Métodos alternativos In Vitro para la determinación de la integridad estructural de la cápside Viral

El objetivo general de estos métodos es obtener más información sobre los efectos de un tratamiento sobre la infectividad o la integridad de la cápside del norovirus humano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inactivación viral sin envoltura. Por ejemplo, lo que está sucediendo con la capacidad de la cápside viral para infectar una célula después de un tratamiento determinado.

La principal ventaja de estos métodos es que pueden proporcionar información mecanicista adicional sobre la acción de cualquier tratamiento sobre el virus. Aunque este método puede proporcionar información sobre las estrategias de inactivación del norovirus humano, también tiene potencial para aplicarse a otros virus sin envoltura, como el rinovirus o la hepatitis A.To comenzar, diluir la proteína principal de la cápside del norovirus humano, ensamblada en cápsidas a 50 microgramos por mililitro en solución salina tamponada con fosfato 1X. Utilice un volumen máximo de 15 microlitros en los tubos de PCR tapados individuales.

Asegúrese de que el tubo contenga al menos 600 nanogramos de cápside y que haya 600 nanogramos de cápside por combinación de ligando de tratamiento. A continuación, precaliente el termociclador hasta el tratamiento térmico deseado. Luego, precaliente un termociclador adicional a cuatro grados centígrados para un enfriamiento inmediato.

Agregue los tubos con solución de cápside al termociclador durante el tiempo deseado. Después del calentamiento, transfiera inmediatamente los tubos al ciclador preenfriado de cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Gire brevemente los tubos en la centrífuga para que todas las gotas lleguen al fondo del tubo.

Diluya las soluciones de cápside tratadas y PBS a tres microgramos por mililitro. Asegúrese de que haya al menos 200 microlitros de cápside tratada diluida. A continuación, aplique 100 microlitros de solución de cápside a cada pocillo para asegurarse de que haya al menos dos pocillos por tratamiento.

Además, incluye dos pocillos de control con 100 microlitros de PBS para cada ligando. Esto proporciona la absorbancia de fondo del ensayo. Cubra la placa con una tapa y selle los bordes con una película de parafina para reducir la evaporación.

Deje la placa durante la noche en una incubadora agitadora a cuatro grados centígrados o durante dos horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire las soluciones de cápside tratadas de la placa. Luego, agregue 200 microlitros por pocillo de tampón de bloqueo.

Incubar durante dos horas a temperatura ambiente o sellar a cuatro grados centígrados durante la noche. Mientras tanto, diluya el aptámero biotinilado a un micromolar en agua libre de nucleasas. Asegúrese de que haya suficiente solución para 200 microlitros en total para cada tratamiento.

Además, diluya el HPGA biotinilado elegido a 30 microlitros por mililitro en el tampón de bloqueo. Nuevamente, asegúrese de que haya suficiente solución para un volumen total de 200 microlitros para cada tratamiento. Después de la incubación, retire el tampón de bloqueo y lave la placa tres veces con 200 microlitros por pocillo de PBST.

Golpee el plato boca abajo sobre toallas de papel estériles para secar la humedad residual. A continuación, a 100 microlitros por pocillo de las soluciones de unión al ligando, asegurándose de que haya dos pocillos por combinación de ligando de tratamiento térmico, incube la placa cubierta en un agitador orbital a unas 60 RPM durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar los pocillos como se describe en el protocolo de texto, agregue 100 microlitros por pocillo de 0,2 microgramos por mililitro de estreptavidina, rábano picante, peroxidasa y PBS.

Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente agitando suavemente en un agitador orbital antes de volver a lavar los pocillos. A continuación, después de otro lavado, añade 100 microlitros por pocillo de sustrato TMB y deja que el color se desarrolle durante cinco a 15 minutos. Observa los pozos en busca de color.

Asegúrese de revelar consistentemente durante el mismo tiempo entre placas replicadas y tenga en cuenta el rango de absorbancia del lector de placas utilizado. Detenga el desarrollo de la reacción con 100 microlitros por pocillo de ácido fosfórico molar. Lea inmediatamente la placa a 450 nanómetros.

Cree un nuevo procedimiento de operación estándar de tamaño en el software del instrumento DLS como se detalla en el protocolo de texto. A continuación, seleccione la flecha verde de ejecución dentro del software y asigne un nombre a la muestra. Diluya las partículas similares a virus tratadas térmicamente o VLP de uno a 10 en 1X PBS para obtener una concentración final de cinco microgramos por mililitro.

A continuación, filtre la muestra con un tamaño de poro de una micra para eliminar las partículas de polvo. El DLS es muy sensible al polvo, ya que las partículas grandes dispersan mucha más luz que las partículas pequeñas. Transfiera 50 microlitros de los VLP diluidos a una cubeta desechable de pequeño volumen.

Inserte la cubeta en la cámara de muestras del instrumento. Inicie la ejecución y utilice las pestañas de ajuste acumulativo del correlograma y consejos de expertos para evaluar la calidad de los datos. Durante la ejecución, compruebe que la dispersión poligonal del valor del índice sea inferior a 0,3, lo que representa una medición de calidad.

En la pestaña multivista, asegúrese de que el coeficiente de correlación sea constante y cercano, pero no más de uno, en un corto período de tiempo y disminuya bruscamente a cero en un momento posterior, característico del tamaño de partícula. Utilice la pestaña de consejos de expertos para obtener comentarios sobre la calidad de los datos durante las mediciones. Una vez completada la medición, vuelva a comprobar que la dispersión poligonal del valor del índice es inferior a 0,3.

Asegúrese de que la línea de ajuste del acumulado siga de cerca los puntos de datos en la pestaña de ajuste de los acumuladores. Cree un nuevo procedimiento de operación estándar de tamaño en el software del instrumento DLS como se detalla en el protocolo de texto. Seleccione la flecha de ejecución dentro del software para abrir y nombrar una nueva muestra y permitir que el instrumento alcance el equilibrio de temperatura.

Transfiera la suspensión VLP a una cubeta de cuarzo de pequeño volumen, evite las burbujas y pipetee lentamente contra la pared de la cubeta. Una vez que el instrumento haya alcanzado el equilibrio de temperatura, inserte la cubeta en la cámara de muestras. Después de esperar 10 segundos para que la temperatura de la muestra se equilibre, inicie la ejecución y simultáneamente inicie un temporizador.

Detenga el temporizador al final de la primera medición. Toma este tiempo como el primer punto de tiempo. Obtenga puntos de tiempo posteriores a partir de los tiempos de medición registrados por el software.

Realice el tratamiento térmico como antes, excepto que sustituya el PBS por montones de 10 milimolares, pH 7,4 y no diluya más las cápsidas después del tratamiento. A continuación, pipetee toda la gota de 15 microlitros de la solución de cápside tratada sobre una película de parafina. Agarre el borde de la rejilla con pinzas, permitiendo que se cierren en el borde para sostener la rejilla y coloque la rejilla con el lado de carbono hacia abajo encima de la gota de solución tratada.

Deje que la rejilla se incube durante 10 minutos para permitir que la cápside se adhiera a la rejilla. Dependiendo de la pureza de la preparación de la cápside, agregue lavados de la solución de pila en forma de gotas de 10 a 15 microlitros colocadas en línea después de la gota de cápside tratada. Después de 10 minutos, recoja la rejilla con la gota.

Coloque la rejilla casi perpendicular a un pedazo de papel de filtro para absorber la gota. Luego, use la rejilla para recoger la gota de tampón de 10 a 15 microlitros y manténgala durante 30 segundos. Después de 30 segundos de tiempo de lavado, absorba con otro trozo de papel de filtro.

A continuación, coloque una gota de 15 microlitros de solución de acetato de uranilo al dos por ciento sobre la película de parafina en un área vacía. Recoja la gota de acetato de uranilo con la rejilla y manténgala presionada durante 45 segundos. Luego, absorbe el acetato de uranilo asegurándote de eliminar la mayor parte de la solución.

Coloque la rejilla con el lado carbón hacia arriba sobre un trozo de papel de filtro, teniendo cuidado de que la rejilla no se pegue a la humedad de las pinzas. Luego, coloque el papel de filtro con la rejilla en una placa de Petri de vidrio abierta. Después de repetir este proceso para todos los tratamientos, coloque las mitades de la placa de Petri con las rejillas en un desecador durante la noche para que se sequen antes de observar con TEM.

El siguiente gráfico muestra la reducción de la capacidad de unión de las cápsidas de norovirus humanos a lo largo del tiempo cuando se tratan a 68 grados centígrados. Como se puede ver, la unión de HPGA es la primera señal que desaparece por completo. En este punto, se supone que la gran mayoría de las cápsidas en la solución han perdido la capacidad de unirse a los HPGA de la célula huésped y, por lo tanto, no pueden internalizarse en la célula.

La unión de aptámeros es similar a la del HBGA, aunque se requiere un poco más de tratamiento térmico para eliminar la señal. Aquí se muestra una curva de coeficiente de correlación DLS representativa de datos de buena calidad. En un tiempo cercano a cero, el correlograma es constante en un valor cercano a, pero inferior a uno.

A continuación, cae bruscamente a cero en un momento característico del tamaño de partícula. Es probable que se pueda confiar en los resultados de tamaño de este experimento. Por el contrario, esta curva de coeficiente de correlación es representativa de datos de mala calidad.

El correlograma comienza en un valor superior a uno y cae gradualmente a cero. Los resultados de este experimento no deben utilizarse. Aquí, los datos de tamaño de partícula muestran un perfil de agregación claro para las cápsidas tratadas a 68 grados centígrados con superagregados que se forman después de unos 20 minutos.

El momento en el que se produce la superagregación es característico de la susceptibilidad de las VLP a ese tratamiento. Esta figura visualiza los resultados de TEM para el tratamiento térmico de cápsidas de norovirus humanos. Aquí, las cápsidas se trataban a una temperatura de 60 a 80 grados centígrados de izquierda a derecha.

Como se puede observar, la morfología de la cápside cambia claramente con el tratamiento a medida que las cápsidas se agregan y desnaturalizan. Un fenómeno similar se observa para las cápsidas tratadas a 68 grados centígrados durante cero a 25 minutos. Una vez dominadas, estas técnicas se pueden realizar en una a 24 horas si se realizan correctamente.

Después de su desarrollo, esta técnica proporcionó una vía adicional para que los investigadores en el campo de la virología de los alimentos exploraran los mecanismos y efectos de la inactivación en la cápside de los norovirus humanos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como una RT-PCR en tiempo real con y sin pretratamiento con ARNasa, la página STS de cápsidas virales y ensayos de placa con virus sustitutos cultivables para obtener una visión general más completa de la reducción viral después de un tratamiento determinado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la unión de ligandos, la dispersión dinámica de luz y la microscopía electrónica de transmisión para obtener más información mecanicista sobre los efectos del tratamiento de inactivación en la cápside del norovirus humano.

No olvide que trabajar con algunos de los reactivos utilizados puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección personal y seguir las mejores prácticas de seguridad en el laboratorio al realizar este procedimiento.