Método de tubo de rodillo modificado precisamente localizada y repetitiva imagen intermitente durante el cultivo a largo plazo de las rebanadas de cerebro en un sistema cerrado

El objetivo general de este método de tubo de rodillo modificado para el cultivo de cortes de cerebro es proporcionar un sistema de cultivo cerrado para la supervivencia a largo plazo de los cortes. con la capacidad de obtener imágenes repetitivas de fluorescencia de alta resolución. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el desarrollo neuronal y los trastornos neurodegenerativos que requieren observaciones de las mismas neuronas a lo largo del tiempo, como la localización de proteínas clave involucradas en la formación o pérdida de sinapsis.

Las principales ventajas de esta técnica son el sistema de cultivo completamente cerrado que permite el uso seguro de los virus para la expresión de proteínas y el uso de cubreobjetos fotograbados para localizar las mismas células para la obtención de imágenes. Tuvimos la idea de este método por primera vez cuando estábamos cultivando rodajas en cubreobjetos dentro de tubos de rodillos, pero necesitábamos una mejor manera de visualizar los cambios que se producían en las rodajas vivas a lo largo del tiempo. El uso generalizado de vectores virales para expresar transgenes y poblaciones celulares específicas para la obtención de imágenes al microscopio nos llevó a desarrollar un sistema cerrado para proteger a los usuarios y eliminar la contaminación de los objetivos del microscopio.

La capacidad de seguir la población idéntica de células dentro de los cortes de cerebro a lo largo del tiempo permite estudios sobre el desarrollo de cambios patológicos y la alteración de la sinapsis en modelos de roedores de trastornos neurológicos humanos. Para comenzar, prepare el bastidor de tubos de rodillos y haga una plantilla para ayudar a perforar un agujero en los tubos de rodillos como se describe en el protocolo de texto adjunto. Con la plantilla, sostenga en su posición un tubo de cultivo de plástico de un centímetro de lado plano, de modo que el lado plano quede hacia arriba.

Luego perfore un orificio de seis milímetros de diámetro con el centro a un centímetro de la parte inferior y centrado entre los lados del tubo. Con la herramienta de desbarbado giratoria, alise los bordes del orificio y haga cuatro ranuras en el borde interior del orificio para facilitar el drenaje del orificio durante la rotación. A continuación, enjuague los tubos con etanol al 70% y luego séquelos al aire en una cabina de seguridad biológica.

Esterilice los tubos en unos discos de caucho de silicona adhesivos perforados de 12 milímetros durante 40 minutos bajo la lámpara UV. Después de 20 minutos, vuelva a colocar los tubos y discos de modo que todas las superficies expuestas estén esterilizadas. A continuación, retire el soporte blanco del disco adhesivo, alinee los agujeros y fije el caucho de silicona en el exterior del tubo.

Una vez que se hayan obtenido las lonchas, coloque dos microlitros de plasma de pollo en el centro del lado fotograbado de un cubreobjetos preparado. Extienda ligeramente el plasma para lograr un punto de tres a cuatro mililitros de diámetro. Luego, use una espátula estéril de punta estrecha para levantar un trozo de cerebro preparado.

Use pinzas cerradas para mantener la rebanada en la punta de la espátula mientras levanta la rebanada. Toque la espátula con el punto de plasma en el cubreobjetos y, con pinzas cerradas, empuje la rebanada sobre el cubreobjetos. Agregue una capa delgada de plasma de pollito en el cubreobjetos antes de colocar la rebanada y una cantidad mínima de plasma tratado con trombina para cubrir la rebanada.

Si la rebanada flota, no permanecerá adherida cuando se elimine la nube. A continuación, mezcle 2,5 microlitros de plasma y 2,5 microlitros de trombina en un tubo separado. Coloque rápidamente 2,5 microlitros de esta mezcla sobre y alrededor de la rebanada y pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclarla.

Retire la cubierta de plástico transparente del lado expuesto del adhesivo de caucho de silicona previamente adherido al tubo del rodillo. A continuación, coloque el cubreobjetos con la rodaja de cerebro sobre el adhesivo alineando la rodaja dentro del agujero. Para asegurar la adherencia, aplique una presión suave y uniforme sobre el cubreobjetos con el pulgar, presionando el cubreobjetos hacia abajo de manera uniforme y sosteniéndolo durante aproximadamente un minuto mientras lo transfiere al gabinete de seguridad biológica.

La presión sobre el cubreobjetos para adherirlo al tubo sin fugas debe ser la correcta y mantenerse durante el tiempo suficiente para eliminar los canales de aire en el saliente. Demasiada presión agrietará el cubreobjetos. En una cabina de seguridad biológica, agregue 0,8 mililitros de medio de cultivo neurobasal completo a cada tubo.

A continuación, fluya una mezcla de 5 % de dióxido de carbono y 95 % de aire a través de una pipeta Pasteur estéril de algodón taponada sujeta de forma segura por una abrazadera. Utilícelo para enjuagar el tubo del rodillo con la mezcla de gases y tapar rápidamente el tubo a medida que se retira de alrededor de la pipeta. A continuación, etiquete los tubos con el número de rebanada y el número de rejilla.

Inserte los tubos en una rejilla de rodillos; asegurándose de que estén geométricamente equilibrados. Si hay un número impar de tubos, agregue tubos en blanco para equilibrar. Coloque los estantes en una incubadora de rodillos de 35 grados centígrados, con rodillos girando el estante de rodillos de 10 a 13 revoluciones por hora.

Incline la incubadora hacia atrás aproximadamente 5 grados levantando su frente sobre una tabla. Transfiera un tubo con un cultivo en rodajas a un soporte de tubo hecho a medida como el que se muestra aquí. A continuación, coloque el soporte del tubo en el adaptador de la platina para mantener el cubreobjetos perpendicular al objetivo durante la toma de imágenes.

A continuación, empuje el deslizador del adaptador de etapa contra el tubo para mantenerlo en posición. Usando un objetivo de cuatro veces bajo transiluminación de campo claro, concéntrese en el período de cuadrícula fotograbado debajo de la rebanada. Para la sesión inicial de imágenes, escanee rápidamente alrededor del corte para localizar y registrar el número de las diversas regiones en las que se desea obtener imágenes de mayor aumento.

Una vez identificadas las regiones de interés, mueva el escenario al primer cuadrado de la cuadrícula que contenga una región de interés. A continuación, cambie al objetivo de error de 20 fuerzas y localice una marca de referencia. A continuación, cambie a un objetivo de mayor potencia, localice la misma marca de referencia y registre la posición x e y de la etapa.

Mueva el escenario para encontrar los otros campos de interés cercanos y registre sus desplazamientos x e y desde la marca de referencia. Las posiciones de desplazamiento permiten una localización precisa coherente de la misma ubicación del cubreobjetos cuando se toma una imagen del corte, aunque el ajuste original de x, y de la marca de referencia cambia cuando se retira y se reemplaza el tubo o el adaptador de etapa. Capture una imagen con un Z-stick dentro de cada campo seleccionado utilizando el control de objetivo del microscopio o un control de etapa piezoeléctrica, si hay uno disponible.

Usando un tinte vital neuronal, la pila confocal de imágenes que se muestra aquí, destaca la arquitectura 3D tanto de las neuritas como del cuerpo celular, pero la tinción se excluye del núcleo. Para examinar los cambios dependientes del tiempo en la morfología de las rebanadas de crecimiento y la viabilidad dentro de las rebanadas durante el cultivo a largo plazo, la misma rebanada se marcó con colorante vital neuronal fluorescente una vez por semana, 24 horas antes de la toma de imágenes. Para demostrar la reproducibilidad de la obtención de imágenes de las células idénticas a lo largo del tiempo, se obtuvieron imágenes del mismo campo de un corte marcado con tinte vital neuronal en el día 13 y en los días 14, 15, 16 y 17.

La posición de tres células en cada día se muestra mediante un símbolo sobre el núcleo. Además del tinte vital neuronal, las proteínas fluorescentes mediadas por virus se pueden utilizar con este sistema para etiquetar las células. En este caso, tanto un indicador sensible al calcio como los bacilos que contienen cofilina pueden identificarse claramente 10 días después de la infección.

La implementación exitosa de este procedimiento requiere la preparación previa de todos los tubos, cubreobjetos y soluciones. Ser capaz de obtener cortes en un corto intervalo post-mortem también es crucial para el éxito y requiere mucha práctica. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en unos 90 minutos para obtener de 12 a 18 cortes de hipocampo de una cría de ratón, incluidos los tiempos de disección y siembra.

Siguiendo este procedimiento, los cortes de cerebro se pueden infectar en varios momentos con virus para lograr la expresión específica del tipo de célula de proteínas marcadas con fluorescencia o silenciar la expresión génica con ARN interferente pequeño o ARN de horquilla corta para sondear la función del gen. No olvide que trabajar con virus recombinantes puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de protección ocular cuando se trabaja con estos reactivos.