Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo
12 de marzo de 2018
Este protocolo describe un ensayo de invasión vertical invertido que podría ser utilizado para cuantificar la capacidad de migración y la invasión de las células en un entorno tridimensional conservando el microambiente celular. Este ensayo es adecuado para las células raras o sensibles.
El objetivo general de este ensayo de invasión es cuantificar las capacidades migratorias e invasivas de las células raras y sensibles en un entorno 3D sin desalojar las células de su microentorno. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer sobre la capacidad de invasión de eventos sensibles y agudos, como el producto de fusión de células cancerosas. La principal ventaja de esta técnica es que las células se analizan en su microentorno original utilizando un entorno 3D.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento del cáncer, ya que se puede utilizar para el cribado de agentes farmacológicos capaces de inhibir la invasión de las células cancerosas y la metástasis. La demostración visual de esta técnica es fundamental. La aspiración en la temperatura y el pH de la mezcla de colágeno afectan a su polimerización y la manipulación brusca hace que el gel se desprenda.
Comience tratando un plato de cultivo de 35 milímetros con un pozo de fondo de vidrio de 10 milímetros con un mililitro de ácido clorhídrico molar para reducir la hidrofobicidad del vidrio. Después de 15 minutos, lave la placa dos veces con un mililitro de PBS por lavado, seguido de un lavado con un mililitro de etanol al 70%. A continuación, enjuague la placa con un mililitro de medio de cultivo específico para las células de interés que se van a utilizar.
Y siembra la placa con las celdas de interés. A continuación, coloque la placa en una incubadora de cultivos celulares. Cuando las células alcanzan el 100% de confluencia, combine 114,5 microlitros de colágeno de cola de rata recién preparado, 16,6 microlitros de medio DMEM 10 X y 33,1 microlitros de medio de cultivo suplementado con atrayente de quimioterapia de interés en un tubo de microcentrífuga en hielo.
Neutraliza la mezcla de colágeno con 14 microlitros de bicarbonato de sodio y superpone las células con 80 microlitros de gel. Deje que el colágeno se polimerice en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante 30 minutos. A continuación, coloque dos mililitros de medio de cultivo de células séricas reducidas al dos por ciento sobre el gel y devuelva cuidadosamente las células a la incubadora durante el período de tiempo experimental adecuado sin desalojar el colágeno.
Al final de la incubación, retire suavemente el medio y enjuague cuidadosamente el gel con un mililitro de PBS. Fije las celdas con un mililitro de paraformaldehído al cuatro por ciento durante 15 minutos seguido de dos lavados en un mililitro de PBS por lavado. A continuación, etiquete las células con solución de DAPI durante 20 minutos a temperatura ambiente y obtenga una imagen de la invasión tridimensional de colágeno in vitro mediante microscopía confocal.
Aquí, se muestra la cuantificación de la invasión del gel de colágeno por una línea celular de cáncer de mama y productos de fusión de células de cáncer de mama en respuesta a un atrayente de quimioterapia durante un período de migración de 48 horas. En particular, también se observó la migración de productos raros de fusión de células de cáncer de mama al gel de colágeno en respuesta al atrayente de quimioterapia. Las células permanecen sanas durante todo el experimento con gel de colágeno, como lo demuestra el mantenimiento de un número de células robusto y su morfología a las 48 horas después de la polimerización en gel.
Este ensayo vertical de gel de colágeno también permite analizar la cinética de la migración celular en el momento de la invasión, mediante imágenes de la migración celular en la serie Z, así como la morfología de las células migratorias que se van a capturar in situ. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar una placa de cultivo que sea compatible con su microscopio. Siguiendo este procedimiento, se pueden introducir otras variables como la modificación de la fuerza del colágeno o el uso de diferentes atrayentes de quimioterapia para responder preguntas adicionales sobre los efectos de la participación de la MEC en la invasión celular o la de diferentes atrayentes de quimioterapia en la invasión celular, respectivamente.
Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología y el cáncer pudieran detectar inhibidores farmacológicos de la metástasis, así como explorar la cicatrización de heridas en todas las respuestas inflamatorias in vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la capacidad migratoria e invasiva de las células raras y sensibles, en un entorno 3D, sin distorsionar las células en la micro participación. No olvide que caminar con células cancerosas humanas, ácido clorhídrico, paraformaldehído y DAPI puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de un gabinete bioséptico número dos y una retención de humos mientras se realiza este procedimiento.
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Descripción general
Este protocolo describe un ensayo de invasión vertical invertido que cuantifica las capacidades de migración e invasión de células raras y sensibles en un entorno tridimensional, preservando al mismo tiempo el microambiente celular. Este método es particularmente relevante en la investigación del cáncer.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Migración celular
- Investigación del cáncer
- Ensayos de invasión
Antecedentes
- El ensayo permite el análisis de células en su microambiente original.
- Está diseñado para células raras y sensibles.
- Comprender la invasión celular es fundamental para el desarrollo de terapias contra el cáncer.
- La demostración visual de la técnica es esencial para su correcta ejecución.
Objetivo del estudio
- Cuantificar las capacidades migratoria e invasiva de las células.
- Explorar la capacidad invasiva de células sensibles.
- Seleccionar agentes farmacológicos que inhiban la invasión y metástasis de células cancerosas.
Métodos Utilizados
- Ensayo de invasión vertical invertida
- Cultivo celular tridimensional
- Análisis de células en su microentorno
- Evaluación de los efectos de la temperatura y el pH sobre la polimerización del colágeno
Resultados principales
- Demuestra la capacidad de analizar el comportamiento celular en un entorno tridimensional.
- Destaca la importancia de mantener el microentorno celular.
- Proporciona información sobre las capacidades invasivas de las células cancerosas.
- Muestra el potencial para el cribado de agentes terapéuticos.
Conclusiones
- El ensayo es una herramienta valiosa para la investigación del cáncer.
- Conserva el microambiente de las células sensibles.
- Puede contribuir al desarrollo de terapias dirigidas contra la invasión y metástasis del cáncer.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este ensayo permite a los equipos de I+D biofarmacéutica evaluar el potencial invasivo de modelos celulares raros y sensibles en un microentorno tridimensional fisiológicamente relevante, sin interrumpir las interacciones nativas entre células y la matriz extracelular (ECM). Al preservar el nicho celular original, el método facilita la desvinculación mecanicista de dianas relacionadas con metástasis y mejora la confianza predictiva en la validación temprana de dianas. Aborda una brecha crítica en la selección preclínica, donde los ensayos tradicionales comprometen la integridad del microentorno, mejorando así la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la optimización del fármaco líder.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el análisis de la invasión en modelos celulares raros o derivados de fusión bajo condiciones microambientales nativas.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad artefactual causada por el desplazamiento celular, mejorando la reproducibilidad de los fenotipos de invasión entre experimentos.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos en dianas al vincular perturbaciones moleculares con resultados funcionales de invasión en un contexto tridimensional.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Listo para ensayos: Genera métricas cuantitativas estandarizadas de invasión compatibles con imágenes de alto contenido y flujos de trabajo de análisis automatizado.
- Reproducibilidad: Minimiza la variabilidad entre pocillos al eliminar la perturbación mecánica de las capas celulares durante la preparación del ensayo.
- Escalabilidad: Compatible con diferentes concentraciones de colágeno y quimioatractantes, lo que permite estudios de relación estructura-actividad (SAR) para inhibidores de metástasis.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la invasión del cáncer humano utilizando células híbridas fibroblasto-epiteliales que reflejan las interacciones estroma-tumor in vivo.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos in vitro con validación preclínica al mantener señales del microambiente críticas para el comportamiento invasivo.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Proporciona datos funcionales de invasión para priorizar dianas o compuestos con menor probabilidad de fracaso en fases avanzadas debido a una modelización deficiente del microambiente.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta la identificación de compuestos líder, ofreciendo una alternativa que preserva el microentorno frente a los sistemas de cámara de Boyden o transbienales para programas relacionados con metástasis.
- Biología del Descubrimiento: Apoya pruebas basadas en hipótesis de vías de invasión mediante imágenes en tiempo real con z-stacks de la migración celular dentro de geles de colágeno fisiológicos.
- Selección: Proporciona datos de punto final de invasión adecuados para la selección de bibliotecas de compuestos, particularmente para agentes que actúan sobre la remodelación de la MEC o la señalización quimiotáctica.
- Análisis: Permite la cuantificación del número de células invadidas y el análisis morfométrico, aportando lecturas multiparamétricas para la correlación estructura-función.
- Investigación Traducional: Modela la invasión mediada por estroma utilizando híbridos de MSC y células cancerosas, apoyando estudios mecanicistas vinculados a biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Es adaptable a diferentes tipos de cáncer y cultivos celulares con estroma, promoviendo la reutilización de la plataforma en programas de metástasis y cicatrización de heridas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del objetivo al reducir los falsos positivos derivados de la alteración del microentorno.
- Valor operativo: Mejora la robustez del ensayo mediante protocolos estandarizados de polimerización del gel y superposición.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos de invasión fisiológicamente relevantes en una etapa temprana del proceso.
- Impacto en la cartera: Permite el avance estratificado por riesgo de inhibidores de metástasis basado en perfiles funcionales de invasión en 3D.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular tridimensional y microscopía confocal para una cuantificación precisa de la invasión.
- Depende de un control preciso de la temperatura y del pH durante la preparación del colágeno para garantizar una polimerización del gel consistente.
- Necesita una dosificación estandarizada de quimioatractantes y condiciones de medio con suero reducido para obtener respuestas quimiotácticas reproducibles.
- La adaptación a proteínas alternativas de la matriz extracelular (por ejemplo, Matrigel, fibrina) puede requerir la optimización de la cinética de gelación y de la concentración.
- Se limita a células adherentes o semiadherentes capaces de invadir hacia arriba a través de una capa de gel; las suspensiones no adherentes pueden requerir modificaciones.
