CometChip: Un gran procesamiento Plataforma 96-Bueno, para medir el daño del ADN en las células en micromatriz Humanos

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo utilizar el chip COMET para realizar mediciones de daño en el ADN de alto rendimiento en células de mamíferos. Esto se logra cargando primero células de mamíferos en el chip COMET. El segundo paso es tratar las células con sustancias químicas que se sabe que causan daños en el ADN.

A continuación, las células se lisan y se electro East utilizando los protocolos tradicionales de ensayo COMET. El paso final es la obtención de imágenes de fluorescencia del ADN celular para visualizar la migración del ADN dañado. En última instancia, el software de análisis de imágenes se utiliza para cuantificar el alcance del daño en el ADN.

Por lo tanto, el ensayo COM existe desde hace mucho tiempo y es un ensayo muy útil para observar muchos tipos diferentes de daño en el ADN. Pero el problema ha sido que tiene un rendimiento muy bajo y carece de sensibilidad. Así que creamos el chip COMET, que básicamente es una versión de muy alto rendimiento del ensayo COMET que permite realizar un cribado de alto rendimiento para el cribado de fármacos, por ejemplo, y para estudios epidemiológicos.

El estudiante graduado de Jing GA en mi laboratorio demostrará el procedimiento. El chip de coma es un gel con una matriz de micro pocillos producidos a partir de un sello micro fabricado con micro postes con diámetros que son tan pequeños como el de una sola celda para comenzar a colocarse en una película de unión de gel de placa rectangular de un pocillo hacia abajo. Después de lavar el gel dos veces en 25 mililitros en un XPBS, coloque el chip de coma en una placa de vidrio, luego etiquete la orientación del gel en consecuencia.

Ahora presione suavemente una placa de 96 pocillos sin fondo invertida en el gel, asegurándose de que todos los 96 pocillos estén dentro del área del gel. A continuación, sujete cada lado de la placa de 96 pocillos a la placa de vidrio con clips de carpeta de 1,5 pulgadas. Por último, aspire cualquier exceso de PBS de cada uno.

Coseche bien las células en suspensión o adherentes de acuerdo con los procedimientos estándar y diluya las células con medios hasta una concentración final de 100, 000 a 1 millón de células por mililitro. Asegúrese de que se obtenga una suspensión de una sola célula pasando a través de un filtro de célula si es necesario. Pipetee 100 microlitros de suspensión celular en cada pocillo, la placa de 96 pocillos del chip cometa cuando esté terminado.

Cubra la placa con la película de gel para evitar la evaporación y luego colóquela en una incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos después de retirar la placa de la incubadora. Cuando hayan transcurrido los 30 minutos, aspire los medios de cada pozo, luego retire los clips de carpeta y la placa de 96 pocillos sin fondo Sostenga el chip cometa con la placa de vidrio en ángulo y enjuague suavemente con un XPBS para eliminar cualquier exceso de celdas en la parte superior de los aros. Ahora vea la placa a través de una lente de objetivo de cuatro veces en un microscopio de campo claro para verificar la carga celular óptima Después de cargar suficientes celdas, coloque un chip com en una superficie uniforme, una superposición con agros de punto de fusión bajo del 1% que se haya precalentado a 37 grados Celsius.

Deje que la capa se solidifique a temperatura ambiente durante tres minutos y luego colóquela a cuatro grados centígrados durante cinco minutos para una dación completa para dosificar las células con los productos químicos de interés. Primero, alinee cuidadosamente los pozos del chip del cometa con los pozos de una nueva placa de 96 pocillos sin fondo y presione hacia abajo. Asegure la placa de 96 pocillos a la placa de vidrio con clips de carpeta como antes.

A continuación, coloque la placa en hielo y añada 100 microlitros del producto químico de interés a la dosis deseada Para cada pocillo, permita que el producto químico bajo investigación permanezca en las células con el período de tiempo deseado después de la dosificación, aspire la solución química de cada pocillo y enjuague con un XPBS si es necesario. Corta el gel en pedazos separados. Luego, para estudiar la cinética de reparación, agregue medios de cultivo a los pocillos, incube y proceda a la lisis celular en puntos de tiempo específicos a las células LY para el ensayo de cometa alcalino.

Prepare aproximadamente 25 mililitros de tampón de lisis alcalina de trabajo para cada chip agregando 1%Triton X 100 a la solución madre de lisis alcalina. A continuación, preenfriar a cuatro grados centígrados. Decanta el tampón de lisis alcalina en un contenedor un poco más grande que el chip del cometa.

A continuación, sumerja el chip alcalino en el tampón de lisis alcalina de trabajo refrigerado en el frigorífico y deje que la lisis proceda durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire el chip del cometa del tampón de lisis y vuelva a encenderlo rápidamente con un XPBS. A continuación, coloque el chip en una cámara de electroforesis con el lado de la película de gel hacia abajo y asegúrelo con cinta adhesiva de doble cara.

Lleve la cámara a la cámara fría de cuatro grados centígrados y llene la cámara con tampón de electroforesis alcalina fría hasta un nivel que solo cubra el gel. A continuación, deje el chip a cuatro grados centígrados durante 40 minutos para permitir el desenrollado alcalino. Finalmente, haga funcionar el gel a un voltio por centímetro y 300 miliamperios durante 30 minutos.

En la cámara frigorífica, ajuste el volumen del tampón de electroforesis en la cámara para lograr la corriente de funcionamiento deseada. Para el ensayo de cometa neutro, haga que funcione con un tampón de lisis neutro agregando 1 % Triton X 110 % DMSO a la solución madre de lisis neutra. De nuevo, preparando aproximadamente 25 mililitros de tampón de lisis de trabajo para cada chip.

Coloque el tampón de lisis neutro de trabajo en la incubadora a 43 grados centígrados para precalentarlo. Después de calentar el tampón de lisis neutro, sumerja el chip de coma en el tampón de lisis neutro y colóquelo en una incubadora a 40 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, retire el tampón de lisis neutro y luego res dos veces con el tampón de electroforesis neutro durante 15 minutos a cuatro grados centígrados Cada vez, asegure el chip en la cámara de electroforesis y transfiéralo a la cámara frigorífica.

Como antes, llene la cámara de electroforesis con un tampón de electroforesis neutro frío hasta un nivel que solo cubra el gel y deje que el gel se asiente en una habitación fría durante 60 minutos, haga funcionar el gel a 0,6 voltios por centímetro y seis miliamperios durante 60 minutos en la cámara frigorífica. Nuevamente, ajuste el volumen del tampón de electroforesis en la cámara para lograr la corriente de funcionamiento deseada si es necesario. Después de retirar el chip de comunicación de la cámara frigorífica, neutralice los geles mediante el lavado y el tampón de neutralización dos veces durante 15 minutos cada una a cuatro grados centígrados.

Permanezca en el chip con una tinción de ADN fluorescente, como el oro cibernético o el bromuro de iridio. De acuerdo con las instrucciones del fabricante y la imagen utilizando microscopía fluorescente, en el panel superior de este diagrama se muestran seis cometas de micropocillos representativos de TK sin tratar. Los de seis células TK se expusieron a peróxido de hidrógeno de 50 micromolares en el panel central y a peróxido de hidrógeno de 100 micromolares en el panel inferior.

Todas las exposiciones fueron de 20 minutos a cuatro grados centígrados. Este gráfico de líneas muestra la respuesta a la dosis de peróxido de hidrógeno de las células TK seis. Cada punto de datos es el promedio de tres experimentos independientes en los que se obtuvo el porcentaje medio de ADN de cola de al menos 50 cometas individuales en cada experimento.

Este gráfico muestra la variación de muestra a muestra del ensayo de chip de coma para TK: aquí se muestran los datos de ADN de cola del porcentaje de peróxido de hidrógeno expuestos de cada pocillo. Cada caja representa la mediana de al menos 50 cometas individuales de cada pozo. La media de 12 pozos es 77 punto 53%La desviación estándar es 3.99% y el coeficiente de variación es 5.2%Este gráfico muestra la variación de experimento a experimento.

La misma exposición al peróxido de hidrógeno se repitió seis veces, y los datos de cada repetición se muestran como una barra gris. Cada cuadro representa el porcentaje medio de ADN de la cola de al menos 100 cometas individuales de cada repetición. El promedio de seis repeticiones es 49.57%mostrado como la barra trasera aquí.

La desviación estándar de seis repeticiones es 4.99% y la barra de error de la media es 2.04% representada como la barra de aire en la figura Como el ensayo común tradicional. Los investigadores son libres de hacer modificaciones a este procedimiento o utilizar otros líos, como la inclusión de enzimas específicas de lesiones purificadas para responder preguntas adicionales sobre el tipo de daño en el ADN producido en las células. La técnica del chip cometa ha allanado el camino para que los estudios de células de mamíferos aprendan sobre el daño y la reparación del ADN.

Y debido a que es de alto rendimiento, permite hacer estudios clínicos y epidemiológicos que antes no eran posibles debido a la cantidad de muestras.