Metodología para la inducción de esputo y el procesamiento de laboratorio

La técnica del esputo inducido se desarrolló a principios de los años 90. La técnica se propuso para investigar nueva información sobre la enfermedad obstructiva de las vías respiratorias como el asma y la EPOC y, más recientemente, también ha habido interés en buscar nueva información sobre la fibrosis pulmonar. La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente no invasiva a diferencia de la broncoscopia.

El procesamiento requiere trabajo de laboratorio y lleva tiempo, por lo que es bastante exigente, requiere mucho tiempo y requiere cierta experiencia en el laboratorio, por lo que es claramente una técnica difícil de obtener en todos los centros. La técnica de esputo inducido se compone de dos partes, la primera parte es la inducción y la segunda parte es el procesamiento. Antes de inducir el esputo, debemos realizar una espirometría, que es una valoración del volumen y el caudal que el paciente es capaz de producir.

Y necesitamos hacer eso porque la inducción de esputo por sí sola puede causar bronquioespasmo, por lo que es absolutamente necesario conocer el valor basal de la espirometría de los pacientes. Así que primero realizamos una espirometría, luego les damos broncodilatadores a los pacientes, generalmente les damos 400 microgramos de salbutamol, para abrir al máximo las vías respiratorias de los pacientes, y también para prevenir un bronquioespasmo que pueda ocurrir durante la fase de inducción. Y después de 15 minutos, volvemos a medir la espirometría, para tener lo que llamamos el valor basal de la espirometría, y en particular observamos el FEV1, que es el volumen que el paciente es capaz de exhalar en un segundo.

Vierta agua destilada en la cámara del nebulizador hasta el nivel recomendado. Coloque una taza limpia en la cámara del nebulizador. Cubra la tapa llena con la tapa adecuada.

Llene el vaso con 50 ml de solución salina hipertónica al 5 % si el FEV1 post-broncodilatador es superior al 65 % previsto, o 50 ml de solución salina isotónica al 9 % si el FEV1 post-broncodilatador es inferior al 65 % previsto. Agregue 1,75 de solución de sulfato de salbutamol a una concentración de cinco miligramos por ml a la taza. Conecte los tubos y las válvulas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La técnica debe realizarse bajo supervisión médica. Explique el principio de la prueba al paciente. Pídale al paciente que use una pinza nasal.

Encienda el nebulizador y seleccione el nivel más bajo de aerosol y la configuración del ventilador. Pida al paciente que inhale el aerosol a través de la boquilla con respiración tidal tidal. El nivel de aerosol y el ajuste del ventilador pueden aumentarse dependiendo de la tolerancia del paciente.

En caso de opresión torácica o molestias respiratorias, detener el procedimiento y realizar una espirometría para medir el valor de FEV1 del paciente. Después de los cinco minutos de inhalación, o en caso de tos o náuseas, detenga el nebulizador. Pida al paciente que se quite la pinza nasal, que se enjuague la boca y haga gárgaras dos veces con agua del grifo, y que deseche esta agua en el fregadero.

Luego, como el paciente tose el esputo y escupe lo que sale de la garganta en un recipiente de plástico. Realizar la primera maniobra respiratoria para medir el FEV1. Después de cada tentativa de producción de esputo, medimos el valor de FEV1.

Si el valor del FEV1 baja más de un 20%, detenemos el procedimiento y le damos al paciente la nebulización de bromuro de ipratropio, que es un anticolinérgico que actuará en combinación con los agonistas beta-dos que ya hemos administrado durante el procedimiento. Si el valor del FEV1 no disminuye en más del 20%, realizamos el procedimiento durante un tiempo total de 10 a 20 minutos de acuerdo con la calidad y el volumen de esputo producido por el paciente. Una vez que obtenga la muestra de esputo, guárdela en el refrigerador hasta que se procese.

Así que la segunda parte consiste en el procesamiento del esputo, y para ello, primero tenemos que preparar las dos soluciones que vamos a utilizar para este procesamiento. Así que tenemos que preparar el Ditiotreitol también conocido como DTT. La solución debe prepararse diluyendo el DTT con agua estéril para obtener una solución de 6,5 milimolares.

Por lo que hay que evitar exponer la TDT al aire ambiente, y para ello utilizamos una jeringa y una aguja. En segundo lugar, hay que preparar la solución de azul de tripano, y para ello hay que hacer una dilución de DPBS con azul de tripano, para obtener una solución de 0,08%Por lo que respecta al esputo, hay que transferir todo el esputo en un tubo de plástico de fondo cónico de 50 ml, y pesar la muestra. Agregue un peso tres veces mayor de la solución DPBS.

Agite lentamente la muestra durante 30 segundos, centrifugar a 800 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante en un tubo de plástico de fondo cónico de 50 ml, después de la filtración a través de dos capas individuales de gasa estéril. Asigne el sobrenadante en tubos de plástico de 2 ml y guárdelo a menos 80 grados centígrados.

Nótese que las muestras de sobrenadante nos son útiles como componente trifásico del esputo. Si el volumen de la paleta de celdas es inferior a 5 ml, agregue DPBS para alcanzar un volumen de 5 ml de suspensión de celdas. Diluir la suspensión celular con un volumen de DTT a 6,5 milimolares.

Meca la suspensión de la celda durante 20 minutos a temperatura ambiente con un trabajador de banco. Diluya la suspensión celular al menos tres veces con DPBS. Centrifugar la suspensión celular diluida a 550 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Deseche el sobrenadante. Suspenda la paleta de celdas en aproximadamente un ml DPBS. Evalúe y registre el volumen exacto de la suspensión celular.

Añadir 50 microlitros de suspensión celular a 50 microlitros de la solución diluida de azul de tripano y homogeneizar. Coloque la muestra debajo de la cubierta de un citómetro hemocil y colóquela bajo un microscopio óptico. Evaluar la concentración celular de la suspensión celular, el porcentaje de células escamosas y el porcentaje de viabilidad de las células no escamosas.

Diluir una porción de la suspensión con DPBS para obtener al menos 350 microlitros de suspensión celular a 500, 000 celdas por mL. Ensamble el concentrador de celdas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Agregue 100 microlitros de la suspensión celular en cada uno de los tres compartimentos del concentrador de celdas.

Centrifugar dos minutos a 150 g a temperatura ambiente en una citocentrífuga. Deseche el sobrenadante. Deje que el portaobjetos se seque al aire.

Tiña el portaobjetos con div quick o con un kit de tinte de valencia de níquel de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Montaje con un medio de montaje y un cubreobjetos. Coloque el portaobjetos bajo el microscopio óptico con inmersiones en aceite.

Cuente al menos 500 células no escamosas, los neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, linfocitos y células epiteliales, y registre los valores absolutos y el porcentaje y el tipo de célula. En cuanto a los resultados, utilizando el hemocitómetro, tenemos que contar las células vivas no escamosas que no están coloreadas. También, las células muertas no escamosas que están coloreadas en azul.

Y las células escamosas. Estas células son células epiteliales que provienen de la boca. Son grandes, por lo que son fáciles de reconocer en comparación con las pequeñas células humanas.

Por lo tanto, debe evitar también contar bacterias, levaduras o desechos. Si la suspensión celular contiene más del 80% de células escamosas, esta muestra se considera de mala calidad y no adecuada para un portaobjetos de citospin. Por lo tanto, esta muestra se considera fallida.

El recuento del citospin teñido se realiza según el color de las células y su morfología. Los neutrófilos, la característica principal es el núcleo multilobulado que hace que las células sean fáciles de identificar. Estas células son redondas, pequeñas y de color rosa neutro.

Los eosinófilos, estas células están compuestas por gránulos rojos, fáciles de identificar. El tamaño de estas células es similar al de los neutrófilos. Los macrófagos, son de dos a cinco veces más grandes que los neutrófilos, y están coloreados en azul.

El citoplasma puede contener restos y vacuolas. Los linfocitos, estas células son redondas y pequeñas, de color azul, y poseen un núcleo grande y denso. Las células epiteliales tienen forma columnar, son de color rosa y, a menudo, presentan cilios en la parte superior.

Estos son algunos ejemplos de muestras de citoespín ilegibles con más del 80% de células escamosas. Creo que es una técnica muy útil, sin embargo, hay que tener mucha precaución porque la inducción del esputo debe hacerse bajo supervisión médica, pero la técnica de la inducción del esputo te da mucha información sobre el estado inflamatorio de los pacientes en las vías respiratorias. Puede permitirle medir diferentes marcadores bioquímicos en el sobrenadante, y también puede medir diferentes cosas en las partes celulares, por lo que el esputo inducido le permite realizar citometría de flujo, proteómica, transcriptómica e incluso genómica.