecen durante al menos 12 h antes de llegar a la fase de registro, ya que las diferencias se manifiestan en ciclo celular distribuciones si las culturas son cosechadas después de haber alcanzado la densidad deseada a 4 h después de la inoculación. Nuestra hipótesis es que una distribución de ciclo celular que ha alcanzado un equilibrio rela...

Replicación del genoma eucariota se inicia en múltiples sitios discretos, llamados origen de replicación, de que la replicación horquillas proceden en ambas direcciones (revisados en Fragkos et al., 20151). Orígenes varían en su tiempo y eficiencia de la cocción, y se han desarrollado varias técnicas para supervisar la actividad de origen de replicación y aclarar las causas de esta variación. De niveles de single-stranded DNA2, que se forma alrededor de origen activo, puede inferirse la actividad de orígenes individuales o mediante el uso de electroforesis en 2D para supervisar la replicación específica intermedios3, que pueden ser detectadas con sondas radiactivas. Ambas de estas técnicas se aplican más fácilmente en S. cerevisiae que en células de mamífero, porque orígenes se limitan a secuencias específicas conocidas en la antigua. Con el advenimiento de los microarrays, llegó a ser posible evaluar origen disparando a nivel mundial. Esto fue hecho primero por etiquetado ADN con isótopos pesados, liberación de las células de un bloque de G1 en medio que contiene isótopos ligeros y monitoreo luego de la formación de pesados ligeros híbridos ADN en el genoma4. La introducción de secuenciación de alto rendimiento permitido genoma similares monitoreo de la actividad de origen sin el requisito de etiquetado isotópico caro. Las células fueron clasificadas en un citómetro de flujo según el contenido de ADN y su ADN sometido a secuenciación profunda. Porque la cobertura de secuencia procede de 1 x a 2 x en el transcurso de la fase S, sincronización de replicación relativa puede evaluarse comparando profundidades lecturas de células en fase S que en G1 o G25,6. Estas técnicas, aplicadas particularmente a levadura, condujeron a una comprensión más profunda de cómo proteínas de replicación de ADN, secuencia de la DNA y estructura de la cromatina regulan eficiencia y tiempo de origen.
La transmisión fiel de la información genética durante la proliferación celular requiere no sólo exitosa iniciación de la replicación del ADN, que ocurre en el origen, pero también superación de replicación, que ocurre el encuentro de las horquillas de replicación. Como iniciación de la replicación, el momento de la terminación de la replicación varía a lo largo del genoma con ciertas regiones restantes sin replicar hasta tarde en el ciclo celular. Tales regiones pueden ser particularmente distantes de orígenes de replicación activa o pueden contener secuencias o estructuras de cromatina que impiden polimerasas de la DNA. Tarde replicar las regiones puede manifestarse como sitios frágiles, que se asocian a fractura cromosómica y mayores tasas de mutación y se han implicado en cáncer y envejecimiento7,8,9. Sin embargo, a pesar de la importancia de la correcta terminación de la replicación del ADN en el mantenimiento de la estabilidad del genoma, nuestra comprensión de dónde y cómo esto ocurre ha retrasado lejos detrás de la iniciación de la replicación. Y mientras que los genes individuales cuya replicación tardía se ha asociado con la enfermedad han sido estudiados con, por ejemplo, qPCR10, globales estudios dirigidos a dilucidar las localizaciones y causas de la última replicación han faltado subyacentes. Aquí describimos una técnica que nos referimos a como "G2 seq" en el que combinamos la citometría de flujo con secuenciación de alto rendimiento para arrojar luz sobre la terminación de la replicación del genoma de la levadura11. Con pequeñas modificaciones, este protocolo puede ser adaptado a cualquier célula que puede ser flujo y ordenada según el contenido de ADN.

<table><tbody><tr><td>Kit de ADN genómico YeaStar</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 &micro; M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td><td>resuspender en 50 mM de citrato de sodio, pH 7,2</td></tr><tr><td>50 mM citrato de sodio, pH 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de ARNasa (0,25 mg / mL)</td><td>Sigma</td><td>R6513</td><td>0,25 mg / mL RNasa resuspendida en 50 mM de citrato de sodio, pH 7,2, hervir la solución de ARNasa durante 10 minutos solo antes del primer uso, y a partir de entonces almacenar a -20&deg;</td></tr><tr><td>solución de proteinasa K (20 mg / mL)</td><td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td><td>resuspender en 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glicerol, almacenar a -20 grados; C</td></tr><tr><td>Modelo 50 Desmembrador</td><td>sónico Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD Biosciences FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Columnas Zymo-spin III</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorímetro</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Modelo LE220 Ultrasonido Focalizado</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq DNA LT Kit de preparación de muestras</td><td>Illumina</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500 instrumento</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401 y ndash; 2501</td><td></td></tr><tr><td>software de alineación gsnap</td><td>software de código abierto / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq: una alto rendimiento basado en la secuencia técnica para identificar replicación tardía de regiones del genoma

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerosas técnicas se han desarrollado para seguir el progreso de la replicación del ADN a través de la fase S del ciclo celular. La mayoría de estas técnicas se han dirigido hacia la aclaración de la ubicación y el momento de inicio de la duplicación del genoma en lugar de su realización. Sin embargo, es fundamental que entendemos regiones del genoma que son última completar la replicación, porque estas regiones sufren niveles elevados de rotura cromosómica y mutación, y han sido asociados con la enfermedad y el envejecimiento. Aquí describimos cómo hemos ampliado una técnica que se ha utilizado para vigilar la iniciación de la replicación en cambio identificar las regiones del genoma última replicación completa. Este enfoque se basa en una combinación de citometría de flujo y la secuenciación de alto rendimiento. Aunque este informe se centra en la aplicación de esta técnica a la levadura, el enfoque puede utilizarse con cualquier célula que se puede ordenar en un citómetro de flujo según el contenido de ADN.

Hemos utilizado el procedimiento descrito anteriormente para identificar sitios de replicación tardíos en levadura de florecimiento. Prueba este planteamiento con una región de replicación finales conocida en un cromosoma artificial demostró la técnica exacta y fiable. Nuestros resultados también han demostrado la importancia biológica de la oportuna terminación de la replicación, mostrando que una región replicación tardía en el cromosoma 7, que identificamos como replicación de fines so...

Describimos una técnica para combinar la citometría de flujo y la secuenciación de alto rendimiento para identificar regiones finales replicación del genoma.

G2-seq: Una alto rendimiento basado en la secuencia técnica para identificar replicación tardía de regiones del genoma

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

El objetivo general de este procedimiento para la secuenciación profunda de ADN a partir de células que han sido clasificadas por citometría de flujo según la fase del ciclo celular es identificar regiones del genoma que se replican extremadamente tarde en el ciclo celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la replicación del ADN, como cuáles regiones del genoma tienen dificultades para completar la replicación del ADN y, por lo tanto, son particularmente vulnerables a reordenamientos genómicos. La principal ventaja de esta técnica es que, aunque es muy sencilla desde el punto de vista experimental, proporciona una visión sorprendentemente detallada de la dinámica de la replicación genómica.Para comenzar, inocule tubos de ensayo de 15 mililitros que contengan ocho mililitros de YEPD con células de levadura de interés. Puede utilizarse un medio sintético o rico. Incube las células durante la noche durante al menos 12 horas para recolectarlas durante su distribución en fase logarítmica real.Al día siguiente, cuando los cultivos alcancen una densidad de cinco a 15 millones de células por mililitro, centrifugar las células y resuspenderlas en 1,5 mililitros de etanol al 70 %. A continuación, transferir la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,6 mililitros y dejar que las células incuben a temperatura ambiente durante una hora o durante al menos tres horas en hielo. Después de la inoculación, centrifugar las células y resuspenderlas en un mililitro de citrato de sodio.Finalmente, sonicar brevemente las células dos veces. A continuación, repetir el ciclo de centrifugación y resuspender la levadura en un mililitro de citrato de sodio que contenga RNasa. Dejar que la RNasa reaccione con la levadura a 50 grados Celsius durante una hora o durante la noche a 37 grados Celsius en un bloque térmico o en un baño de agua.Después del tratamiento con RNasa, agregue 50 microlitros de solución de proteinasa K a la mezcla y continúe la reacción durante una hora a 50 grados Celsius. Luego, centrifugue las células y re suspenda las células en un mililitro de citrato de sodio. A continuación, centrifugue las células y aspire el sobrenadante utilizando un vacío.Luego, en luz tenue, resuspenda las células en un mililitro de citrato de sodio con tinción verde de ácidos nucleicos. A continuación, incube la levadura a oscuras durante una hora a temperatura ambiente. Para continuar, cuente las células utilizando un citómetro de flujo con datos de emisión de 530 nanómetros.Ordénelos según su contenido de ADN en las fases del ciclo celular: G1, S, G2 temprana y G2 tardía. Recolecte al menos 1,6 millones de células haploides de cada fase. Inmediatamente después de ordenar las células, centrifúgelas durante 20 minutos. Aspire el sobrenadante y congele el sedimento a menos 20 grados Celsius para su almacenamiento.Hemos descubierto que el paso más crítico de este procedimiento consiste simplemente en centrifugar rápidamente las células inmediatamente después de recolectarlas, como máximo una hora tras la clasificación. Esta extracción se basa en un kit de extracción de ADN genómico de levadura. Comience añadiendo 120 microlitros de tampón de digestión y cinco microlitros de enzima lítica de levadura.Luego, mezcle las células en la mezcla de reacción utilizando un vórtex e incube la mezcla a 37 grados Celsius durante 40 a 60 minutos. A continuación, agregue 120 microlitros de tampón de lisis y vortexee la mezcla a alta velocidad durante 10 a 20 segundos. Luego, agregue 250 microlitros de cloroformo y mezcle completamente el contenido del tubo durante un minuto.A continuación, centrifugue el tubo a velocidad máxima durante dos minutos. Luego, transfiera el sobrenadante a la columna de unión al ADN. Haga pasar el sobrenadante a través de la columna mediante una centrifugación de un minuto a velocidad máxima.Para lavar el ADN en la membrana de la columna, transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección y agregue 300 microlitros de tampón de lavado de ADN. Luego repita la centrifugación a velocidad máxima durante un minuto. Repita este paso de lavado una vez más.Para recolectar el ADN, transfiera la columna de centrifugación a un tubo nuevo. Añada 60 microlitros de agua y espere de uno a tres minutos. Luego, centrifugue la columna a velocidad máxima durante 10 segundos para aislar el agua que contiene el ADN eluido.Ahora agregue entre cinco y 195 microlitros de tampón de ADN de doble cadena de alta sensibilidad que contenga el reactivo en una concentración de uno a 200. Luego, mida la fluorescencia de la muestra para calcular el rendimiento. Espere obtener entre 10 y 50 nanogramos de ADN.Ahora use sonicación para fragmentar el ADN en fragmentos de entre 250 y 350 pares de bases. Luego, utilice un kit estándar para preparar una biblioteca de ADN y secuenciarla utilizando al menos 10 millones de lecturas simples de 50 pares de bases. El procedimiento descrito se utilizó para identificar sitios de replicación tardía en levadura brotante.Se compararon células normales con aquellas que carecían de Sir2, una proteína desacetilasa. Los datos brutos contenían grandes picos, principalmente debido a la presencia de elementos TY. Estos picos se eliminaron limitando las profundidades de lectura a 2,5 veces la profundidad mediana de lectura para cada muestra.Los datos desprovistos de picos se suavizaron luego con una ventana deslizante de 20 kb. Finalmente, los datos se normalizaron y representaron como proporciones respecto a los niveles en G1. Una célula completamente no replicada aparecería en 0,5 y una célula completamente replicada aparecería en uno. En estos datos del cromosoma siete, se observó evidencia de una región conocida de replicación tardía en el mutante Sir2.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar aquellas regiones del genoma que son las últimas en completar la replicación del ADN y que, por lo tanto, son particularmente vulnerables a roturas de ADN y otros problemas asociados con la replicación tardía.

g2-seq-high-throughput-sequencing-based-technique-for-identifying

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

enriquecimiento de ADNg para la secuenciación de NGS es una herramienta fácil y potente para el estudio de mutaciones constitucionales. En este artículo se presenta el procedimiento para analizar de forma sencilla la secuencia completa de 11 genes implicados en la reparación de daños en el ADN.

gDNA Enriquecimiento por una tecnología basada en la transposasa de Análisis NGS de la secuencia entera de BRCA1, BRCA2, y 9 genes involucrados en la reparación del ADN daños

La secuenciación de amplicones de bisulfito (BSAS) es un método para cuantificar la metilación de citosina en regiones genómicas específicas de interés. Este método utiliza la conversión de bisulfito emparejada con la amplificación por PCR de las regiones objetivo antes de la secuenciación de próxima generación para producir una cuantificación absoluta de la metilación del ADN a un nivel específico de base.

Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación

Describimos un protocolo para amplificar los sitios de integración retroviral a partir del ADN genómico de las células infectadas, secuenciar las uniones virus-huésped amplificadas y luego mapear estas secuencias a un genoma de referencia. También describimos técnicas para cuantificar la distribución de los sitios de integración en relación con diversas anotaciones genómicas utilizando BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Describimos aquí un enfoque relativamente rápido y simple para mapear el tiempo de replicación de todo el genoma de los mamíferos, desde el aislamiento celular hasta el análisis básico de los resultados de la secuenciación. Se proporcionará un mapa genómico de un programa de replicación representativo siguiendo el protocolo.

Determinación de todo el genoma de los mamíferos sincronización de replicación de ADN por medición del contenido

Este manuscrito describe el procedimiento experimental y el análisis de software para un ensayo de sitio de integración bidireccional que puede analizar simultáneamente el ADN de unión vector-huésped aguas arriba y aguas abajo. Los productos de PCR bidireccionales pueden utilizarse para cualquier plataforma de secuenciación aguas abajo. Los datos resultantes son útiles para una comparación cuantitativa de alto rendimiento de dianas de ADN integradas.

Sitio de Integración Retroviral Bidireccional Metodología de PCR y Flujo de Trabajo de Análisis de Datos Cuantitativos

Gel-seq permite a los investigadores a preparar simultáneamente las bibliotecas de ambos ADN - y RNA-seq en el insignificante costo adicional a partir de 100-1000 células usando un dispositivo simple de hidrogel. Este artículo presenta un enfoque detallado para la fabricación del dispositivo así como el protocolo biológico para generar bibliotecas emparejadas.

Gel-seq: Un método para la preparación de biblioteca simultánea de secuenciación de DNA y RNA utilizando Matrices de hidrogel

La identificación de interacciones físicas entre los genes y elementos reguladores es un reto, pero ha sido facilitada por los métodos de captura de conformación de cromosoma. Esta modificación al Protocolo de 4C-seq mitiga sesgo PCR minimizando la amplificación excesiva de plantillas de PCR y maximiza el mappability de Lee mediante la incorporación de un paso de síntesis de enzima de la restricción además.

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

Aquí, presentamos un protocolo para enriquecer los sitios endógenos de unión al ARN o "huellas" de los complejos de ARN:proteína (RNP) de células de mamíferos. Este enfoque implica dos inmunoprecipitaciones de subunidades RNP y por lo tanto se denomina inmunoprecipitación de ARN en tándem (RIPiT).

Identificación de Huellas de ARN:Complejos proteicos a través de la inmunoprecipitación de ARN en tándem seguido de secuenciación (RIPiT-Seq)

Aquí, describimos el procedimiento para analizar la progresión de la replicación a través de repeticiones patógenas propensas a la estructura utilizando electroforesis en gel bidimensional.

Análisis electroforético de la replicación a través de repeticiones de ADN propensas a la estructura dentro del episoma humano basado en SV40

Una metodología de alto rendimiento, la producción de protoplastos de tabaco automatizado y se describe la transformación. El sistema robótico permite la expresión de genes masivamente paralelo y el descubrimiento en el sistema modelo BY-2 que debe ser traducible a los cultivos no modelo.

Una plataforma robótica para de alto rendimiento de protoplastos aislamiento y Transformación

Aprende a identificar regiones de replicación tardía del genoma mediante citometría de flujo y secuenciación de alto rendimiento en levaduras. Este método simple revela la dinámica de la replicación del ADN y ayuda a estudiar la estabilidad genómica.

G2-seq: Una alto rendimiento basado en la secuencia técnica para identificar replicación tardía de regiones del genoma

Explorar más videos