Metodología para la inducción de esputo y el procesamiento de laboratorio
17 de diciembre de 2017
Aquí describimos la técnica de inducción de esputo. Este protocolo también explica el proceso para realizar un conteo diferencial y recoger sobrenadante de esputo esputo y las células para su posterior análisis.
La técnica del esputo inducido se desarrolló a principios de los años 90. La técnica se propuso para investigar nueva información sobre la enfermedad obstructiva de las vías respiratorias como el asma y la EPOC y, más recientemente, también ha habido interés en buscar nueva información sobre la fibrosis pulmonar. La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente no invasiva a diferencia de la broncoscopia.
El procesamiento requiere trabajo de laboratorio y lleva tiempo, por lo que es bastante exigente, requiere mucho tiempo y requiere cierta experiencia en el laboratorio, por lo que es claramente una técnica difícil de obtener en todos los centros. La técnica de esputo inducido se compone de dos partes, la primera parte es la inducción y la segunda parte es el procesamiento. Antes de inducir el esputo, debemos realizar una espirometría, que es una valoración del volumen y el caudal que el paciente es capaz de producir.
Y necesitamos hacer eso porque la inducción de esputo por sí sola puede causar bronquioespasmo, por lo que es absolutamente necesario conocer el valor basal de la espirometría de los pacientes. Así que primero realizamos una espirometría, luego les damos broncodilatadores a los pacientes, generalmente les damos 400 microgramos de salbutamol, para abrir al máximo las vías respiratorias de los pacientes, y también para prevenir un bronquioespasmo que pueda ocurrir durante la fase de inducción. Y después de 15 minutos, volvemos a medir la espirometría, para tener lo que llamamos el valor basal de la espirometría, y en particular observamos el FEV1, que es el volumen que el paciente es capaz de exhalar en un segundo.
Vierta agua destilada en la cámara del nebulizador hasta el nivel recomendado. Coloque una taza limpia en la cámara del nebulizador. Cubra la tapa llena con la tapa adecuada.
Llene el vaso con 50 ml de solución salina hipertónica al 5 % si el FEV1 post-broncodilatador es superior al 65 % previsto, o 50 ml de solución salina isotónica al 9 % si el FEV1 post-broncodilatador es inferior al 65 % previsto. Agregue 1,75 de solución de sulfato de salbutamol a una concentración de cinco miligramos por ml a la taza. Conecte los tubos y las válvulas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La técnica debe realizarse bajo supervisión médica. Explique el principio de la prueba al paciente. Pídale al paciente que use una pinza nasal.
Encienda el nebulizador y seleccione el nivel más bajo de aerosol y la configuración del ventilador. Pida al paciente que inhale el aerosol a través de la boquilla con respiración tidal tidal. El nivel de aerosol y el ajuste del ventilador pueden aumentarse dependiendo de la tolerancia del paciente.
En caso de opresión torácica o molestias respiratorias, detener el procedimiento y realizar una espirometría para medir el valor de FEV1 del paciente. Después de los cinco minutos de inhalación, o en caso de tos o náuseas, detenga el nebulizador. Pida al paciente que se quite la pinza nasal, que se enjuague la boca y haga gárgaras dos veces con agua del grifo, y que deseche esta agua en el fregadero.
Luego, como el paciente tose el esputo y escupe lo que sale de la garganta en un recipiente de plástico. Realizar la primera maniobra respiratoria para medir el FEV1. Después de cada tentativa de producción de esputo, medimos el valor de FEV1.
Si el valor del FEV1 baja más de un 20%, detenemos el procedimiento y le damos al paciente la nebulización de bromuro de ipratropio, que es un anticolinérgico que actuará en combinación con los agonistas beta-dos que ya hemos administrado durante el procedimiento. Si el valor del FEV1 no disminuye en más del 20%, realizamos el procedimiento durante un tiempo total de 10 a 20 minutos de acuerdo con la calidad y el volumen de esputo producido por el paciente. Una vez que obtenga la muestra de esputo, guárdela en el refrigerador hasta que se procese.
Así que la segunda parte consiste en el procesamiento del esputo, y para ello, primero tenemos que preparar las dos soluciones que vamos a utilizar para este procesamiento. Así que tenemos que preparar el Ditiotreitol también conocido como DTT. La solución debe prepararse diluyendo el DTT con agua estéril para obtener una solución de 6,5 milimolares.
Por lo que hay que evitar exponer la TDT al aire ambiente, y para ello utilizamos una jeringa y una aguja. En segundo lugar, hay que preparar la solución de azul de tripano, y para ello hay que hacer una dilución de DPBS con azul de tripano, para obtener una solución de 0,08%Por lo que respecta al esputo, hay que transferir todo el esputo en un tubo de plástico de fondo cónico de 50 ml, y pesar la muestra. Agregue un peso tres veces mayor de la solución DPBS.
Agite lentamente la muestra durante 30 segundos, centrifugar a 800 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante en un tubo de plástico de fondo cónico de 50 ml, después de la filtración a través de dos capas individuales de gasa estéril. Asigne el sobrenadante en tubos de plástico de 2 ml y guárdelo a menos 80 grados centígrados.
Nótese que las muestras de sobrenadante nos son útiles como componente trifásico del esputo. Si el volumen de la paleta de celdas es inferior a 5 ml, agregue DPBS para alcanzar un volumen de 5 ml de suspensión de celdas. Diluir la suspensión celular con un volumen de DTT a 6,5 milimolares.
Meca la suspensión de la celda durante 20 minutos a temperatura ambiente con un trabajador de banco. Diluya la suspensión celular al menos tres veces con DPBS. Centrifugar la suspensión celular diluida a 550 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante. Suspenda la paleta de celdas en aproximadamente un ml DPBS. Evalúe y registre el volumen exacto de la suspensión celular.
Añadir 50 microlitros de suspensión celular a 50 microlitros de la solución diluida de azul de tripano y homogeneizar. Coloque la muestra debajo de la cubierta de un citómetro hemocil y colóquela bajo un microscopio óptico. Evaluar la concentración celular de la suspensión celular, el porcentaje de células escamosas y el porcentaje de viabilidad de las células no escamosas.
Diluir una porción de la suspensión con DPBS para obtener al menos 350 microlitros de suspensión celular a 500, 000 celdas por mL. Ensamble el concentrador de celdas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Agregue 100 microlitros de la suspensión celular en cada uno de los tres compartimentos del concentrador de celdas.
Centrifugar dos minutos a 150 g a temperatura ambiente en una citocentrífuga. Deseche el sobrenadante. Deje que el portaobjetos se seque al aire.
Tiña el portaobjetos con div quick o con un kit de tinte de valencia de níquel de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Montaje con un medio de montaje y un cubreobjetos. Coloque el portaobjetos bajo el microscopio óptico con inmersiones en aceite.
Cuente al menos 500 células no escamosas, los neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, linfocitos y células epiteliales, y registre los valores absolutos y el porcentaje y el tipo de célula. En cuanto a los resultados, utilizando el hemocitómetro, tenemos que contar las células vivas no escamosas que no están coloreadas. También, las células muertas no escamosas que están coloreadas en azul.
Y las células escamosas. Estas células son células epiteliales que provienen de la boca. Son grandes, por lo que son fáciles de reconocer en comparación con las pequeñas células humanas.
Por lo tanto, debe evitar también contar bacterias, levaduras o desechos. Si la suspensión celular contiene más del 80% de células escamosas, esta muestra se considera de mala calidad y no adecuada para un portaobjetos de citospin. Por lo tanto, esta muestra se considera fallida.
El recuento del citospin teñido se realiza según el color de las células y su morfología. Los neutrófilos, la característica principal es el núcleo multilobulado que hace que las células sean fáciles de identificar. Estas células son redondas, pequeñas y de color rosa neutro.
Los eosinófilos, estas células están compuestas por gránulos rojos, fáciles de identificar. El tamaño de estas células es similar al de los neutrófilos. Los macrófagos, son de dos a cinco veces más grandes que los neutrófilos, y están coloreados en azul.
El citoplasma puede contener restos y vacuolas. Los linfocitos, estas células son redondas y pequeñas, de color azul, y poseen un núcleo grande y denso. Las células epiteliales tienen forma columnar, son de color rosa y, a menudo, presentan cilios en la parte superior.
Estos son algunos ejemplos de muestras de citoespín ilegibles con más del 80% de células escamosas. Creo que es una técnica muy útil, sin embargo, hay que tener mucha precaución porque la inducción del esputo debe hacerse bajo supervisión médica, pero la técnica de la inducción del esputo te da mucha información sobre el estado inflamatorio de los pacientes en las vías respiratorias. Puede permitirle medir diferentes marcadores bioquímicos en el sobrenadante, y también puede medir diferentes cosas en las partes celulares, por lo que el esputo inducido le permite realizar citometría de flujo, proteómica, transcriptómica e incluso genómica.
Visión general
Este artículo describe la técnica de inducción de esputo, un método no invasivo utilizado para recolectar muestras de esputo para su análisis en enfermedades respiratorias. El protocolo incluye pasos detallados para el procesamiento del esputo para realizar conteos diferenciales de células y recolectar el sobrenadante para estudios adicionales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Medicina respiratoria
- Técnicas clínicas
- Análisis celular
Antecedentes
- Técnica de esputo inducido desarrollado a principios de los 90.
- Utilizado para investigar enfermedades obstructivas de las vías respiratorias como el asma y la EPOC.
- Interés reciente en la fibrosis pulmonar.
- Alternativa no invasiva a la broncoscopia.
Propósito del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para la inducción y procesamiento del esputo.
- Facilitar la recolección de muestras de esputo para el análisis celular.
- Mejorar la comprensión de las enfermedades respiratorias a través del análisis del esputo.
Métodos utilizados
- Realizar espirometría para evaluar la función pulmonar basal.
- Administrar broncodilatadores para prevenir el broncoespasmo durante la inducción.
- Inducir el esputo usando solución salina hipertónica y nebulización.
- Procesar muestras de esputo para conteos diferenciales de células y recolección de sobrenadante.
Principales resultados
- Recolección exitosa de muestras de esputo para análisis.
- Metodología detallada para el procesamiento del esputo descrita.
- Evaluación de la viabilidad y concentración celular lograda.
Conclusiones
- La técnica de inducción de esputo es efectiva para la recolección no invasiva de muestras.
- El procesamiento adecuado del esputo es crucial para un análisis preciso.
- Este protocolo puede ayudar en la investigación y diagnóstico clínico de enfermedades respiratorias.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Sputum induction and processing provide a non-invasive method for collecting airway cells and supernatant, enabling mechanistic studies of inflammatory pathways in respiratory diseases. This approach supports target validation by delivering quantitative cellular and biochemical data from the lung microenvironment, which is critical for de-risking hypotheses in asthma, COPD, and fibrosis research. The technique enhances predictive confidence in preclinical models by bridging clinical sample analysis with functional target interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying immune cell populations (neutrophils, eosinophils, macrophages, lymphocytes, epithelial cells) in airway lumen.
- Operational Value: Provides reproducible differential cell counts and viability assessments using standardized hemocytometer and trypan blue exclusion methods.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking through analysis of sputum supernatant for mediators and cellular components for flow cytometry, genomics, or proteomics.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Prepares validated biological systems (cell suspension and supernatant) for downstream assays with defined processing steps including DTT mucolysis and centrifugation.
- Scientific Value: Delivers quantitative outputs such as cell concentration (target: 500,000 cells/mL) and viability percentage, enabling assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Facilitates screening readiness through supernatant storage at -80°C for biomarker analysis and cell concentrator use for slide preparation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery to preclinical continuity by analyzing inflammatory cell profiles in disease-relevant systems (asthma, COPD, pulmonary fibrosis).
- Operational Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions via quality control thresholds (e.g., <80% squamous cells) to ensure sample suitability for cytospin and downstream analysis.
- Scientific Value: Highlights translational biomarker alignment by enabling measurement of biochemical markers in supernatant and cellular phenotypes linked to disease mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, supporting airway inflammation analysis and biomarker-enabled target prioritization in respiratory disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying cell types and mediators in induced sputum, reflecting airway inflammatory status.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized processing: DTT dilution (6.5 mM), trypan blue staining (0.08%), centrifugation (800 g and 550 g), and cell concentration adjustment to 500,000 cells/mL.
- Analytics: Enables comparative analysis via differential cell counting (neutrophils, eosinophils, etc.), viability assessment, and supernatant collection for biochemical marker measurement.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant cell profiling in asthma, COPD, and fibrosis, supporting biomarker alignment and mechanism validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for longitudinal inflammatory monitoring and target validation across respiratory indications via standardized sputum induction and processing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through quantitative inflammatory profiling and reduction of mechanistic ambiguity in airway disease models.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via defined reagent concentrations (DTT 6.5 mM, trypan blue 0.08%), centrifugation parameters, and cell concentration targets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by providing early human-relevant inflammatory data from non-invasive sampling.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on reproducible cell differentials and supernatant biomarker levels indicating target engagement or pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in respiratory physiology, cell handling, and microscopic analysis for accurate spirometry, induction monitoring, and cell counting.
- Needs nebulization equipment, centrifuge (800 g and 550 g), hemocytometer, cytocentrifuge, and -80°C storage for supernatant preservation.
- Demands cross-team standardization of processing steps: DTT preparation avoiding air exposure, trypan blue dilution, saline selection based on post-bronchodilator FEV1, and timed mucolysis (20 min rocking).
- Involves adaptation considerations: saline tonicity (5% hypertonic or 9% isotonic) adjusted to patient FEV1, and processing modifications if cell pellet volume <5 mL (DPBS supplementation).
- Includes practical limitations: technical demand, time consumption, need for medical supervision, and sample exclusion if squamous cells >80% indicating oral contamination.
