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Detección de especies reactivas de oxígeno

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Cell Biology

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Detecting Reactive Oxygen Species

4.11: The ATP Bioluminescence Assay

4.13: An Introduction to Cell Death

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09:08 min

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April 30, 2023

Overview

Especies reactivas del oxígeno son moléculas químicamente activas, derivados de oxígeno capaces de oxidar otras moléculas. Debido a su naturaleza reactiva, hay muchos efectos deletéreos asociados a la producción de ROS, incluyendo daño estructural para el ADN y otras moléculas biológicas. Sin embargo, ROS puede ser también mediadores de señales fisiológicas. Hay acumulando pruebas que ROS desempeñan un papel importante en todo, desde la activación de factores de transcripción a la mediación de toxicidad inflamatoria que mata patógenos extranjeros y defender el cuerpo.

En este video ahondamos en las asociaciones entre el ROS, el metabolismo y la enfermedad. Después de establecer su significado, vamos a discutir los principios y un protocolo de una metodología comúnmente utilizada para medir los niveles de ROS en las células: el uso de fluorescentes no sondas que fluorescente sobre la oxidación. Por último, vamos a revisar algunas aplicaciones actuales de esta técnica en investigación de Biología de la célula.

Procedure

Especies reactivas del oxígeno producidas en las células han sido implicadas en la homeostasis del tejido, el envejecimiento celular y Estados de la enfermedad como el cáncer. Como su nombre lo indica, se presentan estas moléculas de oxígeno, que existe naturalmente como una molécula de dioxígeno estable, ya que sus electrones se aparean. La adición de un electrón desapareado hace inestable y lleva a la formación del anión superóxido, una forma de especie reactiva del oxígeno o ROS. Que no sea el anión superóxido, hay varios tipos de especies reactivas con electrones no apareados, cuyos niveles de la célula tiene como objetivo controlar firmemente.

En este video, aprenderemos cómo reactivas del oxígeno especies están relacionados con la célula metabolismo y enfermedad, explorar los principios detrás de un análisis para su detección utilizando una sonda fluorescente e irá sobre un protocolo generalizado de este análisis. Por último, a investigar cómo los científicos están aplicando este método en experimentos hoy.

En primer lugar, vamos a discutir cómo reactivas del oxígeno especies se producen y consideran su influencia en el metabolismo de la célula y la enfermedad.

Una importante fuente de especies reactivas de oxígeno celular es la mitocondria. Normalmente, en célula de electrones del metabolismo son transportados a través de una cadena de complejos proteicos, que culminó en la generación simultánea de ATP y la reducción de oxígeno molecular a agua. A pesar de la regulación extraordinaria de este proceso, fugas electrones, resultando en la formación de anión superóxido.

La presencia de anión superóxido rápidamente da lugar a otras formas de especies reactivas del oxígeno, tales como el peróxido de hidrógeno y radical hidroxilo. Estos radicales, que todos poseen un electrón impar muy reactivo, insolubles pueden dañar las membranas, DNA y proteínas. Para contrarrestar, la célula mantiene su propio arsenal de antioxidante de enzimas como la superóxido dismutasa o moléculas como la vitamina C, que reducen los radicales libres. Cualquier desequilibrio en este sistema de defensa puede resultar en un bucle de retroalimentación positiva potencialmente fatal, resultando en una condición de especies reactivas del oxígeno excesivo conocidas como estrés oxidativo.

Especies reactivas de oxígeno se han implicado en la iniciación y progresión del cáncer. Otro efecto nocivo de estas moléculas es la inducción de envejecimiento celular, también conocida como senescencia. El “Radical libre teoría del envejecimiento” propone que las especies reactivas del oxígeno producidas en las células durante el metabolismo normal evocan muerte y senescencia celular.

Hasta ahora, hemos discutido los aspectos negativos de estas moléculas altamente reactivas, pero tienen funciones positivas en fisiología celular así. Durante las respuestas inmunitarias cuando los fagocitos engullen patógenos, células montar una “explosión respiratoria” durante la cuales cantidades excesivas de especies reactivas del oxígeno se generan para degradar oxidativamente patógenos. Además, son productos intermedios necesarios y reguladores de una variedad de vías de señalización de la célula y puede incluso señal de la muerte de las células que se han vuelto cancerosas.

Para cuantificar estos oxidantes celulares influyentes, los científicos explotan las moléculas que a oxidación fluorescentes. Una punta de prueba comúnmente utilizado para detectar las especies reactivas del oxígeno es H₂DCFDA o dicloro-dihidro-fluoresceína diacetato, un análogo no fluorescente de fluoresceína. Cuando se añade a las células, su naturaleza florescente de la célula permite que difunden en forma pasiva.

Entonces, esterasas intracelulares catalizan una reacción de hidrólisis, que se traduce en Máquinas Hendedoras de grupos acetato. Esto hace que el compuesto más polar, por lo que se mantiene dentro de la célula. A la oxidación, que consiste en eliminación de átomos de hidrógeno por una amplia gama de especies reactivas de oxígeno, la H2DCFDA no fluorescente se convierte en altamente fluorescente dicloro-fluoresceína, o DCF. Esto se puede leer y cuantificado por un lector de placas, citómetro de flujo o microscopia de fluorescencia.

Ahora que sabes cómo funciona este análisis, vamos a ver cómo se realiza en un entorno de laboratorio.

Comenzar con la transferencia de las células cultivadas en medio de cultivo con solución salina amortiguada de fosfatos, seguido de centrifugación para lavarlos. Eliminar el sobrenadante y agregar la solución de sonda fluorescente H₂DCFDA. Incube las células cargada de tinte en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo. Después de la incubación se lavan las células para eliminar las células descargadas de tinte y transferencia a un plato. En este punto, se pueden agregar inductores de estrés oxidativo experimental.

Cuando esté listo para el análisis, las células se pueden insertar en el lector de placas. Las longitudes de onda de excitación y de emisión se establecen para la fluoresceína. Después se leen las placas, los valores pueden ser analizados. Los resultados revelan la cantidad relativa de especies reactivas de oxígeno entre las muestras en momentos particulares.

Ahora que hemos examinado el protocolo real, vamos a mirar cómo se es se aplica en experimentos hoy.

Los investigadores suelen utilizan este método para investigar los mecanismos de fagocitosis. Este grupo de científicos quería estudiar la capacidad del pez cebra para montar una respuesta inmune en diferentes etapas de desarrollo. Como se mencionó anteriormente, resultados de la fagocitosis en la generación de especies reactivas de oxígeno alto, o “una explosión respiratoria”, se utiliza para destruir los patógenos. Puesto que la enzima oxidasa de NADPH es un productor importante de ROS en las células fagocíticas, estos científicos indujo la respuesta de explosión tratando de pez cebra con un inductor de NADPH. Los resultados demostraron que entre embriones de pez cebra cuya respuesta de “explosión” había sido provocado, los de fertilización después de 72 horas mostraban un mayor desarrollo de las especies reactivas de oxígeno que las 48 horas post fertilización.

La disfunción mitocondrial debido a especies reactivas de oxígeno aumento es una característica patológica de muchas enfermedades. Por lo tanto, los investigadores pueden identificar la disfunción mitocondrial por medir el nivel de estrés oxidativo. Aquí, los científicos carguen H2DCFDA a las neuronas y se montaron las muestras en un microscopio de fluorescencia. En adición de un estresor oxidativo, como el peróxido de hidrógeno, cuerpos celulares muestran un aumento repentino en la fluorescencia, que podría ser una indicación de la disfunción mitocondrial.

Los astrocitos se han sugerido para proteger a las neuronas del sistema nervioso central de estrés oxidativo. Debido a este significado, estos investigadores pretendían desarrollar un análisis para detectar el estrés oxidativo en los astrocitos en presencia de un inductor externo. Hicieron esto por incubación de astrocitos con peróxido de hidrógeno y la punta de prueba fluorescente para la detección de especies reactivas de oxígeno. Posterior fluorescencia generada se analizó utilizando un citómetro de flujo. Astrocitos activados por el estrés oxidativo se observan caer dentro de una región de intensidad creciente de la fluorescencia, visto desplazada a la derecha.

Sólo has visto video de Zeus en la detección de especies reactivas de oxígeno o ROS. En definitiva, en este vídeo hablamos de la relación entre especies reactivas del oxígeno, el metabolismo de la célula y la enfermedad. Luego examinamos el principio y el procedimiento de un ensayo para la detección de especies reactivas de oxígeno. Finalmente, exploramos cómo los investigadores están aplicando este método a sus investigaciones. El análisis de las funciones todavía enigmáticos de especies reactivas del oxígeno es de gran interés para los biólogos de la célula, y confiable medición con sondas fluorescentes está demostrando para ser muy valiosa. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Reactive oxygen species produced in cells have been implicated in tissue homeostasis, cellular aging, and disease states like cancer. As their name implies, these molecules arise from oxygen, which naturally exists as a stable, dioxygen molecule since all its electrons are paired. The addition of one unpaired electron renders it unstable, and leads to formation of the superoxide anion—a form of reactive oxygen species or ROS. Other than the superoxide anion, there are several types of reactive species with unpaired electrons, whose levels the cell aims to tightly control.

In this video, we’ll learn how reactive oxygen species are related to cell metabolism and disease, explore the principles behind an assay for its detection using a fluorescent probe, and we’ll go over a generalized protocol for this assay. Lastly, we’ll investigate how scientists are implementing this method in experiments today.

First, let’s discuss how reactive oxygen species are produced, and consider their influence in cell metabolism and disease.

A significant source of cellular reactive oxygen species is the mitochondria. Normally, during cell metabolism electrons are transported through a chain of protein complexes, culminating in the reduction of molecular oxygen to water and simultaneous generation of ATP. Despite the extraordinary regulation of this process, electrons do leak out, resulting in the formation of superoxide anion.

The presence of superoxide anion quickly gives rise to other forms of reactive oxygen species, such as hydrogen peroxide and hydroxyl radical. These radicals, which all possess a highly reactive unpaired electron, can oxidatively damage membranes, DNA, and proteins. To counteract, the cell maintains its own antioxidant stockpile of enzymes like superoxide dismutase, or molecules like vitamin C, that reduce free radicals. Any imbalance in this defense system can result in a potentially fatal positive feedback loop, resulting in a condition of excessive reactive oxygen species known as oxidative stress.

Reactive oxygen species have been implicated in initiation and progression of cancer. Another harmful effect of these molecules is the induction of cellular aging, also known as senescence. The “Free Radical Theory of Aging” proposes that reactive oxygen species produced in cells during normal metabolism evoke cellular senescence and death.

Until now, we discussed the negative aspects of these highly reactive molecules, but they have positive roles in cellular physiology as well. During immune responses when phagocytes engulf pathogens, cells mount a “respiratory burst” during which excessive amounts of reactive oxygen species are generated to oxidatively degrade pathogens. In addition, they are necessary intermediates and regulators of a variety of cell signaling pathways, and can even signal the death of cells that have turned cancerous.

To quantify these influential cellular oxidants, scientists exploit molecules that upon oxidation turn fluorescent. A commonly used probe to detect the reactive oxygen species is H2DCFDA or dichloro-dihydro-fluorescein diacetate, a non-fluorescent analogue of fluorescein. When added to cells, its cell permeant nature allows it to passively diffuse in.

Then, intracellular esterases catalyze a hydrolysis reaction, which results in cleaving of acetate groups. This makes the compound more polar, so that it is retained within the cell. Upon oxidation, which involves removal of hydrogen atoms by a wide range of reactive oxygen species, the non-fluorescent H2DCFDA is converted to the highly fluorescent dichloro-fluorescein, or DCF. This can be read and quantified by a plate reader, flow cytometer, or fluorescence microscopy.

Now that you know how this assay works, let’s see how it’s performed in a laboratory setting.

Start by transferring cells grown in culture medium to phosphate buffered saline, followed by centrifugation to wash them. Remove supernatant, and add the fluorescent probe H2DCFDA solution. Incubate the dye-loaded cells in the dark to prevent photobleaching. After incubation, wash the cells to remove unloaded dye and transfer cells to a plate. At this point, experimental oxidative stress inducers can be added.

When ready for analysis, cells can be inserted into the plate reader. The excitation and emission wavelengths are set for fluorescein. After plates are read, values can be analyzed. Results reveal the relative amount of reactive oxygen species between samples at particular time points.

Now that we’ve examined the actual protocol, let’s look how it’s being applied in experiments today.

Researchers often use this method to investigate the mechanics of phagocytosis. This group of scientists wanted to study the ability of zebrafish to mount an immune response at different stages of development. As mentioned earlier, phagocytosis results in the generation of high reactive oxygen species, or “a respiratory burst,” that is used to kill pathogens. Since the enzyme NADPH oxidase is a significant ROS producer in phagocytic cells, these scientists induced the burst response by treating zebrafish with a NADPH inducer. The results demonstrated that amongst zebrafish embryos whose “burst” response had been provoked, those at 72 hours post-fertilization showed higher reactive oxygen species development than those at 48 hours post-fertilization.

Mitochondrial dysfunction due to increased reactive oxygen species is a pathological feature of many diseases. Therefore, researchers can identify mitochondrial dysfunction by measuring the level of oxidative stress. Here, scientists loaded H2DCFDA onto neurons, and then mounted the samples onto a fluorescence microscope. On addition of an oxidative stressor, like hydrogen peroxide, cell bodies displayed a sudden increase in fluorescence, which could be an indication of mitochondrial dysfunction.

Astrocytes have been suggested to protect central nervous system neurons from oxidative stress. Because of this significance, these researchers aimed to develop an assay to detect oxidative stress in astrocytes in the presence of an external inducer. They did this by incubating astrocytes with hydrogen peroxide and the fluorescent probe for reactive oxygen species detection. Subsequent fluorescence generated was analyzed using a flow cytometer. Astrocytes activated for oxidative stress were observed to fall within a region of increased fluorescence intensity, seen shifted to the right.

You’ve just watched JoVE’s video on detecting reactive oxygen species or ROS. To sum up, in this video we discussed the link between reactive oxygen species, cell metabolism, and disease. We then examined the principle and procedure of an assay for reactive oxygen species detection. Finally, we explored how researchers are applying this method to their investigations. The analysis of the still enigmatic roles of reactive oxygen species is of great interest to cell biologists, and reliable measurement with fluorescent probes is proving to be invaluable. As always, thanks for watching!

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