Name: Metodología para la inducción de esputo y el procesamiento de laboratorio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Aprenda la técnica de inducción de esputo para medicina respiratoria usando solución salina hipertónica y nebulización. Este método no invasivo permite analizar células inflamatorias en asma, EPOC y fibrosis pulmonar.

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Este trabajo fue apoyado por el Hospital de la Universidad de Lieja (Liege de CHU). Reconocemos "Producciones de instantes" para la producción de vídeo. También reconocemos Cedric François, el paciente que apareció en la película.

Todos los métodos descritos en esta sección han sido aprobados por el Comité de ética de la Universidad Hospital de Lieja y todos sanos dieron consentimiento informado para la participación.
1 inducción de esputo
<ol>
	<li>Espirometría pre y post-broncodilatador
	<ol>
		<li>Realizar una espirometría (volumen expiratorio forzado en 1 segundo [FEV1] y maniobras de capacidad vital forzada [FVC]) según la sociedad americana torácica (ATS) / European Respiratory Society (ERS) criterios estándar12.</li>
		<li>Administrar 400 μg de salbutamol inhalado de un inhalador de dosis medida (MDI) a través de un dispositivo espaciador. Nota: En los adultos, los eventos adversos de salbutamol inhalado incluyen temblor y taquicardia13.</li>
		<li>Repetir espirometría (FEV1 y FVC maniobra) 15 min más tarde, según la ATS/ERS criterios estándar12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación del nebulizador ultrasónico Nota: El nebulizador debe bien limpiarse y desinfectarse antes de cada uso, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.<ol>
		<li>Llene la cámara del nebulizador con agua destilada hasta el nivel recomendado.</li>
		<li>Colocar una taza limpia en la cámara del nebulizador.</li>
		<li>Cubra la taza con la tapa correspondiente.</li>
		<li>Llene la Copa con cada 50 mL de solución salina hipertónica (5%) para un paciente con post-broncodilatador FEV1 &#62; 65% predicho o 50 mL de solución salina isotónica (0,9%) para un paciente con post-broncodilatador FEV1≤65% previsto.</li>
		<li>Añadir 1,75 mL de solución de sulfato de salbutamol (5 mg/mL) a la Copa.</li>
		<li>Conecte los tubos y las válvulas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Colección de nebulización y esputo Nota: Realice la técnica bajo supervisión médica.<ol>
		<li>Explicar el procedimiento al paciente.</li>
		<li>Pida al paciente que utilice un clip de la nariz.</li>
		<li>Encienda el nebulizador y seleccionar el nivel más bajo de aerosol y configuración de ventilador.</li>
		<li>Pida al paciente que inhale el aerosol a través de la boquilla con la respiración de marea durante 5 minutos. Nota: Aerosol y configuración de ventilador puede incrementarse según la tolerancia del paciente.<ol>
			<li>En caso de tos insoportable o náuseas, suspender el procedimiento y vaya al paso 1.3.5.</li>
			<li>En caso de opresión en el pecho o malestar respiratorio, vaya al paso 1.3.8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Apagar el nebulizador.</li>
		<li>Pida al paciente que quite el clip de la nariz, enjuague su boca con agua y hacer gárgaras dos veces antes de descartarlo en el fregadero. Nota: Las células de la Saliva pueden contaminar la muestra de esputo y conducir a una muestra inutilizable.</li>
		<li>Pida al paciente que tose esputo en un recipiente de plástico.</li>
		<li>Realizar una espirometría (maniobra de espiración forzada) para medir VEF1.</li>
		<li>Evaluar la caída FEV1 como sigue: (VEF1 medida en paso 3.8 [mL]) - (post-broncodilatador FEV1 medido en el paso 1.3 [mL]) / (posterior al broncodilatador FEV1 medido en el paso 1.3 [mL]) * 100.<ol>
			<li>Si el FEV1 cae en 20% o más del valor posterior al broncodilatador, suspender el procedimiento. Medir VEF1 otra vez 10 minutos más tarde. Si el FEV1 cae 20% o más, pregunte al médico administrar bromuro de ipratropio nebulizado (0.25 mg/2 mL) y mantener al paciente bajo observación médica. Vaya al paso 1.3.10.</li>
			<li>Si VEF1 no baja de 20% o más del valor posterior al broncodilatador, repita los pasos del 3.2 a 3.9 una a tres veces para alcanzar un tiempo total de nebulización de 10 a 20 minutos. Nota: El tiempo de nebulización total dependerá de la calidad (presencia de tapones o viscoso) y cantidad de la muestra de esputo. Si después de 10 min de nebulización es pobre la calidad de la muestra o la cantidad, el procedimiento debería extenderse para alcanzar un tiempo de nebulización total de 15 a 20 minutos.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Mantener la muestra de esputo refrigerada hasta el procesamiento.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. esputo procesamiento
Nota: Procesar el esputo dentro de 3 horas de muestreo para viabilidad celular óptima.
PRECAUCIÓN: Use una bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras.
<ol>
	<li>Preparaciones preliminares
	<ol>
		<li>Hacer una dilución de 10 veces de la solución de la dithiothreitol concentrado (mucolítico) con agua destilada estéril para obtener 10 mL de una solución de 6.5 mM, con arreglo a las instrucciones del fabricante. Nota: Para evitar la solución de Ditiotreitol concentrado mezclado con aire ambiente, retirar la solución del frasco con una jeringa y aguja estériles. Una vez abierto, el frasco de la solución concentrada debe mantenerse a temperatura ambiente y utilizarse dentro de 5 días. La solución diluida es preparada diariamente. PRECAUCIÓN: Debido a peligro de irritación de ojos y la piel, use equipo de protección (ropa, guantes y gafas).</li>
		<li>Hacer una dilución de la solución de azul de tripán (0.4%) de 5-fold con de Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) para obtener una solución de 0.08%. Mantener esta solución diluida a temperatura ambiente y usar dentro de 2 semanas. PRECAUCIÓN: Debido a riesgos cancerígenos, use equipo de protección (ropa, guantes y gafas).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Colección de sobrenadante de esputo
	<ol>
		<li>Transferencia del esputo entero en un tubo de plástico de fondo cónico de 50 mL y pesar la muestra.</li>
		<li>Añadir un 3-fold peso de solución DPBS.</li>
		<li>Vórtice lentamente la muestra durante 30 s.</li>
		<li>Centrífuga a 800 x g y 4 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Filtrar la muestra a través de 2 capas individuales de gasa estéril y recoger el sobrenadante en un tubo de plástico de fondo cónico de 50 mL.</li>
		<li>Alícuotas del sobrenadante en plástico de 2 mL tubos y almacenar a-80 ° C. Nota: Muestras sobrenadante son útiles para análisis de componentes de la fase fluida de esputo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Esputo Mucolysis
	<ol>
		<li>Si es necesario, añadir DPBS al precipitado de células para alcanzar un volumen total de suspensión de 5 mL.</li>
		<li>Diluir la suspensión celular con 1 volumen de 6,5 mM Ditiotreitol. Utilizar un eje de balancín de banco a la suspensión celular por 20 min a temperatura ambiente.<ol>
			<li>Repetir al menos 3 veces con DPBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Centrifugue la suspensión de células diluidas en 550 x g y 4 ° C durante 10 minutos.</li></ol></li></ol>Deseche el sobrenadante.
		<li>Resuspender el precipitado de células en aproximadamente 1 mL de DPBS.</li>
	
	
	<li>Evaluación de las propiedades cualitativas de la muestra de esputo (concentración de células, células escamosas contaminación y viabilidad por el método de exclusión del azul tripán) por cuenta de hemocitómetro
	<ol>
		<li>Evaluar y registrar el volumen exacto de la suspensión de células.</li>
		<li>Añadir 50 μl de la suspensión celular a 50 μl de la solución de azul de tripán 0.08% y homogeneizar.</li>
		<li>Coloca la muestra bajo el cubreobjetos de un hemocitómetro (cámara Thoma) y colóquelo debajo del microscopio óptico (400 X).</li>
		<li>Contar las células escamosas, las vida no escamosa células (incoloro) y las células muertas no escamosas (células de color azul). Nota: En caso de densidad celular demasiado baja o demasiado alta, concentrar o diluir la suspensión de células y repetir pasos 2.4.1-2.4.3.</li>
		<li>Evaluar la concentración celular de la suspensión, el porcentaje de células escamosas y el porcentaje de viabilidad de células no escamosas. Nota: Calcular el total células no escamosas cuenta/g de esputo: célula de concentración de la suspensión (paso 5.4) * volumen de la suspensión celular (paso 4.8) * % de células no escamosas / peso de la muestra de esputo (paso 2.2.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación de un cytospin teñido se deslice con la suspensión celular y almacenamiento de células residuales, si es necesario Nota: Si la suspensión de células contiene más del 80% escamoso las células, la muestra se considera pobre calidad e inadecuado para un cytospin diapositiva14. En ese caso, interrumpir el tratamiento y considerar esta muestra fracasada.<ol>
		<li>Diluir una alícuota de la suspensión celular con DPBS para obtener por lo menos 350 μl de una suspensión de 500.000 células/mL.</li>
		<li>Montar el concentrador de células según las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Llene cada uno de los 3 compartimentos del concentrador de células con 100 μl de esta suspensión celular.</li>
		<li>En una Citocentrifuga, spin de 2 min a 150 x g y temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Desmontaje del concentrador de células según las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Seque el portaobjetos al aire. Nota: En esta etapa, las células residuales pueden almacenarse en un buffer adecuado si es necesario para otros experimentos.</li>
		<li>Mancha la diapositiva con una tinción comercial kit (ver la Tabla de materiales), según las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Montar el portaobjetos con un medio de montaje adecuado y un cubreobjetos.</li>
		<li>Colocar el portaobjetos al microscopio óptico (600 X) con inmersión de aceite.</li>
		<li>Contar por lo menos 500 células no escamosas: neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, linfocitos y células epiteliales. Nota: Recuento diferencial se realiza generalmente por uno solo o dos dedican y entrenados observadores para limitar las discrepancias interobservador.</li>
		<li>Registro de valores absolutos y porcentajes de cada tipo de célula.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum+cell+counts%3A+their+usefulness+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice.</a> European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).</li>
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<li>Louis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+processing+on+inflammatory+markers+in+induced+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum.</a> European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).</li>
<li>Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Biochemical+Analysis+of+Induced+Sputum+from+Asthmatic+and+from+Healthy+Subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects.</a> American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).</li>
<li>Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+inflammatory+indices+in+induced+sputum%3A+effects+of+selection+of+sputum+to+minimize+salivary+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination.</a> The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método de esputo inducido es una herramienta útil para estudiar el compartimiento de las vías respiratorias. Hay varias aplicaciones posibles de esta técnica. En primer lugar, pueden mejorar conocimientos sobre las células inmunes y mecanismos implicados en diversas enfermedades respiratorias. Por ejemplo, esta técnica ha permitido la investigación de la inflamación de las vías respiratorias en cohortes grandes de pacientes, y se ha demostrado que aproximadamente la mitad de los pacientes asmáticos se caracterizan por un anormal de la vía aérea inflamación eosinófila15, 16 , 17, mientras que los pacientes con EPOC generalmente exhiben un neutrófilo del esputo levantado cuenta18. Esta técnica también ha contribuido a la mejor caracterización de la inflamación de las vías respiratorias en pacientes con fibrosis pulmonar idiopática y a mediadores de evidencia que pueden contribuir a esta enfermedad19. En segundo lugar, la técnica de esputo inducido puede ser útil para predecir la respuesta al tratamiento. Por ejemplo, la presencia de un porcentaje anormal de los eosinófilos del esputo ha demostrado ser un marcador predictivo de corticosteroides respuesta11,18. En asma y EPOC, adaptando la dosis de corticosteroides para normalizar el porcentaje de eosinófilos del esputo mostró ser más eficaz en la disminución del número de exacerbaciones que ajustar el tratamiento según las guías clínicas actuales11 ,20,21. En tercer lugar, análisis de esputo pueden ayudar a desarrollar terapias dirigidas. Por ejemplo, la presencia de un número anormal de neutrófilos de esputo en algunos pacientes asmáticos y EPOC ha llevado al desarrollo de tratamientos antineutrophilic11. En cuarto lugar, la técnica puede desempeñar un papel en el diagnóstico. Por ejemplo, la presencia de eosinofilia del esputo es necesaria para hacer un diagnóstico de bronquitis eosinofílica no asmáticos11.
Además de obtener un recuento diferencial de células, la técnica de inducción de esputo también permite la realización de muchos análisis adicionales, mediante el estudio de esputo sobrenadante o las células del esputo. Con esputo sobrenadante por ejemplo el análisis de mediadores8,19,22 y la evaluación de la actividad quimiotáctica de la muestra para eosinófilos22. De las células del esputo, RNA puede ser extraído y utilizado para microRNA o expresión génica análisis19,23 . Las células del esputo también pueden ser analizadas por el flujo cytometry9,23 que permite, entre otros, immunophenotyping y clasificación de las células. Además, las células del esputo pueden ser cultivadas10, y su producción del mediador puede ser medido en vitro24. Cabe destacar en este caso, el contenido del mediador es diferente de lo que puede encontrar en el esputo sobrenadante. De hecho, mediadores en el sobrenadante del esputo pueden estar influenciadas por las secreciones de las células residentes de la vía aérea y por la exudación de plasma, al contrario el esputo cultivo celular modelo24. Por último, inmunocitoquímica y en situ el hibridación puede realizarse también mediante esputo células7.
La técnica de esputo inducido tiene algunas limitaciones. La inducción debe realizarse bajo supervisión médica. También es esencial para el operador para dar instrucciones completa a los pacientes. Otras limitaciones incluyen la cooperación y la condición médica de los pacientes, se necesitan esfuerzos respiratorios. Con respecto a la viabilidad de esta técnica en niños, varios estudios han reportado que fue exitoso y seguro en niños mayores de 6 años de edad25. Datos sobre los niños de &#60; 6 años de edad carecen de25, pero es probable que la inducción de esputo es difícil de realizar en los niños14. La técnica está actualmente restringida a servicios y centros especializados de investigación porque es técnicamente exigente, requiere mucho tiempo y requiere personal1. Otra limitación es que la técnica de inducción de esputo y análisis no siempre es exitosa, lo que significa que un cytospin legible no se obtiene siempre26. Sin embargo, la tasa de éxito suele ser alrededor 80% en diferentes cohortes de pacientes4,26,27,28,29. Por último, hay que tener cuidado al comparar a diferentes cohortes de pacientes con respecto a la coincidencia de edad, como se mostró al impacto el esputo celular cuenta30,31. Además, otros parámetros tales como los hábitos de tabaco y género tienen que ser emparejado como también puede interferir con el esputo celular cuenta29,32. Cuando no es posible que paciente, es otra manera de considerar edad, sexo o estatus de tabaquismo ajustar el análisis estadístico de estas características.
En comparación con otras técnicas que permiten recoger las células de las vías respiratorias, como las biopsias y lavados broncoalveolares, el método de esputo inducido tiene las ventajas de ser simple, bien tolerada, segura, reproducible, rentable y no invasivo. Estas ventajas permiten la técnica de esputo inducido a realizar a gran escala y en varias ocasiones con el tiempo y que sea una alternativa de elección para el muestreo de las vías respiratorias. Bronchosorption es otra técnica que permite la colección del líquido de revestimiento mucosa para evaluar vía aérea mediadores33. Si bien esta técnica (que requiere broncoscopia) es más invasiva que el esputo inducido, tiene las ventajas de evitar cualquier contaminación con saliva y la obtención de altas concentraciones de mediadores que en la de lavado broncoalveolar33.
Pasos críticos necesitan atención en el protocolo. En primer lugar, hay que tener cuidado con respecto a la concentración salina y el tiempo de inducción, porque estos dos parámetros pueden influir en los resultados y por lo tanto debe ser estandarizado34,35. En segundo lugar, la mucolysis con TDT es un paso importante del proceso. En comparación con PBS, TDT mostró mejor dispersar esputo células7, que mejora la calidad de la diapositiva de cytopsin y es esencial tener un celular reproducible cuenta2. Sin embargo, el agente mucolítico puede interferir con la medición de componentes bioquímicos.Clavar los experimentos debe entonces realizarse al medir un compuesto bioquímico nuevo36. Por último, otro paso fundamental del procedimiento es la célula contando paso, que debe realizarse por un técnico capacitado para obtener resultados fiables e interpretables.
Un método alternativo utilizando tapones de esputo (partes más densas o viscosa), en lugar del esputo todo, también es descrito en la literatura7. Ambas técnicas tienen ventajas y desventajas. La técnica de esputo todo permite más rápido procesamiento de7, pero con frecuencia está contaminada con saliva, la cual diluye la muestra y puede reducir la calidad de cytospins2,7. Con la técnica de selección de enchufe, se reduce la contaminación de saliva, lo que significa que las muestras suelen ser de mejor calidad para la dosificación de los mediadores de la fase fluida y de cytospin diapositivas7. El proceso es sin embargo más7 y enchufes seleccionados pueden no ser representante de los de toda la muestra37. También cabe señalar que no todas las muestras contienen los enchufes, que pueden ser limitante. Ambos métodos son validados y reproducibles, y actualmente hay pruebas de que el recuento diferencial de ambos estos métodos sean diferentes14,38.
En el futuro, esputo inducido podría utilizarse como una herramienta clínica para proporcionar biomarcadores para investigación, diagnóstico y tratamiento de todo tipo de enfermedades respiratorias inflamatorias.

Varios métodos se utilizan para investigar la inflamación de las vías respiratorias: dirigir medidas (como biopsias bronquiales o broncoalveolares) y métodos indirectos (como evaluación de la síntoma, pruebas de la función del análisis y del pulmón muestra de sangre)1. Las técnicas directas tienen la ventaja de evaluar confiablemente la inflamación de las vías respiratorias, pero son invasiva y no viable a gran escala debido a malestar del paciente y el riesgo incurrido1. En cuanto a los métodos indirectos, correlacionan mal con la evaluación directa de la vía aérea inflamación1.
Recogida de esputo es otra forma de las células de la muestra de las vías respiratorias y permite la evaluación directa de la inflamación de las vías respiratorias. Sin embargo, producir esputo espontáneamente puede conducir a las muestras de mala calidad y no es posible para todos los pacientes2. Este tema ha sido superado mediante el uso de solución salina hipertónica nebulizada mediante ultrasonidos para inducir la producción de esputo2. Este método fue utilizado inicialmente en los pacientes infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) para el diagnóstico de neumonía por Pneumocystis carinii neumonía3 y fue adaptado para sujetos sanos y asmáticos en 19924. Inducción de esputo es factible en pacientes más graves también mediante el uso de solución salina isotónica5. Aunque generalmente bien tolerado, la inhalación de solución salina puede causar broncoespasmo en pacientes con vías aéreas de hyperresponsive5. Por lo tanto, se recomienda administrar un agonista beta de acción corta antes el procedimiento1. Por otra parte, hemos demostrado previamente que añadir salbutamol en una solución salina en el nebulizador ultrasónico disminuyó aún más este riesgo6. Las ventajas de la inducción de esputo es que es invasiva2 y se toman las precauciones seguras cuando corresponda5.
Para el procesamiento de las muestras de esputo, dos métodos son utilizados actualmente en la literatura: la técnica de esputo todo y el enchufe de selección7. En nuestro laboratorio, se realiza la técnica de esputo todo. El objetivo principal de procesamiento del esputo es obtener un conteo diferencial para estudiar el tipo de inflamación presente en el lumen de las vías respiratorias. Sin embargo, muchos análisis adicionales también son posibles investigar procesos inflamatorios y mecanismos inmunitarios, ya sea mediante el estudio de mediadores en el sobrenadante del esputo8 o al realizar la investigación detallada de las células del esputo (p. ej. , flujo cytometry9, de las culturas de célula10, genómica10, proteómica10, inmunocitoquímica7, en situ hibridación7, etc.)
La técnica de inducción de esputo y análisis actualmente está limitada a la investigación de servicios y centros especializados en la práctica clínica ya que es técnicamente exigente, requiere mucho tiempo y requiere personal1. Inflamación de las vías respiratorias puede investigarse con este método para varias enfermedades respiratorias como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), tos crónica o fibrosis pulmonar idiopática11.

<table><tbody><tr><td>Espirómetro - Spirobank</td><td>MIR Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salbutamol MDI - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0135-913</td><td>Ver medicamento disponible en el país</td></tr><tr><td>Nebulizador UltraNeb</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>UltraNeb U3000</td><td></td></tr><tr><td>Devilbiss UltraNeb Vasos Desechables & Tapas</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>100HD-647</td><td></td></tr><tr><td>DeVilbiss Filtro bacteriano para nebulizadores UltraNeb</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>1001005879</td><td></td></tr><tr><td>Válvulas unidireccionales</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41664</td><td></td></tr><tr><td>Válvulas unidireccionales</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41665</td><td></td></tr><tr><td>Conector en T de aerosol&nbsp;</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41077</td><td></td></tr><tr><td>Circuito de ventilación monobrazo corrugado</td><td>Int'Air Medical France</td><td>TA30A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5 %&nbsp;</td><td>/</td><td>/</td><td>Producido por nuestra farmacia hospitalaria</td></tr><tr><td>Mini-Plasco NaCl 0.9%</td><td>B.Braun Medical&nbsp; Diegem Bélgica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de salbutamol 5 mg/mL - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0094-987</td><td>Ver medicamento disponible en el país</td></tr><tr><td>Bromuro de ipratropio 0,25 mg/2 mL - Atrovent</td><td>Boehringer Ingelheim Alemania</td><td>CNK: 1543-305</td><td>Ver medicamento disponible en el país</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>LONZA Bélgica</td><td>BE17512F</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de esputolisina</td><td>Calbiochem</td><td>56000</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripán al 0,4% 100 mL</td><td>LONZA Bio Whittaker Belgium</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro - Thoma chamber</td><td>Labor Optik Lancing UK</td><td>1500000</td><td></td></tr><tr><td>Hemacolor Stainig set</td><td>Merck Bélgica</td><td>1116610001</td><td>Producto alternativo&nbsp; : Diff Quik Staining Set &nbsp; Diagnóstico de Medion&nbsp;</td></tr><tr><td>Medio de montaje - Entellan</td><td>Merck Belgium</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Statspin Cytofuge 12&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Bélgica</td><td>X00-003066-001</td><td></td></tr></tbody></table>

metodología para la inducción de esputo y el procesamiento de laboratorio

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

La técnica de inducción de esputo y el procesamiento es un reconocido método no invasivo que permite la recolección y análisis de las células de las vías respiratorias, que es interesante en varias enfermedades respiratorias como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), tos crónica o fibrosis pulmonar idiopática. Esta técnica es bien tolerada, segura y no invasiva, pero actualmente está limitada a servicios de investigación y centros especializados en la práctica clínica ya que es técnicamente exigente, requiere mucho tiempo y requiere personal capacitado. La tasa de éxito de inducción de esputo y análisis es alrededor del 80%.
Aquí, describimos el proceso de inducción y de laboratorio de las muestras de esputo. Esputo es inducido por la inhalación de solución salina hipertónica o isotónica con salbutamol. Para el procesamiento, utilizamos la técnica de esputo todo. Ditiotreitol (DTT) se utiliza para permitir mucolysis de las muestras de esputo. El objetivo principal de procesamiento del esputo es obtener un conteo diferencial para estudiar los tipos celulares presentes en el lumen de las vías respiratorias. Se realizaron análisis adicionales en esputo sobrenadante y las células del esputo, que pueden permitir que más investigación en procesos inflamatorios y mecanismos inmunes. Los ejemplos incluyen estudio de mediadores en el sobrenadante del esputo y realizar una amplia gama de análisis en las células del esputo como citometría de flujo, genómica o proteómica.
Por último, se presentan resultados representativos del análisis de esputo en pacientes con EPOC, controles sanos y asmáticos.

Hemocitómetro Una imagen típica se muestra en la figura 1 que es visualizado con el microscopio utilizando el hemocitómetro. Las células escamosas son fácilmente identificables, ya que son mucho más grandes que las células no escamosas. Estas células escamosas son las células epiteliales de la boca. Ambos tipos de células se tiñen de azul tripán al muerto. Debe tenerse cuidado para evitar el conteo de levaduras, bacterias y desechos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig1.jpg"> 
Figura 1 : Hemocitómetro imagen mostrando (A) una vida no squamous de la célula, (B) un muerto squamous de la célula y (C) un squamous de la célula. Barra de escala = 50 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Cytospin diapositiva: la figura 2 muestra una imagen representativa de una diapositiva de cytospin obtenida después del procesamiento del esputo. Los diversos tipos celulares (neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, linfocitos y células epiteliales) se pueden distinguir por medio de su morfología y coloración. En algunos casos, la contaminación por células escamosas puede ser importante y, si es superior al 80% el porcentaje de células escamosas, la muestra se considera fracasada (figura 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig2.jpg"> 
Figura 2 : Imagen de diapositiva de Cytospin mostrando (A) un neutrófilo, (B) un macrófago, (C) un eosinófilo, (D) un linfocito y (E) una célula epitelial. Barra de escala = 20 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig3.jpg"> 
Figura 3 : Ejemplo de una diapositiva de cytospin de mala calidad con &gt; 80% de células escamosas. Barra de escala = 20 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tasa de éxito En nuestro departamento, la tasa de éxito del procedimiento (combinando una inducción exitosa y un cytospin legible), basado en una muestra de 1.129 pacientes (sujetos sanos, los asmáticos o pacientes con EPOC), es del 82% (924/1.129). En un subanálisis según el tipo de pacientes, la tasa de éxito es 75% (57/76) en sujetos sanos, 82% (827/1.004) en los asmáticos y 82% (40/49) en pacientes con EPOC.
Resultados en sujetos sanos En un análisis retrospectivo de una serie de 289 sujetos sanos de nuestro departamento, la mediana (rango intercuartil) peso de esputo fue 3,72 g (intervalo intercuartílico de 2,46 g - 5,54 g) y la células no escamosas total mediana cuenta/g de esputo 0,59 x (10)6 rango intercuartílico de 0,37 x 106 - 1.29 x 106).
En los sujetos sanos, la proporción de células escamosas es baja 19% (10% - 34%) y la viabilidad es alta, 66% (54-78%). Sobre el porcentaje de los diferentes tipos de células, los resultados se resumen en la Figura 4A. Podemos observar que el porcentaje de macrófagos (49% [31-68%]) es mayor que el porcentaje de neutrófilos (34% [14-60%]), mientras que los porcentajes de linfocitos (2% [1-3%]), eosinófilos (0% [0% - 0%]) y las células epiteliales (4% [2-11%]) son bajas. Estos resultados son similares cuando los datos se expresan en valores absolutos (Figura 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig4.jpg"> 
Figura 4 : Resultados representativos de la cuenta diferencial de células observadas en sujetos sanos expresaron como porcentajes de (A) o (B) valores absolutos. Resultados se muestran como mediana (rango intercuartil). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
También es importante tener en cuenta que la edad de los pacientes. De hecho, una fuerte correlación está presente entre edad del paciente y la proporción de neutrófilos en las muestras de esputo (figura 5). Asimismo, al clasificar a los pacientes según grupos de edad de 10 años (figura 6), se observó un aumento significativo en el porcentaje de neutrófilo con el aumento de edad. Por lo tanto, esta variable debe ser considerada cuando se comparan resultados de diferentes cohortes, y hay que tener cuidado en la coincidencia de los sujetos.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig5.jpg"> 
Figura 5: Correlación entre edad y esputo el porcentaje de neutrófilos. Se calculó la correlación con el test de Spearman. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig6.jpg"> 
Figura 6: Evolución del porcentaje de neutrófilo según la categoría de edad. El valor de p del ANOVA fue &lt; 0.0001 para la comparación del porcentaje de neutrófilo entre clases de edad. Comparaciones múltiples se realizaron con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. Los valores de p se representan como sigue: * p &lt; 0.05, ** p &lt; 0.01, y *** p &lt; 0.001. Resultados se muestran como mediana (rango intercuartil). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Resultados en pacientes que sufren de enfermedades respiratorias La técnica de esputo inducido se utiliza comúnmente para evaluar el perfil celular inflamatorio en pacientes asmáticos.Esta técnica puede aplicarse también a pacientes que sufren de EPOC, una enfermedad respiratoria inflamatoria. Cuando se comparan sujetos sanos, asmáticos y pacientes con EPOC (3 grupos siendo emparejados por edad, sexo y hábitos de tabaco), observamos que el perfil celular inflamatorio es muy diferente entre estas cohortes (figura 7). De hecho, pacientes asmáticos generalmente caracterizan por eosinófilos del esputo levantado, mientras que la proporción de neutrófilos de esputo es generalmente mayor en pacientes con EPOC en comparación con controles sanos, que depende de la severidad de la enfermedad.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig7.jpg"> 
Figura 7 : Perfil de célula inflamatoria esputo de sujetos sanos (n = 45), los pacientes asmáticos (n = 108) y pacientes con EPOC (n = 54). Los tres grupos fueron emparejados por sexo, edad y hábitos de tabaco. Los valores de p del ANOVA fueron &lt; 0,05 &lt; 0.0001, y &lt; 0.0001 para la comparación de los neutrófilos, eosinófilos y macrófagos entre grupos, respectivamente. Comparaciones múltiples se realizaron con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. Los valores de p se representan como sigue: * p &lt; 0.05 y *** p &lt; 0.001. Resultados se muestran como mediana (rango intercuartil). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí describimos la técnica de inducción de esputo. Este protocolo también explica el proceso para realizar un conteo diferencial y recoger sobrenadante de esputo esputo y las células para su posterior análisis.

Metodología para la inducción de esputo y el procesamiento de laboratorio

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

La técnica del esputo inducido se desarrolló a principios de los años 90. La técnica se propuso para investigar nueva información sobre la enfermedad obstructiva de las vías respiratorias como el asma y la EPOC y, más recientemente, también ha habido interés en buscar nueva información sobre la fibrosis pulmonar. La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente no invasiva a diferencia de la broncoscopia.El procesamiento requiere trabajo de laboratorio y lleva tiempo, por lo que es bastante exigente, requiere mucho tiempo y requiere cierta experiencia en el laboratorio, por lo que es claramente una técnica difícil de obtener en todos los centros. La técnica de esputo inducido se compone de dos partes, la primera parte es la inducción y la segunda parte es el procesamiento. Antes de inducir el esputo, debemos realizar una espirometría, que es una valoración del volumen y el caudal que el paciente es capaz de producir.Y necesitamos hacer eso porque la inducción de esputo por sí sola puede causar bronquioespasmo, por lo que es absolutamente necesario conocer el valor basal de la espirometría de los pacientes. Así que primero realizamos una espirometría, luego les damos broncodilatadores a los pacientes, generalmente les damos 400 microgramos de salbutamol, para abrir al máximo las vías respiratorias de los pacientes, y también para prevenir un bronquioespasmo que pueda ocurrir durante la fase de inducción. Y después de 15 minutos, volvemos a medir la espirometría, para tener lo que llamamos el valor basal de la espirometría, y en particular observamos el FEV1, que es el volumen que el paciente es capaz de exhalar en un segundo.Vierta agua destilada en la cámara del nebulizador hasta el nivel recomendado. Coloque una taza limpia en la cámara del nebulizador. Cubra la tapa llena con la tapa adecuada.Llene el vaso con 50 ml de solución salina hipertónica al 5 % si el FEV1 post-broncodilatador es superior al 65 % previsto, o 50 ml de solución salina isotónica al 9 % si el FEV1 post-broncodilatador es inferior al 65 % previsto. Agregue 1,75 de solución de sulfato de salbutamol a una concentración de cinco miligramos por ml a la taza. Conecte los tubos y las válvulas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.La técnica debe realizarse bajo supervisión médica. Explique el principio de la prueba al paciente. Pídale al paciente que use una pinza nasal.Encienda el nebulizador y seleccione el nivel más bajo de aerosol y la configuración del ventilador. Pida al paciente que inhale el aerosol a través de la boquilla con respiración tidal tidal. El nivel de aerosol y el ajuste del ventilador pueden aumentarse dependiendo de la tolerancia del paciente.En caso de opresión torácica o molestias respiratorias, detener el procedimiento y realizar una espirometría para medir el valor de FEV1 del paciente. Después de los cinco minutos de inhalación, o en caso de tos o náuseas, detenga el nebulizador. Pida al paciente que se quite la pinza nasal, que se enjuague la boca y haga gárgaras dos veces con agua del grifo, y que deseche esta agua en el fregadero.Luego, como el paciente tose el esputo y escupe lo que sale de la garganta en un recipiente de plástico. Realizar la primera maniobra respiratoria para medir el FEV1. Después de cada tentativa de producción de esputo, medimos el valor de FEV1.Si el valor del FEV1 baja más de un 20%, detenemos el procedimiento y le damos al paciente la nebulización de bromuro de ipratropio, que es un anticolinérgico que actuará en combinación con los agonistas beta-dos que ya hemos administrado durante el procedimiento. Si el valor del FEV1 no disminuye en más del 20%, realizamos el procedimiento durante un tiempo total de 10 a 20 minutos de acuerdo con la calidad y el volumen de esputo producido por el paciente. Una vez que obtenga la muestra de esputo, guárdela en el refrigerador hasta que se procese.Así que la segunda parte consiste en el procesamiento del esputo, y para ello, primero tenemos que preparar las dos soluciones que vamos a utilizar para este procesamiento. Así que tenemos que preparar el Ditiotreitol también conocido como DTT. La solución debe prepararse diluyendo el DTT con agua estéril para obtener una solución de 6,5 milimolares.Por lo que hay que evitar exponer la TDT al aire ambiente, y para ello utilizamos una jeringa y una aguja. En segundo lugar, hay que preparar la solución de azul de tripano, y para ello hay que hacer una dilución de DPBS con azul de tripano, para obtener una solución de 0,08%Por lo que respecta al esputo, hay que transferir todo el esputo en un tubo de plástico de fondo cónico de 50 ml, y pesar la muestra. Agregue un peso tres veces mayor de la solución DPBS.Agite lentamente la muestra durante 30 segundos, centrifugar a 800 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante en un tubo de plástico de fondo cónico de 50 ml, después de la filtración a través de dos capas individuales de gasa estéril. Asigne el sobrenadante en tubos de plástico de 2 ml y guárdelo a menos 80 grados centígrados.Nótese que las muestras de sobrenadante nos son útiles como componente trifásico del esputo. Si el volumen de la paleta de celdas es inferior a 5 ml, agregue DPBS para alcanzar un volumen de 5 ml de suspensión de celdas. Diluir la suspensión celular con un volumen de DTT a 6,5 milimolares.Meca la suspensión de la celda durante 20 minutos a temperatura ambiente con un trabajador de banco. Diluya la suspensión celular al menos tres veces con DPBS. Centrifugar la suspensión celular diluida a 550 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Deseche el sobrenadante. Suspenda la paleta de celdas en aproximadamente un ml DPBS. Evalúe y registre el volumen exacto de la suspensión celular.Añadir 50 microlitros de suspensión celular a 50 microlitros de la solución diluida de azul de tripano y homogeneizar. Coloque la muestra debajo de la cubierta de un citómetro hemocil y colóquela bajo un microscopio óptico. Evaluar la concentración celular de la suspensión celular, el porcentaje de células escamosas y el porcentaje de viabilidad de las células no escamosas.Diluir una porción de la suspensión con DPBS para obtener al menos 350 microlitros de suspensión celular a 500, 000 celdas por mL. Ensamble el concentrador de celdas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Agregue 100 microlitros de la suspensión celular en cada uno de los tres compartimentos del concentrador de celdas.Centrifugar dos minutos a 150 g a temperatura ambiente en una citocentrífuga. Deseche el sobrenadante. Deje que el portaobjetos se seque al aire.Tiña el portaobjetos con div quick o con un kit de tinte de valencia de níquel de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Montaje con un medio de montaje y un cubreobjetos. Coloque el portaobjetos bajo el microscopio óptico con inmersiones en aceite.Cuente al menos 500 células no escamosas, los neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, linfocitos y células epiteliales, y registre los valores absolutos y el porcentaje y el tipo de célula. En cuanto a los resultados, utilizando el hemocitómetro, tenemos que contar las células vivas no escamosas que no están coloreadas. También, las células muertas no escamosas que están coloreadas en azul.Y las células escamosas. Estas células son células epiteliales que provienen de la boca. Son grandes, por lo que son fáciles de reconocer en comparación con las pequeñas células humanas.Por lo tanto, debe evitar también contar bacterias, levaduras o desechos. Si la suspensión celular contiene más del 80% de células escamosas, esta muestra se considera de mala calidad y no adecuada para un portaobjetos de citospin. Por lo tanto, esta muestra se considera fallida.El recuento del citospin teñido se realiza según el color de las células y su morfología. Los neutrófilos, la característica principal es el núcleo multilobulado que hace que las células sean fáciles de identificar. Estas células son redondas, pequeñas y de color rosa neutro.Los eosinófilos, estas células están compuestas por gránulos rojos, fáciles de identificar. El tamaño de estas células es similar al de los neutrófilos. Los macrófagos, son de dos a cinco veces más grandes que los neutrófilos, y están coloreados en azul.El citoplasma puede contener restos y vacuolas. Los linfocitos, estas células son redondas y pequeñas, de color azul, y poseen un núcleo grande y denso. Las células epiteliales tienen forma columnar, son de color rosa y, a menudo, presentan cilios en la parte superior.Estos son algunos ejemplos de muestras de citoespín ilegibles con más del 80% de células escamosas. Creo que es una técnica muy útil, sin embargo, hay que tener mucha precaución porque la inducción del esputo debe hacerse bajo supervisión médica, pero la técnica de la inducción del esputo te da mucha información sobre el estado inflamatorio de los pacientes en las vías respiratorias. Puede permitirle medir diferentes marcadores bioquímicos en el sobrenadante, y también puede medir diferentes cosas en las partes celulares, por lo que el esputo inducido le permite realizar citometría de flujo, proteómica, transcriptómica e incluso genómica.

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