Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo

El objetivo general de este ensayo de invasión es cuantificar las capacidades migratorias e invasivas de las células raras y sensibles en un entorno 3D sin desalojar las células de su microentorno. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer sobre la capacidad de invasión de eventos sensibles y agudos, como el producto de fusión de células cancerosas. La principal ventaja de esta técnica es que las células se analizan en su microentorno original utilizando un entorno 3D.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento del cáncer, ya que se puede utilizar para el cribado de agentes farmacológicos capaces de inhibir la invasión de las células cancerosas y la metástasis. La demostración visual de esta técnica es fundamental. La aspiración en la temperatura y el pH de la mezcla de colágeno afectan a su polimerización y la manipulación brusca hace que el gel se desprenda.

Comience tratando un plato de cultivo de 35 milímetros con un pozo de fondo de vidrio de 10 milímetros con un mililitro de ácido clorhídrico molar para reducir la hidrofobicidad del vidrio. Después de 15 minutos, lave la placa dos veces con un mililitro de PBS por lavado, seguido de un lavado con un mililitro de etanol al 70%. A continuación, enjuague la placa con un mililitro de medio de cultivo específico para las células de interés que se van a utilizar.

Y siembra la placa con las celdas de interés. A continuación, coloque la placa en una incubadora de cultivos celulares. Cuando las células alcanzan el 100% de confluencia, combine 114,5 microlitros de colágeno de cola de rata recién preparado, 16,6 microlitros de medio DMEM 10 X y 33,1 microlitros de medio de cultivo suplementado con atrayente de quimioterapia de interés en un tubo de microcentrífuga en hielo.

Neutraliza la mezcla de colágeno con 14 microlitros de bicarbonato de sodio y superpone las células con 80 microlitros de gel. Deje que el colágeno se polimerice en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante 30 minutos. A continuación, coloque dos mililitros de medio de cultivo de células séricas reducidas al dos por ciento sobre el gel y devuelva cuidadosamente las células a la incubadora durante el período de tiempo experimental adecuado sin desalojar el colágeno.

Al final de la incubación, retire suavemente el medio y enjuague cuidadosamente el gel con un mililitro de PBS. Fije las celdas con un mililitro de paraformaldehído al cuatro por ciento durante 15 minutos seguido de dos lavados en un mililitro de PBS por lavado. A continuación, etiquete las células con solución de DAPI durante 20 minutos a temperatura ambiente y obtenga una imagen de la invasión tridimensional de colágeno in vitro mediante microscopía confocal.

Aquí, se muestra la cuantificación de la invasión del gel de colágeno por una línea celular de cáncer de mama y productos de fusión de células de cáncer de mama en respuesta a un atrayente de quimioterapia durante un período de migración de 48 horas. En particular, también se observó la migración de productos raros de fusión de células de cáncer de mama al gel de colágeno en respuesta al atrayente de quimioterapia. Las células permanecen sanas durante todo el experimento con gel de colágeno, como lo demuestra el mantenimiento de un número de células robusto y su morfología a las 48 horas después de la polimerización en gel.

Este ensayo vertical de gel de colágeno también permite analizar la cinética de la migración celular en el momento de la invasión, mediante imágenes de la migración celular en la serie Z, así como la morfología de las células migratorias que se van a capturar in situ. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar una placa de cultivo que sea compatible con su microscopio. Siguiendo este procedimiento, se pueden introducir otras variables como la modificación de la fuerza del colágeno o el uso de diferentes atrayentes de quimioterapia para responder preguntas adicionales sobre los efectos de la participación de la MEC en la invasión celular o la de diferentes atrayentes de quimioterapia en la invasión celular, respectivamente.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología y el cáncer pudieran detectar inhibidores farmacológicos de la metástasis, así como explorar la cicatrización de heridas en todas las respuestas inflamatorias in vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la capacidad migratoria e invasiva de las células raras y sensibles, en un entorno 3D, sin distorsionar las células en la micro participación. No olvide que caminar con células cancerosas humanas, ácido clorhídrico, paraformaldehído y DAPI puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de un gabinete bioséptico número dos y una retención de humos mientras se realiza este procedimiento.