Evaluar In Vitro el daño de ADN utilizando el ensayo cometa

El objetivo general de este experimento es investigar la eficacia de los agentes genotóxicos en las células cancerosas utilizando un ensayo de electroforesis de una sola célula, que también se denomina ensayo cometa. Este procedimiento es un sentido para medir los cuatro estudios toxicológicos genéticos. Y es aplicable a diferentes evaluaciones, como la selección temprana de candidatos a fármacos y la investigación fundamental sobre el daño y la reparación del ADN.

Esta técnica proporciona una forma directa de evaluar cuantitativamente el daño en el ADN. Y es eficiente, fácil de realizar y relativamente económico. Prepare la agarosa para el recubrimiento deslizante derritiendo un uno por ciento de agarosa en un microondas durante dos o tres minutos o hasta que la agarosa esté completamente derretida.

Sumerja un portaobjetos de microscopio de vidrio en la agarosa y use una toallita sin pelusa para limpiar un lado del portaobjetos. Coloque el portaobjetos sobre una superficie plana para que se seque al aire. Se debe formar una película de agarosa transparente después del secado.

Coloque los portaobjetos recubiertos a 37 grados centígrados antes de usarlos. Se evalúa el efecto terapéutico de la quimioterapia en células de glioma U251 cultivadas en medio DMEM/Ham F-12 suplementado con FBS al 10%, 100 unidades por mililitro de penicilina y 10 microgramos por mililitro de estreptomicina. Digiera las células usando un mililitro de tripsina durante tres minutos, y luego neutralice la tripsina usando medio DMEM/Ham F-12 con FBS.

Recoge las células en un tubo de 15 mililitros. Y girar a 300 veces G durante cuatro minutos. Aspira el medio.

Y suspender las celdas a dos veces 10 a la quinta celdas por mililitro en 1x PBS. Las células deben prepararse inmediatamente antes de comenzar el ensayo. Y el debe ser manejado en la oscuridad.

Todo con luz tenue para evitar daños. Combine la suspensión celular con un uno por ciento de agarosa fundida y de bajo punto de fusión en una proporción de volumen de uno a 10. Mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Y pipetee inmediatamente 30 microlitros en un portaobjetos. Utilice el deslizamiento de la punta de la pipeta para esparcir la mezcla de agarosa y asegurar la formación de una capa fina. Coloque los portaobjetos a cuatro grados centígrados, en la oscuridad, durante 10 minutos.

Sumerja los portaobjetos en una solución de lisis de cuatro grados centígrados, en la oscuridad durante una hora o toda la noche. Para el ensayo del cometa alcalino, retire suavemente los portaobjetos de la solución de lisis, drene el exceso de líquido y sumerja suavemente los portaobjetos en AES, en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante una hora para permitir que el ADN se desenrolle. Agregue AES preenfriado en la bandeja de portaobjetos de electroforesis.

No exceda los 0,5 centímetros por encima de los portaobjetos. Coloque los portaobjetos dentro y cúbralos con una tapa. Ajuste el voltaje de la fuente de alimentación a un voltio por centímetro y funcione a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.

Una vez finalizada la electroforesis, drene el exceso de AES de los portaobjetos. Sumerja suavemente los portaobjetos dos veces en agua destilada a temperatura ambiente durante cinco minutos cada vez. Después de eso, sumerja suavemente los portaobjetos en etanol al 70% a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Para el ensayo del cometa neutro, retire suavemente los portaobjetos de la solución de lisis, drene el exceso de líquido y sumérjalo suavemente en NES en la oscuridad, a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Agregue NES preenfriado en la bandeja de portaobjetos de electroforesis, sin exceder los 0,5 centímetros por encima de los portaobjetos. Coloque los portaobjetos dentro y cúbralos con una tapa.

Ajuste el voltaje de la fuente de alimentación a un voltio por centímetro y funcione a cuatro grados centígrados durante 45 minutos. Drene el exceso de tampón de los portaobjetos. Sumerja suavemente los portaobjetos en una solución de precipitación de ADN a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, sumerja suavemente los portaobjetos en etanol al 70% a temperatura ambiente durante 30 minutos. Comience este procedimiento secando los portaobjetos en la oscuridad a 37 grados centígrados durante 10-15 minutos. A continuación, coloque 50-100 microlitros de solución de tinción de ácido nucleico fluorescente verde sobre la agarosa seca de cada portaobjetos y tiña durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

Enjuague los portaobjetos brevemente con agua destilada y séquelos completamente a 37 grados centígrados en la oscuridad. Realice la adquisición y el análisis de imágenes inmediatamente después de teñir los portaobjetos del cometa. Coloque un portaobjetos debajo de un microscopio fluorescente con un soporte para portaobjetos.

Seleccione la lente del objetivo 10X y asegúrese de que el gel de agarosa esté orientado hacia la lente del objetivo. Captura imágenes aleatorias de cada diapositiva de cometa manchada. Evite los bordes y las áreas alrededor de las burbujas de aire.

Asegúrese de que cada cola del cometa esté distribuida horizontalmente. Las cabezas de los cometas deben originarse desde la izquierda y la cola desde la derecha. Guarde cada imagen en un formato binario con una mancha de ADN brillante y un fondo oscuro.

Para el análisis de imágenes, primero cargue todas las imágenes en el software de ensayo del cometa, utilizando el botón Seleccionar archivos para analizar, que se encuentra a la izquierda de la barra de herramientas. Debería aparecer una ventana de vista de imagen. Dibuje un marco de medición en la pantalla y ajuste su tamaño de acuerdo con el cometa de la celda.

Haga clic en ajustar para configurar el umbral de la cabeza, el cometa y la cola, de acuerdo con la imagen. Y luego haga clic en Iniciar mediciones. Seleccione una celda usando el marco y active la medición haciendo clic en el botón Ensayar el cometa.

Aparecerá una imagen de intensidad en la ventana de perfiles, con los parámetros de medición seleccionados. Guarde los resultados haciendo clic en el botón Almacenar resultados. Analice al menos 50 células por tratamiento.

Los resultados de los ensayos de cometas alcalinos y neutros muestran que las colas de los cometas de las células UT51 tratadas con doxorrubicina eran más largas y tenían una mayor intensidad de ADN, lo que sugiere una acumulación sustancial de ADN fragmentado. El análisis cuantitativo para el ensayo del cometa alcalino o neutro mostró un aumento significativo en la formación de la cola del cometa, después de los tratamientos con doxorrubicina, lo que indica daño en el ADN. Un tratamiento combinado de un inhibidor de PARP, olaporib, y un agente alquilante, temozolomida, mejoró significativamente el daño del ADN en las células de glioma, reflejado por el aumento de la longitud e intensidad de la señal de la cola del cometa.

El olaporib por sí solo no introdujo daño en el ADN. Mientras que potenció el efecto genotóxico de la temozolomida. Las imágenes representativas de las células de glioma bajo tratamientos simples y combinados, mostraron las colas de cometa más largas y de mayor intensidad de las células tratadas con temozolomida y olaporib.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas, si se realiza correctamente. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la genotoxicidad midieran las roturas de cuerdas de ADN en muchos tipos de células ucariotas. Tales como células cultivadas o células aisladas de organismos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el ensayo del cometa para investigar la efectividad de un agente genotóxico a nivel de una sola célula. No olvide que trabajar con el reactivo de daño puede ser extremadamente peligroso. Y las precauciones, como el uso de una bata de laboratorio y guantes, siempre deben tomarse mientras se realiza este procedimiento.