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Introducción sobre la motilidad celular y la migración

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Cell Biology

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An Introduction to Cell Motility and Migration

4.3: Live Cell Imaging of Mitosis

4.5: The Transwell Migration Assay

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08:52 min

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April 30, 2023

Overview

Migración y motilidad celular desempeñan importantes funciones en ambos normal de la biología y en la enfermedad. Por un lado, la migración permite generar complejos tejidos y órganos durante el desarrollo de las células, pero por otro lado, los mismos mecanismos son utilizados por las células del tumor y extensión en un proceso conocido como metástasis del cáncer. Uno de los mecanismos celulares primarios que permiten el movimiento celular es una red intracelular de miosina y actina moléculas, juntas conocidos como “actomyosin”, que crea una fuerza contráctil para tirar de una celda en distintas direcciones.

En este video, JoVE presenta una descripción histórica del campo de la migración de la célula, observando cómo trabajo en la contracción muscular conducida al descubrimiento del aparato actomyosin. A continuación exploramos algunas de las preguntas que los investigadores todavía se preguntan sobre la motilidad celular y revisión las técnicas utilizadas para el estudio de diferentes aspectos de este fenómeno. Por último, veremos cómo los investigadores están estudiando actualmente la migración de la célula, por ejemplo, para entender mejor la metástasis.

Procedure

La motilidad celular es necesaria para muchos procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la migración celular durante el desarrollo embrionario, el movimiento de glóbulos blancos en respuesta a la infección, y cáncer de células en metástasis. Dos proteínas celulares, actina y miosina, forman los pilares principales del aparato de la motilidad.

En este video de introducción, revisaremos algunos de los descubrimientos de hito en el campo de la migración y motilidad celular. A continuación, destacamos algunas preguntas sin respuesta en relación con la motilidad celular, seguida por una discusión de herramientas clásicas y avanzadas para el estudio de la motilidad. Por último, a terminar con algunos experimentos de ejemplo.

Vamos a comenzar analizando los descubrimientos importantes relacionados con este campo.

En^{el siglo 17,} Anton van Leeuwenhoek, con la ayuda de un microscopio, se convirtió en la primera persona para observar el movimiento de los espermatozoides y las bacterias. Un par de siglos más tarde, Theodor Wilhelm Engelmann y Wilhelm Pfeffer descubrieron basada en el estímulo movimiento de bacteria, incluyendo: phototaxis, que es movimiento influenciado por la luz; quimiotaxis: movimiento hacia diversas sustancias químicas; y aerotaxis, movimiento en respuesta al oxígeno. Al mismo tiempo, Ilya Metchnikoff realizó un experimento fascinante en la que pinchó la larva de estrella de mar transparente con una espina de rosa y observa las células hacia la herida de otras partes del cuerpo. Esto condujo a la noción de los leucocitos emigran a un sitio de la lesión, pionera en el campo de la inmunología.

Una comprensión del mecanismo de movimiento celular comenzó unos años antes, al estudiar un fenómeno aparentemente sin relación: contracción del músculo. En 1859, Wilhelm Kühne aisló una proteína muscular que pensó que era responsable de su rigidez y la llamó miosina.

En 1942, Brunó Ferenc Straub descubrió que los preparativos de “miosina” realmente contenían una proteína secundaria, actina. Ahora sabemos que actina y miosina interactúan para formar el complejo actomyosin que produce la contracción. En 1974, Margaret Clarke, mientras que trabaja debajo James Spudich, había caracterizado actomyosin-como las estructuras en el molde del limo Dictyosteliumy sugirió su participación en el movimiento celular no muscular.

En 1983, Spudich, junto con Michael Sheetz, desarrolló una en vitro modelo actomyosin, que allanó el camino para nuestra actual comprensión de su mecanismo. Ahora sabemos que ATP, una molécula de “alta energía” en las células, se une a la miosina y la molécula de miosina para “rastrear” los poderes a lo largo de una molécula de actina paralelos, generando una fuerza contráctil que en las células musculares no puede tirar la célula adelante durante su migración.

Después de la breve reseña histórica, vamos a discutir algunas cuestiones sobre la motilidad de la célula que los científicos se preguntan hoy en día.

Los investigadores están interesados en aprender cómo ambiental movimiento de celular directa de señales. Las células se mueven en respuesta a una variedad de señales, incluyendo aquellos que impulsan el desarrollo embrionario y las células inmunes alerta a los sitios de infección. Estas señales son compuestos generalmente químicos liberados por algunas células para inducir la migración de un tipo específico de células hacia ellos. Por lo tanto, estudiar el mecanismo de esta inducción de quimiotaxis puede ayudar a los científicos comprender mejor los trastornos en que célula se interrumpe la migración.

Otra área importante de investigación refiere a la maquinaria molecular que utilizan las células para moverse. Además el aparato de actomyosin que permite a las células con formas geométricas flexibles protuberancias y “arrastre” a lo largo de las superficies, los investigadores también buscan entender cómo la motilidad de la célula puede ser conducida por otros elementos del citoesqueleto, los microtúbulos que forman el “eje” de la cola del esperma, así como las máquinas moleculares complejas que forman flagelos bacterianos.

Por último, algunos científicos exploran cómo las células interactúan entre sí y emigran juntos en grupos, que se producen en la embriogénesis temprana, así como el proceso de cicatrización.

Además, porque las células del cuerpo realmente existen dentro de una malla de moléculas conocido como la matriz extracelular, abreviada como ECM, investigando cómo las células interactúan con e invaden en el ECM puede ayudar a fenómenos de comprensión como la metástasis del cáncer.

Ahora que ya tenemos una idea de las preguntas en el campo, vamos a conocer algunas técnicas prominente siendo empleados.

El ensayo de rayado se utiliza para modelar células epiteliales cómo repoblar una zona abierta, un proceso similar a la cicatrización de heridas. En este procedimiento, se crea una herida mediante la ejecución de una punta de pipeta a través de la placa de cultivo celular. Como las células crecen en esta brecha en el tiempo, sus trayectorias de movimiento podrían ser rastreados utilizando el software de seguimiento para evaluar el desplazamiento y la velocidad de movimiento.

El ensayo de migración transwell es otro método clásico utilizado para estudiar chemoattraction, que es el proceso de atraer químicamente a las células. En este ensayo, chemoattractant solución se agrega a los pozos, las cámaras transwell son colocadas dentro de estos pozos, y por último, se agrega un tipo de células migratorias en la parte superior de la membrana. El número de células que emigran hacia la chemoattractant puede contarse utilizando un microscopio y un hemocitómetro.

Avances en técnicas de ingeniería han permitido la construcción de dispositivos de microfluidos, compuesto por canales recientemente grabados en una superficie adecuada. Para los experimentos de migración, el canal tiene generalmente dos puertos: uno para la adición de una suspensión y otro para la adición de un estímulo químico. El efecto del estímulo en el comportamiento migratorio de las células puede entonces estudiarse bajo un microscopio.

Para estudiar la invasión de las células en el ECM, los investigadores pueden realizar ensayos de invasión 3D. En este método, los científicos de la cultura células en matrices tridimensionales de componentes como el colágeno. Luego, con la ayuda de software sofisticado puede seguir la invasión en tres dimensiones. Este método es particularmente útil para estudiar el desarrollo del tumor.

Por último, microscopía de fluorescencia Time-lapse puede utilizarse para seguimiento de células vivas en vivo. Genes que codifican proteínas fluorescentes pueden ser introducidos en un modelo animal. La ruta migratoria de las células que ya expresan proteínas fluorescentes puede rastrearse mediante métodos sofisticados de imagen, tales como microscopia de dos fotones.

Ahora, vamos a examinar algunas aplicaciones actuales de estos ensayos de migración y motilidad celular.

Como comentamos, migración de la célula desempeña un papel crítico en metástasis del tumor. Aquí, los científicos cultivan células tumorales embebidas en una matriz junto con rebanadas de cerebro en una cámara transwell. Tras la incubación, las muestras fueron teñidas y analizan mediante inmunofluorescencia. Los resultados demostraron invasión por células tumorales en las rebanadas de cerebro.

Después de la infección, las células liberan quimiocinas, que son proteínas chemoattractant que inducen la migración de neutrófilos. Neutrófilos son las células fagocíticas, que forman parte integral del sistema inmune innato. Aquí, los investigadores evaluaron este fenómeno usando un análisis de migración transwell. Platean células epiteliales infectadas por las bacterias en la parte inferior de la membrana, mientras que los neutrófilos fueron cultivados en la parte superior. Los resultados mostraron significativa migración neutrófila en presencia de las células infectadas.

Por último, ensayos de cámara de microfluidos pueden utilizarse para examinar la quimiotaxis bacteriana. Aquí, los científicos evaluaron atrayente y repelentes propiedades de dos sustancias: L-aspartato y níquel sulfato, usando una cámara especializada microfluídico que podría probar varias concentraciones en un experimento. Los datos obtenidos demostraron que con un aumento en la concentración de repelente y atrayente, la migración bacteriana hacia y lejos de las moléculas de la prueba también aumentó, respectivamente.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a migración y motilidad celular. En esta presentación, repasamos los principales hitos en el estudio de la motilidad celular y la migración. A continuación, comentamos algunas preguntas actuales y herramientas que se utiliza en los laboratorios de hoy. Por último, algunos experimentos de ejemplo destacan aplicaciones de estas técnicas. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Cell motility is required for many physiological and pathological processes, including cell migration during embryonic development, movement of white blood cells in response to infection, and cancer cells undergoing metastasis. Two cellular proteins, actin and myosin, form the principal building blocks of the motility apparatus.

In this introductory video, we’ll review some of the landmark discoveries in the field of cell motility and migration. Then, we’ll highlight a few unanswered questions regarding cell motility, followed by a discussion of classical and advanced tools used to study motility. Finally, we’ll wrap up with some example experiments.

Let’s start by looking at the important discoveries associated with this field.

In the 17th century, Anton van Leeuwenhoek, with the help of a microscope, became the first person to observe the movement of spermatozoa and bacteria. A couple of centuries later, Theodor Wilhelm Engelmann and Wilhelm Pfeffer discovered stimulus-driven bacterial motion, including: phototaxis, which is movement influenced by light; chemotaxis—movement towards various chemical substances; and aerotaxis—movement in response to oxygen. Around the same time, Ilya Metchnikoff performed a fascinating experiment in which he pricked the transparent starfish larva with a rose thorn, and observed cells moving from other parts of the body to the wound. This led to the notion of leukocytes migrating to a site of injury, pioneering the field of immunology.

An understanding of the mechanism of cell movement began a few years earlier, when studying a seemingly unrelated phenomenon—muscle contraction. In 1859, Wilhelm Kühne isolated a muscle protein that he thought was responsible for its stiffness, and called it myosin.

In 1942, Brunó Ferenc Straub discovered that the “myosin” preparations actually contained a secondary protein, actin. We now know that actin and myosin interact to form the actomyosin complex, which produces contraction. In 1974, Margaret Clarke, while working under James Spudich, characterized actomyosin-like structures in the slime mold Dictyostelium, and suggested its involvement in non-muscle cell movement.

In 1983, Spudich, along with Michael Sheetz, developed an in vitro actomyosin model, which paved the way to our present-day understanding of their mechanism. We now know that ATP, a “high-energy” molecule in cells, binds to myosin and powers the myosin molecule to “crawl” along a parallel actin molecule, thereby generating a contractile force that in non-muscle cells can pull the cell forward during migration.

After the brief historical outline, let’s discuss a few questions about cell motility that scientists are asking today.

Researchers are interested in learning how environmental cues direct cell movement. Cells move in response to a variety of signals, including those that drive embryonic development, or alert immune cells to sites of infection. These signals are usually chemical compounds released by some cells to induce migration of a specific type of cells towards them. Therefore, studying the mechanism of this chemotaxis induction can help scientists better understand the disorders in which cell migration is disrupted.

Another important area of investigation concerns the molecular machinery that cells use to move. In addition to the actomyosin apparatus that allows cells with flexible shapes to extend protrusions and “crawl” along surfaces, researchers also seek to understand how cell motility can be driven by other cytoskeletal elements, such as the microtubules that form the “shaft” of sperm tails, as well as the complex molecular machines that form bacterial flagella.

Finally, some scientists explore how cells interact with each other and migrate together in groups, which occur in early embryogenesis, as well as the wound healing process.

Additionally, because cells in the body actually exist within a mesh of molecules known as the extracellular matrix, abbreviated as ECM, investigating how cells interact with and invade into the ECM can help in understanding phenomena such as cancer metastasis.

Now that we have an idea of the questions being asked in the field, let’s learn about some prominent techniques being employed.

The scratch assay is used to model how epithelial cells repopulate an open area—a process similar to wound healing. In this procedure, a wound is created by running a pipette tip through the cell culture dish. As cells grow back into this gap over time, their movement trajectories could be tracked using tracking software to assess movement speed and displacement.

The transwell migration assay is another classical method used to study chemoattraction, which is the process of chemically attracting cells. In this assay, chemoattractant solution is added to wells, then the transwell chambers are placed inside these wells, and finally, a migratory cell type is added on the upper side of the membrane. The number of cells migrating towards the chemoattractant can be counted using a microscope and hemocytometer.

Advances in engineering techniques have allowed the construction of microfluidics devices, composed of microfabricated channels etched on a suitable surface. For migration experiments, the channel usually has two ports: one for the addition of a cell suspension, and another for the addition of a chemical stimulus. The effect of the stimulus on cells’ migratory behavior can then be studied under a microscope.

To study the invasion of cells into the ECM, researchers can perform 3D invasion assays. In this method, scientists culture cells in three-dimensional matrices made of components such as collagen. Then, with the help of sophisticated software they can track invasion in three dimensions. This method is particularly useful for studying tumor development.

Finally, time-lapse fluorescence microscopy can be used to track live cells in vivo. Genes encoding fluorescent proteins can be introduced into an animal model. The migratory path of the cells now expressing fluorescent proteins can be traced using sophisticated imaging methods, such as two-photon microscopy.

Now, let’s examine some current applications of these cell motility and migration assays.

As discussed, cell migration plays a critical role in tumor metastasis. Here, scientists cultured tumor cells embedded in a matrix together with brain slices in a transwell chamber. Following incubation, the samples were stained and analyzed using immunofluorescence. Results demonstrated invasion by tumor cells into the brain slices.

Following infection, cells release chemokines, which are chemoattractant proteins that induce migration of neutrophils. Neutrophils are phagocytic cells, which form an integral part of the innate immune system. Here, researchers evaluated this phenomenon using a transwell migration assay. They plated bacteria-infected epithelial cells onto the underside of the membrane, while neutrophils were cultured on the upper side. Results showed significant neutrophil migration in the presence of infected cells.

Finally, microfluidic chamber assays can be used to examine bacterial chemotaxis. Here, scientists evaluated attractant and repellant properties of two substances—L-aspartate and nickel sulfate—using a specialized microfluidic chamber that could test several concentrations in one experiment. The data obtained demonstrated that with an increase in attractant and repellent concentration, bacterial migration towards and away from the test molecules also increased, respectively.

You’ve just watched JoVE’s introduction to cell motility and migration. In this presentation, we reviewed the major milestones in the study of cell motility and migration. Next, we discussed some current questions being asked, and tools being used in labs today. Lastly, some example experiments highlighted applications of these techniques. As always, thanks for watching!

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