Métodos alternativos In Vitro para la determinación de la integridad estructural de la cápside Viral

El objetivo general de estos métodos es obtener una mayor comprensión de los efectos del tratamiento sobre la infectividad o integridad del capsido del norovirus humano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inactivación viral de virus no envueltos, como por ejemplo qué sucede con la capacidad del capsido viral para infectar una célula después de un tratamiento determinado.

La principal ventaja de estos métodos es que pueden proporcionar una mayor comprensión mecanicista sobre la acción de cualquier tratamiento dado sobre el virus. Aunque este método puede ofrecer información sobre estrategias de inactivación del norovirus humano, también tiene el potencial de aplicarse a otros virus no envueltos, como el rinovirus o la hepatitis A.

Para comenzar, diluya la proteína principal de la cápside del norovirus humano purificada, ensamblada en cápsidas, hasta 50 microgramos por mililitro en solución salina tamponada con fosfato 1X. Utilice un volumen máximo de 15 microlitros en los tubos individuales de PCR con tapa.

Asegúrese de que el tubo contenga al menos 600 nanogramos de cápside y de que haya 600 nanogramos de cápside por combinación de ligando de tratamiento. A continuación, precaliente el termociclador al tratamiento térmico deseado. Luego, precaliente un termociclador adicional a cuatro grados Celsius para enfriamiento inmediato.

Agregue los tubos con la solución de cápside al termociclador durante el tiempo deseado. Después del calentamiento, transfiera inmediatamente los tubos al termociclador preenfriado a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Centrifugue brevemente los tubos para reunir todas las gotas en la parte inferior del tubo.

Diluya las soluciones de cápside tratadas y el PBS a tres microgramos por mililitro. Asegúrese de que haya al menos 200 microlitros de cápside tratada diluida. A continuación, aplique 100 microlitros de la solución de cápside a cada pocillo, asegurándose de que haya al menos dos pocillos por tratamiento. Además, incluya dos pocillos de control con 100 microlitros de PBS para cada ligando. Esto proporciona la absorbancia de fondo del ensayo. Cubra la placa con una tapa y selle los bordes con película de parafina para reducir la evaporación. Deje la placa durante la noche en un incubador agitador a cuatro grados Celsius o durante dos horas a temperatura ambiente.

Tras la incubación, retire las soluciones de cápside tratadas de la placa. Luego, agregue 200 microlitros por pocillo de tampón de bloqueo. Incube durante dos horas a temperatura ambiente o bien, sellado, durante la noche a cuatro grados Celsius.

Mientras tanto, diluya el aptámero biotinilado hasta una concentración de un micromolar en agua libre de nucleasas. Asegúrese de que haya suficiente solución para un volumen total de 200 microlitros por cada tratamiento.

Además, diluya la HPGA biotinilada elegida a 30 microlitros por mililitro en el tampón de bloqueo. Nuevamente, asegúrese de que haya suficiente solución para un volumen total de 200 microlitros por cada tratamiento.

Tras la incubación, retire el tampón de bloqueo y lave la placa tres veces con 200 microlitros por pozo de PBST. Seque la humedad residual golpeando suavemente la placa boca abajo sobre toallas de papel estériles. A continuación, añada 100 microlitros por pozo de las soluciones de unión del ligando, asegurándose de que haya dos pozos por combinación de ligando y tratamiento térmico, e incube la placa cubierta en un agitador orbital a aproximadamente 60 RPM durante una hora a temperatura ambiente.

Después de lavar las placas según se describe en el protocolo escrito, añada 100 microlitros por pocillo de 0,2 microgramos por mililitro de estreptavidina peroxidasa de rábano picante en PBS.

Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación suave en un agitador orbital antes de lavar nuevamente las pocillos. Luego, tras otro lavado, añadir 100 microlitros por pocillo de sustrato TMB y permitir que el color se desarrolle durante cinco a 15 minutos. Observar los pocillos para detectar la formación de color.

Asegúrese de desarrollar durante el mismo tiempo de forma constante entre placas replicadas y tenga en cuenta el rango de absorbancia del lector de placas utilizado. Detenga el desarrollo de la reacción con 100 microlitros por pocillo de ácido fosfórico uno molar. Lea inmediatamente la placa a 450 nanómetros.

Cree un nuevo procedimiento operativo estándar de tamaño en el software del instrumento DLS según se detalla en el protocolo de texto. Luego, seleccione la flecha de ejecución verde dentro del software y asigne un nombre a la muestra.

Diluya las partículas similares a virus o VLP de uno a diez en PBS 1X para obtener una concentración final de cinco microgramos por mililitro. Luego, filtre la muestra con un filtro de un micrón de tamaño de poro para eliminar las partículas de polvo. La DLS es muy sensible al polvo, ya que las partículas grandes dispersan mucha más luz que las partículas pequeñas. Transfiera 50 microlitros de las VLP diluidas a una cubeta desechable de pequeño volumen. Introduzca la cubeta en la cámara de muestra del instrumento. Inicie la corrida y utilice las pestañas de ajuste del cumulante del correlograma y consejos del experto para evaluar la calidad de los datos. Durante la corrida, verifique que el valor del índice de polidispersidad sea menor a 0,3, lo que representa una medición de calidad.

En la pestaña Multivista, asegúrese de que el coeficiente de correlación sea constante y cercano, pero no superior a uno, en un tiempo corto, y que disminuya bruscamente hasta cero en un tiempo posterior, característico del tamaño de partícula. Utilice la pestaña de consejos expertos para obtener retroalimentación sobre la calidad de los datos durante las mediciones. Una vez finalizada la medición, verifique nuevamente que el valor del índice de politispersión sea inferior a 0,3.

Asegúrese de que la línea de ajuste de cumulantes siga de cerca los puntos de datos en la pestaña de ajuste de cumulantes. Cree un nuevo procedimiento operativo estándar de tamaño en el software del instrumento de DLS según se detalla en el protocolo escrito. Seleccione la flecha de ejecución dentro del software para abrir y nombrar una nueva muestra y permita que el instrumento alcance el equilibrio térmico.

Transfiera la suspensión de partículas virales pseudotipadas (VLP) a una cubeta de cuarzo de pequeño volumen, evitando burbujas y pipeteando lentamente contra la pared de la cubeta. Una vez que el instrumento haya alcanzado el equilibrio térmico, inserte la cubeta en la cámara de muestra. Después de esperar 10 segundos para que la temperatura de la muestra se equilibre, inicie el análisis y simultáneamente active un cronómetro.

Detenga el temporizador al final de la primera medición. Tome este tiempo como el primer punto temporal. Obtenga los puntos temporales subsiguientes a partir de los tiempos de medición registrados por el software.

Realice el tratamiento térmico como antes, pero sustituya el PBS por HEPES 10 milimolar, pH 7,4 y no diluya más los capsidos después del tratamiento. A continuación, pipete toda la gota de 15 microlitros de la solución de capsidos tratada sobre una película de parafina. Tome el borde de la rejilla con pinzas, permitiendo que estas se cierren sobre el borde para sostener la rejilla, y coloque la rejilla con el lado de carbono hacia abajo encima de la gota de la solución tratada.

Deje que la rejilla incube durante 10 minutos para permitir que la cápside se adhiera a la rejilla. Dependiendo de la pureza de la preparación de la cápside, agregue lavados de la solución de HEPES en forma de gotas de 10 a 15 microlitros colocadas en línea después de la gota de cápside tratada. Después de 10 minutos, recoja la rejilla con la gota.

Coloque la rejilla casi perpendicularmente sobre un trozo de papel de filtro para absorber la gota. Luego, utilice la rejilla para recoger la gota de 10 a 15 microlitros de tampón HEPES y manténgala durante 30 segundos. Después de 30 segundos de tiempo de lavado, absorba con otro trozo de papel de filtro.

A continuación, coloque una gota de 15 microlitros de una solución al dos por ciento de acetato de uranilo sobre la película de parafina en un área vacía. Tome la gota de acetato de uranilo con la rejilla y déjela actuar durante 45 segundos. Luego, retire mediante absorción el acetato de uranilo asegurándose de eliminar la mayor parte de la solución.

Coloque la rejilla con el lado de carbono hacia arriba sobre un trozo de papel de filtro, teniendo cuidado de que la rejilla no se adhiera a la humedad de las pinzas. Luego, coloque el papel de filtro con la rejilla encima en una placa de Petri de vidrio abierta. Después de repetir este proceso para todos los tratamientos, coloque las mitades de las placas de Petri con las rejillas en un desecador durante la noche para secarlas antes de observarlas con el MET.

El siguiente gráfico muestra la reducción de la capacidad de unión de las cápsidas del norovirus humano a lo largo del tiempo cuando se tratan a 68 grados Celsius. Como puede observarse, la unión a HPGA es la primera señal en desaparecer por completo. En este punto, se asume que la gran mayoría de las cápsidas en la solución han perdido la capacidad de unirse a las HPGA de la célula huésped y, por lo tanto, no pueden ser internalizadas en la célula.

La unión del aptámero es similar a la de HBGA, aunque se requiere un tratamiento térmico ligeramente más intenso para eliminar la señal. Aquí se muestra una curva del coeficiente de correlación de DLS representativa de datos de buena calidad. En un tiempo cercano a cero, el correlograma es constante en un valor cercano, pero inferior a uno.

Luego disminuye bruscamente a cero en un tiempo característico del tamaño de la partícula. Los resultados de tamaño obtenidos en este experimento probablemente sean confiables. Por el contrario, esta curva del coeficiente de correlación es representativa de datos de baja calidad.

El correlograma comienza en un valor superior a uno y disminuye gradualmente hasta cero. Los resultados de este experimento no deben utilizarse. Aquí, los datos de tamaño de partículas muestran un perfil de agregación claro para las cápsidas tratadas a 68 grados Celsius, con la formación de súper agregados después de aproximadamente 20 minutos.

El momento en que ocurre la súper agregación es característico de la susceptibilidad de las partículas similares a virus (VLP) a ese tratamiento. Esta figura muestra los resultados de microscopía electrónica de transmisión (TEM) para el tratamiento térmico de cápsidas del norovirus humano. Aquí, las cápsidas fueron tratadas a temperaturas de 60 a 80 grados Celsius de izquierda a derecha.

Como puede observarse, la morfología de la cápside cambia claramente con el tratamiento, ya que las cápsides se agregan y desnaturalizan. Se observa un fenómeno similar en las cápsides tratadas a 68 grados Celsius durante cero a 25 minutos.

Una vez dominadas, estas técnicas pueden realizarse en un período de una a 24 horas si se llevan a cabo correctamente.

Tras su desarrollo, esta técnica proporcionó una vía adicional para que los investigadores en el campo de la virología de los alimentos exploraran los mecanismos y efectos de la inactivación sobre la cápside de los norovirus humanos. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como una RT-PCR en tiempo real con y sin pretratamiento con RNasa, electroforesis SDS-PAGE de cápsides virales y ensayos de placas con virus sustitutos cultivables, para obtener una visión más completa del grado de reducción viral tras un tratamiento determinado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la unión de ligandos, la dispersión dinámica de la luz y la microscopía electrónica de transmisión para obtener información mecanicista adicional sobre los efectos del tratamiento de inactivación en la cápside del norovirus humano.

No olvide que trabajar con algunos de los reactivos utilizados puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar equipo de protección personal y seguir las mejores prácticas de seguridad en el laboratorio, mientras se realiza este procedimiento.