CometChip: Un gran procesamiento Plataforma 96-Bueno, para medir el daño del ADN en las células en micromatriz Humanos

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo utilizar el chip COMET para realizar mediciones de alto rendimiento del daño al ADN en células de mamífero. Esto se logra primero cargando células de mamífero en el chip COMET. El segundo paso consiste en tratar las células con sustancias químicas que se sabe causan daño al ADN.

A continuación, las células se lisan y se someten a Electro East utilizando protocolos tradicionales del ensayo COMET. El paso final consiste en la obtención de imágenes mediante fluorescencia del ADN celular para visualizar la migración del ADN dañado. Finalmente, se utiliza un software de análisis de imágenes para cuantificar el grado de daño en el ADN.

Por lo tanto, el ensayo COMET lleva mucho tiempo en uso y es un ensayo muy útil para analizar muchos tipos diferentes de daño en el ADN. Pero el problema ha sido que tiene un rendimiento muy bajo y carece de sensibilidad. Por ello, creamos la COMET chip, que básicamente es una versión de alto rendimiento del ensayo COMET, lo que permite realizar cribados de alto rendimiento, por ejemplo para la selección de fármacos, así como para estudios epidemiológicos.

Jing GA, estudiante de posgrado en mi laboratorio, demostrará el procedimiento. El chip coma es un gel con una matriz de micropozos producida a partir de un sello microfabricado con micropestañas cuyos diámetros son tan pequeños como el de una sola célula; colóquese el chip en una placa rectangular de un pozo con la película gel bond en posición invertida. Después de lavar el gel dos veces con 25 mililitros de PBS 1X, colóquese el chip coma sobre una placa de vidrio y luego etiquétese la orientación del gel de forma correspondiente.

Ahora presione suavemente una placa de 96 pocillos invertida y sin fondo en el gel, asegurándose de que los 96 pocillos queden dentro del área del gel. Luego sujete ambos lados de la placa de 96 pocillos a la placa de vidrio con clips sujetadores de 1,5 pulgadas. Por último, aspire cualquier exceso de PBS de cada uno.

Recolecte células en suspensión o adherentes según procedimientos estándar y diluya las células con medio hasta una concentración final de 100.000 a 1 millón de células por mililitro. Asegúrese de obtener una suspensión de células individuales pasando por un filtro celular si es necesario. Pipetee 100 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo, la placa de 96 pocillos tipo comet chip cuando termine.

Cubra la placa con la película adhesiva para prevenir la evaporación y luego colóquela en un incubador ajustado a 37 grados Celsius durante 30 minutos tras retirar la placa del incubador. Cuando hayan transcurrido los 30 minutos, aspire el medio de cada pocillo, luego retire las pinzas de sujeción y la placa de 96 pocillos sin fondo. Sostenga el chip de cometa con la placa de vidrio en un ángulo e enjuague suavemente con un XPBS para eliminar cualquier exceso de células sobre los aros. Ahora observe la placa a través de un objetivo de cuatro x en un microscopio de campo claro para verificar la carga óptima de células. Una vez que se haya cargado un número suficiente de células, coloque un chip de cometa sobre una superficie plana y cúbralo con agarosa al 1 % de punto de fusión baja que haya sido previamente calentada a 37 grados Celsius.

Deje que la capa superior se solidifique a temperatura ambiente durante tres minutos y luego colóquela a cuatro grados Celsius durante cinco minutos para finalizar completamente la dosificación de las células con los productos químicos de interés. Primero, alinee cuidadosamente los pocillos del chip de cometa con los pocillos de una nueva placa de 96 pocillos sin fondo y presione hacia abajo. Sujete la placa de 96 pocillos a la placa de vidrio con clips sujetapapeles como antes.

Luego, coloque la placa sobre hielo y agregue 100 microlitros del compuesto de interés a la dosis deseada a cada pocillo. Deje que el compuesto bajo estudio permanezca sobre las células durante el período de tiempo deseado tras la administración; luego aspire la solución del compuesto de cada pocillo y enjuague con un XPBS si es necesario. Corte el gel en piezas separadas. A continuación, para estudiar la cinética de reparación, agregue medio de cultivo a los pocillos, incube y proceda a la lisis celular en puntos de tiempo específicos para lisar células destinadas al ensayo de cometa alcalino.

Prepare aproximadamente 25 mililitros de tampón de lisis alcalina de trabajo para cada chip añadiendo Triton X-100 al 1% a la solución stock de lisis alcalina. Luego enfríe previamente a cuatro grados Celsius. Vierta el tampón de lisis alcalina en un recipiente ligeramente más grande que el chip de cometa.

Luego, sumerja el chip alcalino en el tampón de lisis alcalina frío, colóquelo en el refrigerador y permita que la lisis proceda durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, retire el chip de cometa del tampón de lisis y enjuáguelo rápidamente con un X PBS. A continuación, coloque el chip en una cámara de electroforesis con la cara del filme de gel hacia abajo y sujételo con cinta adhesiva de doble cara.

Lleve la cámara a la sala fría de cuatro grados Celsius y llene la cámara con tampón de electroforesis alcalino frío hasta un nivel que cubra apenas el gel. Luego, deje el chip a cuatro grados Celsius durante 40 minutos para permitir el desenrollado alcalino. Finalmente, corra el gel a un voltio por centímetro y 300 miliamperios durante 30 minutos.

En la sala fría, ajuste el volumen del tampón de electroforesis en la cámara para alcanzar la corriente de funcionamiento deseada. Para el ensayo de cometa neutro, prepare el tampón de lisis neutro de trabajo añadiendo 1% Triton X-100 y 10% DMSO a la solución stock de lisis neutra. Nuevamente, prepare aproximadamente 25 mililitros de tampón de lisis de trabajo por cada chip.

Coloque el tampón de lisis neutro de trabajo en la incubadora ajustada a 43 grados Celsius para precalentarlo. Una vez que el tampón de lisis neutro esté caliente, sumerja el chip coma en el tampón de lisis neutro y colóquelo en una incubadora a 40 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, retire el tampón de lisis neutro y luego realice dos lavados con tampón de electroforesis neutro durante 15 minutos a cuatro grados Celsius cada vez. En cada ocasión, asegure el chip en la cámara de electroforesis y trasládela al cuarto frío.

Como antes, llene la cámara de electroforesis con tampón de electroforesis neutro frío hasta un nivel que cubra apenas el gel y deje que el gel repose en una cámara fría durante 60 minutos; luego, corra el gel a 0,6 voltios por centímetro y seis miliamperios durante 60 minutos en la cámara fría. Nuevamente, ajuste el volumen del tampón de electroforesis en la cámara para alcanzar la corriente deseada si es necesario. Después de retirar el chip de com de la cámara fría, neutralice los geles lavándolos con tampón de neutralización dos veces durante 15 minutos cada uno a cuatro grados Celsius.

Permanezca en el chip con un colorante de ADN fluorescente como Cybergold o bromuro de iridio. De acuerdo con las instrucciones del fabricante e imagen mediante microscopía fluorescente, se muestran en el panel superior de este diagrama cometas representativos de micropozos de linfoblastos TK6 no tratados. Aquellos provenientes de células TK6 expuestas a 50 micromolares de peróxido de hidrógeno en el panel central y a 100 micromolares de peróxido de hidrógeno en el panel inferior.

Todas las exposiciones duraron 20 minutos a cuatro grados Celsius. Este gráfico de líneas muestra la respuesta a la dosis de peróxido de hidrógeno de las células TK seis. Cada punto de datos es el promedio de tres experimentos independientes, en los que se obtuvo el porcentaje mediano de ADN de cola de al menos 50 cometas individuales en cada experimento.

Este gráfico muestra la variación entre muestras del ensayo de microchip de cometas para células TK6 expuestas a peróxido de hidrógeno; aquí se muestra el porcentaje de ADN en la cola de cada pocillo. Cada caja representa la mediana de al menos 50 cometas individuales de cada pocillo. La media de 12 pocillos es 77,53 %, la desviación estándar es 3,99 % y el coeficiente de variación es 5,2 %. Este gráfico muestra la variación entre experimentos.

La misma exposición al peróxido de hidrógeno se repitió seis veces, y los datos de cada repetición se muestran como una barra gris. Cada caja representa el porcentaje mediano de ADN de cola de al menos 100 cometas individuales de cada repetición. El promedio de las seis repeticiones es de 49,57 %, mostrado aquí como la barra negra.

La desviación estándar de seis repeticiones es del 4,99 % y la barra de error de la media es del 2,04 %, representada como la barra de aire en la figura. Al igual que en el ensayo común tradicional, los investigadores pueden realizar modificaciones a este procedimiento o utilizar otros métodos, como incluir enzimas purificadas específicas de lesiones, para responder preguntas adicionales sobre el tipo de daño al ADN producido en las células. La técnica de la matriz de cometas ha allanado el camino para estudios en células de mamíferos destinados a comprender el daño y la reparación del ADN.

Y debido a que tiene alta capacidad de procesamiento, hace posible realizar estudios clínicos y epidemiológicos que antes no eran posibles por la cantidad de muestras.