Name: Determinación de la interacción tripartita entre dos monómeros de un factor de transcripción MADS-box y una proteína sensora de calcio mediante ensayo BiFC-FRET-FLIM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 34 s
Description: Aprende a detectar interacciones tripartitas entre proteínas en células vegetales vivas mediante BiFC-FRET-FLIM en hojas de Nicotiana benthamiana. Este método cuantifica complejos proteicos con eficiencias de FRET del 55-56%.

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NB, GG, SB, KC agradecen sinceramente a la Comisión de Becas Universitarias (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE y el Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR) por sus becas de investigación. Afortunadamente, agradecemos al Departamento de Biotecnología (DBT), al Gobierno de la India, al Departamento de Ciencia y Tecnología (DST-FIST), al Gobierno de la India por su apoyo financiero.

1. Clonación de genes en vectores de entrada y destino (Figura2)
<ol><li>Amplificar la secuencia codificante (CDS) de los genes de interés (genes M y C en nuestro caso) mediante PCR y clonarlos en vectores de entrada apropiados (por ejemplo, vector pENTR/D-TOPO; ver Tabla 1 para los vectores utilizados en este experimento).</li>
	<li>Cultive los clones en placas que contengan antibióticos. Validar clones que se seleccionan en los antibióticos por restricción de digestión y secuenciación de ADN22,23.</li>
	<li>Movilizar los CDS reconstituidos de los clones de entrada a los vectores de destino (pSPYNE-35S, pSPYCE-35S, pSITE-1CA y pSITE-3CA) y confirmar la transferencia de secuencias desde la entrada a los vectores de destino por digestión enzimática de restricción. NOTA: Todos los vectores utilizados en este experimento se enumeran en la Tabla 1.</li>
	<li>Finalmente, transformar las celdas de Agrobacterium GV3101 (pMP90 (GentR))con los vectores de destino por electroporación (Figura 3)24.</li>
</ol>2. Condiciones de crecimiento para las plantas de Nicotiana benthamiana
NOTA: Cultive plantas de Nicotiana hasta la etapa de 4-6 hojas en condiciones de control.
<ol><li>Para cultivar plantas de Nicotiana, prepare la mezcla de suelo mezclando mezclas de suelo disponibles comercialmente con cocopeat y compost en una proporción de 2: 1: 1.</li>
	<li>Extienda una capa de 1 pulgada de espesor de esta mezcla de suelo en una bandeja de plástico para hacer el lecho de suelo y saturarlo con agua desionizada. Espolvorea alrededor de 200 semillas en este lecho de suelo.</li>
	<li>Transfiéralo a una bandeja más grande que contenga 1 cm de agua estancada. Cubra esta bandeja con una envoltura de plástico para crear una cámara de humedad.</li>
	<li>Transfiera esta configuración a una cámara de crecimiento a 23 °C con 16 h de luz y 8 h de ciclo oscuro con 150-170 μmol/m2s de intensidad de luz.</li>
	<li>Después de dos semanas, transfiera las plántulas jóvenes a macetas pequeñas de 3-4 pulgadas que contengan una mezcla de suelo saturada de agua.</li>
	<li>Coloque estas macetas en bandejas de plástico y transfiéralas a la cámara de crecimiento durante cuatro semanas más.</li>
</ol>3. Preparar cepas bacterianas para la agroinfiltración
NOTA: Para la agroinfiltración, las cepas bacterianas deben ser recién subcultivadas y mezcladas junto con la cepa p19 de Agrobacterium en proporciones apropiadas.
<ol><li>Preparar placas de agar 2xYT que contengan rifampicina (100 μg/mL), gentamicina (25 μg/mL) y kanamicina (50 μg/mL) para Agrobacterium que albergue vector pSPYNE-35S y pSPYCE-35S. Para el vector pSITE que contiene cepa, use rifampicina (100 μg/ml), gentamicina (25 μg/ml) y espectinomicina (50 μg/ml).</li>
	<li>Rayar las cepas de Agrobacterium que contienen los plásmidos en estas placas utilizando bucles de inoculación estériles en una campana de flujo laminar.</li>
	<li>Incubarlos a 28 °C durante 48 h en la oscuridad.</li>
	<li>Comience este procedimiento inoculando la cepa Agrobacterium GV3101 que alberga construcciones BiFC y FRET (preparadas en vectores pSPYNE-35S, pSPYCE-35S y pSITE) a partir de placas rayadas en 10 mL de caldo 2xYT que contienen antibióticos apropiados (Rifampicina (100 μg / ml), gentamicina (25 μg / ml), kanamicina (50 μg / ml) o espectinomicina (50 μg / ml)).</li>
	<li>Además, iniciar un cultivo de cepa p19 de Agrobacteria inoculando 10 mL de caldo 2xYT que contenga rifampicina (100 μg/mL) y kanamicina (50 μg/mL). NOTA: se añade la cepa p19 para evitar el silenciamiento de los transgénicos.</li>
	<li>Cubra el matraz con un papel de aluminio y manténgalos en el agitador de la incubadora a 28 ° C y 170 rpm durante 16 h en la oscuridad.</li>
	<li>Después del crecimiento durante la noche, transfiera 1 ml de este cultivo a una cubeta desechable para medir la densidad óptica (O.D.) de los cultivos a 600 nm utilizando un espectrofotómetro.</li>
	<li>Mezclar los cultivos de las cepas apropiadas de BiFC y FRET partner que contengan cepas de modo que el O.D. final de cada cultivo sea de 0.5 y el de p19 sea de 0.3 en un volumen total de 2 mL.</li>
	<li>Para lograr estas proporciones, use la fórmula que se menciona a continuación: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62791/62791eq01.jpg"> ODobtenida = O.D. del cultivo medido a 600 nm Vcultura = Volumen de la cultura requerida ODfinal = 0,5 para constructos y 0,3 para p19 Vfinal = Volumen final para la infiltración, que es de 2 mL NOTA: Las combinaciones de constructo utilizadas en este estudio se especifican en la Tabla 2.</li>
	<li>Centrifugar los cultivos mixtos de Agrobacterium a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender el pellet en 2 mL de tampón de infiltración recién preparado (10 mM MES, 100 μM de acetosiringona y 10 mM MgCl2). Use un mezclador de vórtice para hacer una suspensión celular homogénea.</li>
	<li>Incubar los tubos que contienen células resuspendidas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 3 h.</li>
	<li>Mientras tanto, etiquete cada maceta con la mezcla de construcción con la que se va a infiltrar. Use dos plantas para cada mezcla de infiltración.</li>
	<li>Llene una jeringa sin aguja de 1 ml con la mezcla agrobacteriana. Presione suave pero firmemente la jeringa sobre el lado abaxial de la hoja completamente expandida mientras apoya la hoja desde el otro lado. Empuje suavemente el émbolo hasta que las soluciones se llenen en el área de la hoja equivalente a 2-3 veces la punta de la jeringa.</li>
	<li>Infiltrar hasta cuatro manchas en una hoja y 3-4 hojas por planta, como se muestra en la Figura 4. NOTA: Cambie los guantes o limpie los guantes con alcohol al 70% entre las muestras para evitar la contaminación cruzada.</li>
	<li>Transfiera todas las macetas a una bandeja e incube en una cámara de crecimiento en las mismas condiciones que se mencionan en el paso 2.</li>
	<li>Revise una pequeña parte de la hoja agroinfiltrada en diferentes puntos de tiempo utilizando un microscopio de fluorescencia. Cuando la fluorescencia de YFP y CFP sea detectable en las células, proceda al microscopio confocal para el ensayo BiFC-FRET FLIM. En este experimento, el análisis se llevó a cabo 3 días después de la agroinfiltración. NOTA: Establezca el período de incubación posterior a la agroinfiltración individualmente para cada promotor y combinación de genes para evitar la sobreexpresión de proteínas quiméricas utilizadas en el ensayo BiFC-FRET FLIM. La sobreexpresión de las proteínas asociadas puede conducir a interacciones falsas positivas.</li>
</ol>4. Prepare diapositivas para la visualización de fluorescencia
<ol><li>Cuando las plantas estén listas para la visualización, corte muestras de hojas cuadradas, a 5-8 mm de distancia de la herida de infiltración, y móntelas en agua destilada en toboganes limpios. NOTA: Para minimizar la fluorescencia de fondo, limpie las diapositivas con etanol al 80% seguido de agua destilada 3-4 veces, séquelas al aire y manténgalas en una lámina absorbente.</li>
	<li>Cubra la muestra de la hoja con una funda limpia y selle con un esmalte de uñas.</li>
	<li>Visualice estas muestras bajo un microscopio de barrido láser confocal.</li>
</ol>5. Análisis FRET-FLIM utilizando un microscopio de barrido láser confocal
NOTA: En este procedimiento, la base para determinar y cuantificar la interacción entre dos proteínas es la reducción de la vida útil de fluorescencia del socio donante de FRET sobre su interacción con el aceptor, que se utiliza para calcular la eficiencia de FRET. La complejidad en el caso de la interacción tripartita aumenta aún más porque el aceptor FRET, en este caso, no es una sola molécula sino un par YFP-BiFC dividido, que primero debe reconstituirse in vivo para convertirse en un fluoróforo aceptor FRET funcional. Para llevar a cabo FRET-FLIM, es necesario determinar la vida útil de fluorescencia de la molécula donante, primero solo y luego en presencia de un socio FRET.
<ol><li>Abra la aplicación FLIM en el microscopio de barrido láser confocal, inicie la consola y utilice el conteo de fotones de reconocimiento de patrones para medir la vida útil de la fluorescencia. Seleccione el modo de medición estándar 'Conteo de todos los fotones'.</li>
	<li>Analizar muestras de dos tipos de plantas agroinfiltradas: una solo con el donante (C-CFP) y la otra con el donante y el aceptor (C-CFP, junto con M-YFP) ambos. NOTA: Debido a que la interacción de la proteína M ya ha sido validada con la proteína C utilizando BiFC e Y2H, se espera una buena eficiencia FRET con este par que interactúa.</li>
	<li>A continuación, escanee la hoja agroinfiltrada C-CFP y concéntrese en una célula que muestre buena fluorescencia CFP. Inicie el modo de escaneo láser y configure el sistema para la visualización CFP y las mediciones FLIM (láser de pulso λex 440 nm, λem 480-520 nm por detectores híbridos, velocidad de escaneo 512 x 512 píxeles a 400 Hz).</li>
	<li>Ajuste el enfoque, el zoom y la ganancia inteligente para enfocar el área que necesita ser capturada.</li>
	<li>Ilumine la muestra a suficiente potencia láser para lograr la captura de aproximadamente 0,1 fotones por pulso. Para muestras con intensidad de fluorescencia variable, capture 50 fotogramas para recolectar los fotones adecuados necesarios para la medición de la vida útil. La PPC exhibe dos vidas de fluorescencia debido a su adaptación conformacional; por lo tanto, ajuste los datos utilizando el modelo de reconvolución n-exponencial manteniendo el valor de n igual a 2.</li>
	<li>En estos ajustes, el CFP muestra dos vidas útiles de 1.0 y 3.2 ns. Aquí el más alto, 3.2 ns, la vida útil se utiliza para todos los cálculos posteriores25,26.</li>
	<li>Para calcular la eficiencia de FRET utilizando FLIM, que es la medida del grado de interacción entre dos proteínas, tome una muestra de hoja que ha sido coinfiltrada con C-CFP y M-YFP. Busque una célula que exprese tanto C-CFP como M-YFP y confirme sus respectivos patrones de emisión ex ex excitandolos usando láser de pulso λex 440 nm, λem 480-520 nm y láser de luz blanca λex 514 nm con λem 526-550 nm. Escanee e identifique secuencialmente una célula que muestre fluorescencia cfp y YFP.</li>
	<li>Después de confirmar la fluorescencia de ambas proteínas, cambie a la consola FLIM para medir la vida útil de CFP utilizando la misma configuración que usamos anteriormente para medir la vida útil de C-CFP (paso 5.5). NOTA: Esta célula también está expresando M-YFP que potencialmente puede interactuar con C-CFP y causar una reducción en la vida útil de C-CFP.</li>
	<li>Ajustar la gráfica obtenida utilizando el modelo de reconvolución n-exponencial, con n = 2. Se observó una disminución en la vida útil de la PPC de 3,2 a 2,6 ns, lo que indica la transferencia de energía de resonancia de Förster entre la PPC y la YFP(Figura 5A).</li>
	<li>Ahora inicie la consola FRET en el software y calcule la eficiencia FRET ingresando manualmente la vida útil del donante no exprimida en la ecuación proporcionada en el software. Y la eficiencia FRET observada es: 56%.</li>
	<li>Interacción tripartita<ol>
<li>Finalmente, para visualizar las interacciones entre tres socios, tome la muestra de hoja de una planta que fue coinfiltrada con C-CFP, M-YFPn y M-YFPc.</li>
		<li>Escanee el explante de la hoja en busca de una célula que muestre tanto CFP como fluorescencia YFP reconstituida que emana de la interacción BiFC entre dos proteínas M. Utilice el mismo láser y longitudes de onda de emisión que se usaron anteriormente.</li>
		<li>Posteriormente, apague el láser de 514 nm y muévase a la consola FLIM. NOTA: Si el dímero M-YFP interactúa con C-CFP, se debe ver una reducción en la vida útil de C-CFP como se observa durante su interacción con M-YFP. Sin embargo, si el C-CFP no interactúa con el dímero M-YFP, su vida útil de fluorescencia debe permanecer en 3.2 ns.</li>
		<li>Utilizando configuraciones similares a las mencionadas anteriormente, mida la vida útil de la PPC en presencia de YFP reconstituida. Ajuste el gráfico obtenido utilizando el modelo de reconvolución n-exponencial, con n = 2, y muévase a la consola FRET. NOTA: Hay una disminución en la vida útil de la PPC de 3.2 a 2.3 ns. Calcule la eficiencia fret como se describió anteriormente. La eficiencia FRET calculada es del 55%. La reducción en la vida útil del donante y la buena eficiencia FRET del 55% confirma la interacción tripartita entre dos proteínas M y la proteína C in vivo (ver Figura 5B).</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Waadt, R., Kudla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+plant+visualization+of+protein+interactions+using+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

El presente protocolo demuestra el uso del ensayo FRET-FLIM basado en BiFC para determinar la formación de un complejo ternario entre dos monómeros de una proteína MADS-box y una proteína sensora de calcio. El protocolo está adaptado de un informe de Y. John Shyu et al. donde han desarrollado un método FRET basado en BiFC para visualizar el complejo ternario formado entre heterodímeros de Fos-Jun y NFAT o p65 utilizando el método de emisión sensibilizada7. Anteriormente, galperin y sus compañeros ...

Las interacciones proteína-proteína (IBP) forman la base del buen funcionamiento de las células eucariotas mediante la regulación de diversos procesos metabólicos y de desarrollo. Algunos IBP son estables, mientras que otros son de naturaleza transitoria. Las interacciones se pueden clasificar en función del número y tipo de miembros en la interacción, como diméricos, triméricos, tetrámeros homoméricos y heteroméricos1. La identificación y caracterización de las interacciones proteicas puede conducir a una mejor comprensión de las funciones proteicas y las redes reguladoras.
Los factores de transcripción son proteínas que están involucradas en las funciones reguladoras. Regulan la velocidad de transcripción de sus genes aguas abajo uniéndose al ADN. A veces, la oligomerización o formación de complejos de orden superior por proteínas es un requisito previo para llevar a cabo sus funciones2. Los factores de transcripción MADS-box de plantas son genes homeóticos que regulan diversos procesos como la transición floral, el desarrollo de órganos florales, la fertilización, el desarrollo de semillas, la senescencia y el desarrollo vegetativo. Se sabe que forman complejos de orden superior que se unen al ADN3,4. El estudio de las redes PPI entre los factores de transcripción y sus interactores proporciona información sobre la complejidad subyacente a la regulación transcripcional.
La expresión transitoria de proteínas en Nicotiana benthamiana ha sido un enfoque popular para estudiar la localización de proteínas o las interacciones proteína-proteína in vivo5. BiFC y FRET son métodos para estudiar las interacciones proteína-proteína in vivo utilizando sistemas de reportero fluorescente6. Se ha demostrado que una combinación de estas dos técnicas revela la interacción entre tres proteínas7. FreT se mide mediante fotoblanqueo aceptor, emisión sensibilizada y técnica de imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM). El ensayo FRET basado en FLIM ha surgido como una herramienta que proporciona cuantificación precisa y especificidad espaciotemporal a las mediciones de transferencia de energía entre dos moléculas en función de sus vidas de fluorescencia8. FLIM mide el tiempo que un fluoróforo permanece en un estado excitado antes de emitir un fotón y es mejor que las técnicas que utilizan medidas de intensidad solas9,10. Además de los sistemas heterólogos como Nicotiana benthamiana y las cáscaras epidérmicas de cebolla, informes más recientes han demostrado el uso de raíces de Arabidopsis y plántulas de arroz jóvenes, etc., para el análisis in vivo de las interacciones proteína-proteína en condiciones nativas11,12.
Además de un sistema de expresión adecuado, la selección de socios que interactúan para los ensayos BiFC y FRET también es crucial para el éxito de este experimento. El PPI entre los socios utilizados en la configuración de BiFC debe validarse utilizando los controles apropiados antes de su uso como socio conjugado en el experimento FRET13. BiFC utiliza la complementación estructural de las partes N- y C-terminal de la proteína fluorescente. Una limitación común en la mayoría, si no en todas, las proteínas fluorescentes utilizadas en los ensayos de BiFC ha sido el autoensamblaje entre los dos fragmentos derivados no fluorescentes, lo que contribuye a la fluorescencia falsa positiva y disminuye la relación señal-ruido (S / N)14. Los desarrollos recientes, incluidas las mutaciones puntuales o la posición de división de la proteína fluorescente, han dado lugar a pares biFC con mayor intensidad, mayor especificidad, alta relación S / N15,16. Estas proteínas fluorescentes también se pueden utilizar para llevar a cabo BiFC dependiendo de la idoneidad del experimento.
Tradicionalmente, CFP y YFP se han utilizado como el par donante y aceptor en experimentos FRET17. Sin embargo, se encontró que YFP o m-citrino son mejores donantes de FRET (cuando se usan con RFP como aceptor) debido al alto rendimiento cuántico (QY) durante la expresión nativa de proteínas objetivo en el sistema radicular de Arabidopsis. La selección de promotores (constitutivos versus nativos/endógenos) y fluoróforos también juegan un papel crucial en el diseño de un exitoso experimento BiFC-FRET-FLIM. Es esencial tener en cuenta que la eficiencia de los donantes fret y la idoneidad de los pares FRET tienden a cambiar con el cambio en el promotor y el sistema biológico que se utiliza para la expresión. El QY del fluoróforo, que se relaciona con su brillo, depende del pH, la temperatura y el sistema biológico en uso. Sugerimos que estos criterios se consideren a fondo antes de elegir el par de fluoróforos para el experimento FRET. El sistema biológico, los promotores y las proteínas utilizadas para este protocolo funcionaron bien con los fluoróforos CFP-YFP para el experimento BiFC FRET-FLIM.
En el presente estudio, incorporamos la característica de FLIM para visualizar la interacción entre tres moléculas de proteína utilizando FRET basado en BiFC. En esta técnica, dos proteínas se etiquetan con proteína YFP dividida y la tercera proteína con PPC. Dado que estábamos interesados en estudiar la interacción de un homodímero de proteína MADS-box (M) con una proteína sensora de calcio (C), estas proteínas fueron marcadas con proteínas fluorescentes en vectores pSITE-1CA y pSITE-3CA18. Dos de los socios que interactúan, en este ensayo, fueron etiquetados con partes N- y C-terminales del YFP en los vectores pSPYNE-35S y pSPYCE-35S19, y su interacción da como resultado la reconstitución del YFP funcional que actúa como aceptor fret para el tercer socio que interactúa, que está etiquetado con CFP (actuando como donante FRET) (Figura 1 ). En este caso particular, el PPI entre dos monómeros M y entre M y C ha sido validado mediante la realización de BiFC en tres sistemas diferentes junto con el sistema de levadura-dos-híbrido. Estos vectores fueron movilizados en la cepa Agrobacterium tumifaciens GV3101 por electroporación. La cepa GV3101 tiene un plásmido Ti desarmado pMP90 (pTiC58DT-DNA) con resistencia a la gentamicina20. Se añadió una cepa p19 Agrobacterium junto con todas las infiltraciones para evitar el silenciamiento detransgenes 21. Recomendamos que las tres proteínas también se utilicen en conformaciones opuestas para validar las interacciones tripartitas.
En esta técnica, hemos empleado FLIM, donde en primer lugar, la vida útil de fluorescencia del donante (vida útil del donante no exprimida) se mide en ausencia de un aceptor. Después de eso, su vida útil se mide en presencia del aceptor (vida del donante apagado). Esta diferencia en las vidas de fluorescencia de los donantes se utiliza para calcular la eficiencia de FRET, que depende del número de fotones que exhiben una reducción en la vida útil de la fluorescencia. A continuación se menciona un protocolo detallado para determinar la formación de un complejo ternario entre tres proteínas cualesquiera expresando transitoriamente las proteínas marcadas con fluorescentes en Nicotiana benthamiana y ensayando su interacción por BiFC-FRET-FLIM.

<table><tbody><tr><td>1 ml Jeringas sin agujas</td><td>Dispovan</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&nbsp; LR Clonasa II Mezcla de enzimas</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11791020</td><td>Los vectores utilizados en el estudio son: Gateway Basado en</td></tr><tr><td>Gentamicina Sulfato</td><td>Himedia</td><td>CMS461</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Kanamicina</td><td>Himedia</td><td>MB105</td><td></td></tr><tr><td>MES hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Clonación Kit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>K240020</td><td>Los vectores utilizados en el estudio son:</td></tr><tr><td>Phusion de alta fidelidad ADN polimerasa Taq</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>F530-S</td><td>Cualquier polimerasa de alta fidelidad puede funcionar</td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Himedia</td><td>CMS1889</td><td></td></tr><tr><td>SP8 FALCON Microscopio de barrido láser confocal</td><td>Leica</td><td>SP8 FALCON</td><td>Cualquier CLSM con capacidades FLIM se puede utilizar para esto análisis</td></tr><tr><td>Espectinomicina diclorhidrato pentahidratado</td><td>Himedia</td><td>TC034</td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de la interacción tripartita entre dos monómeros de un factor de transcripción mads-box y una proteína sensora de calcio mediante ensayo bifc-fret-flim

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Las interacciones proteína-proteína son una parte integral de todos los procesos biológicos en las células, ya que desempeñan un papel crucial en la regulación, el mantenimiento y la modificación de las funciones celulares. Estas interacciones están involucradas en una amplia gama de fenómenos como la transducción de señales, la respuesta a patógenos, las interacciones célula-célula, los procesos metabólicos y de desarrollo. En el caso de los factores de transcripción, estas interacciones pueden conducir a la oligomerización de las subunidades, secuestrando en contextos subcelulares específicos como el núcleo, el citoplasma, etc., lo que, a su vez, podría tener un efecto más profundo en la expresión de los genes aguas abajo. Aquí, demostramos una metodología para visualizar la interacción tripartita in vivo utilizando la Transferencia de Energía de Resonancia de Förster (FRET) basada en la Complementación de Fluorescencia Bimolecular (BiFC) que involucra Imágenes de Por Vida de Fluorescencia (FLIM). Dos de las proteínas seleccionadas para esta demostración interactúan como socios biFC, y su actividad de fluorescencia reconstituida se utiliza para ensayar FRET-FLIM con el tercer socio. Se han utilizado plantas de Nicotiana benthamiana cultivadas en cámaras de crecimiento de cuatro a cinco semanas de edad como el sistema de planta modelo para esta demostración.

Este protocolo representa un método optimizado para estudiar in vivo las interacciones tripartitas proteína-proteína en plantas. El principio básico del protocolo es combinar dos técnicas de interacción de proteínas marcadas con fluorescencia, es decir, BiFC y FRET, para crear un ensayo para medir la formación de complejos ternarios entre tres socios de proteínas. Aquí, hemos utilizado FLIM para medir la vida útil de fluorescencia del socio donante fret en presencia y ausencia del aceptor FRET. Se esperaba una r...

Aquí presentamos, un método para visualizar la formación de complejos ternarios entre tres socios de proteínas utilizando proteínas marcadas con fluorescentes mediante el ensayo FRET-FLIM basado en BiFC. Este método es valioso para estudiar los complejos de interacción proteína-proteína in vivo.

Determinación de la interacción tripartita entre dos monómeros de un factor de transcripción MADS-box y una proteína sensora de calcio mediante ensayo BiFC-FRET-FLIM

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

El estudio de las interacciones proteína-proteína proporciona una comprensión de la regulación de muchos procesos biológicos. Aquí demostramos un procedimiento descrito inicialmente por Y John shoe and co. Trabajadores en 2007, donde los autores han utilizado BiFC en combinación con FRET para validar la interacción tripartita entre tres moléculas de proteínas.Sin embargo, hemos incluido mediciones de la vida útil de la fluorescencia en este procedimiento para corroborar las mediciones de FRET. Para demostrar una interacción tripartita, hemos elegido una proteína, que se sabe homodimerizar. Además, también se ha validado internamente para interactuar con un sensor de calcio de proteína conocido como proteína C en este protocolo.Las proteínas MNC interactúan en el citoplasma. En esta técnica, dos proteínas se etiquetan con proteínas YFP divididas. Su interacción resulta en la restitución de YFP funcional que actúan como un aceptor de FRET para el tercer socio que interactúa, que se etiqueta con CFP que actúa como donante de FRET.Comenzar con la amplificación de las secuencias codificantes de los genes de interés que son genes M y C en nuestro caso mediante PCR y clonarlos en vectores de entrada apropiados. Validar clones que se seleccionan en los antibióticos que contienen placas por digestión de restricción y secuenciación de ADN. Movilizar los CDS reconstituidos de los clones de entrada a los vectores de destino.Todos los vectores utilizados en este experimento se enumeran en la tabla uno. Finalmente, transformar las células de agrobacterium GV3101 con los vectores de destino por electroporación. Aquí cultivamos plantas de Nicotiana Benthamiana todavía de cuatro a seis salen de etapa en condiciones controladas en una cámara de cultivo.Prepare la mezcla de suelo mezclando soilrita, turba de coco y compost en una proporción de 2: 1: 1. Extienda una capa de una pulgada de espesor de esta mezcla en una bandeja de plástico para hacer el lecho de tierra y saturarlo con un poco de agua. Espolvoree alrededor de 200 semillas sobre el suelo y transfiéralo a una bandeja más grande que aproximadamente un centímetro de agua estancada.Cubra esta bandeja con una envoltura de plástico para crear una cámara de humedad. Transfiera esta bandeja a una cámara de cultivo a 23 grados centígrados con 16 horas de luz y ocho horas de ciclo oscuro. Después de dos semanas, transfiera las plántulas jóvenes a macetas pequeñas de tres a cuatro pulgadas que contengan una mezcla de suelo saturado de agua.Coloque estas macetas en bandejas de plástico y transfiéralas a la cámara de cultivo durante cuatro semanas más. Para la agroinfiltración, las cepas bacterianas deben ser recién subcultivadas y mezcladas junto con la cepa P19 de agrobacterium en proporciones apropiadas. Comience este procedimiento inoculando cepas de agrobacterias GV3101 que contengan construcciones BiFC y FRET a partir de placas de rayas en 10 ml.al caldo que contiene antibióticos apropiados. Además, también se inicia un cultivo de la cepa P19 de agrobacterias, que se añade para evitar el silenciamiento de los transgenes. Cubra el matraz con papel de aluminio y manténgalos en un agitador de incubadora, colóquelo a 28 grados centígrados a 170 RPM durante 16 horas.Después del crecimiento durante la noche, transfiera 1 ml. de estos cultivos a un codo desechable para medir la densidad óptica a 600 nanómetros mediante el uso de un espectrofotómetro. Mezclar los cultivos de las cepas apropiadas de BiFC y FRET partner que contengan cepas de modo que el OD final sea de 0,5 Y el de P19 sea de 0,3 en un volumen total de 2 ml.Para lograr estas proporciones seguimos la fórmula que se muestra en la pantalla para estos cálculos. Centrifugar los cultivos mixtos de agrobacterias a 3000G durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar cuidadosamente el sobrenadante. Suspende los pellets en un 2 ml.búfer de infiltración. Es posible que tenga que usar un mezclador de vórtice para volver a suspender las células en una suspensión celular homogénea por completo. Después de esto, incube los tubos a temperatura ambiente en la oscuridad durante tres horas.Mientras tanto, etiquete cada maceta para la mezcla de construcción con la que se va a infiltrar. Llene una jeringa sin aguja de 1 ml. con la mezcla agrobacteriana.Presione suave pero firmemente la punta de la jeringa hacia el lado abaxial de una hoja completamente expandida mientras apoya la hoja desde el otro lado. Empuje suavemente el émbolo hasta que la solución se llene en el área de la hoja equivalente de dos a tres veces como la de la punta de la jeringa. Infiltrar la mezcla bacteriana en hasta cuatro puntos en una hoja y repetir este procedimiento durante tres a cuatro hojas para un tipo de infiltración.Además, incluya al menos dos plantas por construcción para la infiltración. Recuerde limpiarse las manos con alcohol al 70% o cambiarse los guantes para evitar cualquier contaminación cruzada. Transfiera todas las macetas a una bandeja e incube en la cámara de crecimiento en la misma condición de crecimiento.Revise una pequeña parte de la hoja agroinfiltrada con un microscopio de fluorescencia. Cuando la fluorescencia tanto de YFP como de CFP son detectables en las células, proceda al microscopio confocal para el ensayo BiFC FRET-FLIM. En nuestro caso, este análisis se realizó tres días después de la agroinfiltración.Ahora que las plantas están listas para ser visualizadas bajo un microscopio, corte muestras de hojas cuadradas de cinco a 8 mm. de distancia de la punta de la jeringa enrollada y móntelas en agua destilada. Coloque un resbalón de cubierta limpia sobre él y selle.Visualice estas muestras en un microscopio de barrido láser confocal. En este procedimiento, la base para determinar y cuantificar la interacción entre dos proteínas es la reducción de la vida útil de fluorescencia del socio donante fret sobre su interacción con el aceptor, que se utiliza para calcular la eficiencia de FRET. La complejidad en el caso de la interacción tripartita aumenta aún más porque el aceptor FRET en este caso no es una sola molécula, sino un par YFP BiFC dividido, que primero debe reconstituirse in vivo para convertirse en un fluoróforo aceptor FRET funcional.Para llevar a cabo FRET-FLIM, tenemos que determinar la vida útil de fluorescencia de las moléculas donantes, primero solas y luego en presencia de un socio FRET. Abra la aplicación FLIM en el microscopio de barrido láser confocal, inicie la consola y utilice el recuento de fotones de reconocimiento de patrones para medir la vida útil de la fluorescencia. Seleccione el modo de medición estándar de conteo de todos los fotones.Tomaremos dos tipos de plantas agroinfiltradas. Uno que tiene el gen CCFP y el otro que tiene CCFP junto con MYFP porque la interacción de la proteína M ya ha sido validada con la proteína C utilizando BiFC e Y2H, esperamos una buena eficiencia FRET con este par que interactúa. Ahora primero escaneamos la hoja agroinfiltrada CCFP y buscamos una célula que muestre buena fluorescencia CFP.La configuración del microscopio se muestra en la pantalla. La muestra se ilumina a una potencia láser suficiente para alcanzar aproximadamente 0,1 fotones por pulso. Para muestras con intensidad de fluorescencia variable, capturaremos 50 fotogramas para recolectar fotones adecuados necesarios para la medición de la vida útil.Como se sabe que la PPC exhibe dos vidas de fluorescencia debido a su adaptación confirmacional, alimentamos los datos utilizando un modelo de reconvolución exponencial mientras mantenemos el valor de N igual a dos. En estos ajustes, las dos vidas útiles son visibles a uno y 3,2 nanosegundos. Usaremos la vida útil más alta para todos los cálculos posteriores.Ahora estamos listos para medir FRET entre CCFP y MYFP. Para esto usemos la muestra de hoja de la planta agroinfiltrada con CCFP y MYFP. Buscamos una célula que exprese tanto CCFP como MYFP y confirmemos sus respectivos patrones de emisión excitándolos utilizando láser de pulso completo de 40 nanómetros y láser de luz blanca de 514 nanómetros.Después de eso, cambiamos a la consola FLIM para medir la vida útil de CFP utilizando la misma configuración que usamos anteriormente para medir la vida útil de CCFP. Pero esta vez la célula también está expresando MYFP que potencialmente puede interactuar con CCFP y causar una reducción en la vida útil de CCFP. Como hemos leído el gráfico obtenido utilizando el modelo de reconvolución exponencial N con N igual a dos, de hecho hay una disminución en la vida útil de CFP de 3,2 a 2,6 nanosegundos.Ahora iniciamos la consola FRET en el software y calculamos la eficiencia FRET ingresando manualmente la vida útil incuestionable en la ecuación proporcionada en el software y la eficiencia FRET observada es del 56% Ahora pasemos al paso final, es decir, visualizar la interacción entre tres socios. Para ello, tomamos la muestra de hoja de una planta que fue coinfiltrada con CCFP y MYFPN con MYFPC. Escaneamos la planta de la hoja en busca de una célula que muestre cfp y fluorescencia YFP reconstituida que emana de la interacción entre dos proteínas M.Utilizamos el mismo láser y la misma longitud de onda de emisión que se usaba anteriormente. Posteriormente, apagamos el láser de 514 nanómetros y pasamos a la consola FLIM. Si el dímero MYFP interactúa con CCFP.Deberíamos ver una reducción en la vida útil de CCFP como se observa durante su interacción con MYFP. Sin embargo, si el CCFP no interactúa con el dímero MYFP, su vida útil de fluorescencia debe permanecer observada a 3,2 nanosegundos. Utilizando la configuración similar a la mencionada anteriormente, medimos la vida útil de la PPC en presencia de YFP reconstituida.Ajustamos el gráfico usando el modelo de reconvolución exponencial N con un igual a dos y pasamos a la consola FRET. Y sí, hay una disminución en la vida útil de la PPC de 3,2 a 2,3 nanosegundos. Calculamos la eficiencia FRET como se describió anteriormente.La eficiencia FRET calculada es del 55% Aquí hemos utilizado FLIM para medir la vida útil de fluorescencia del socio donante FRET en presencia y ausencia del aceptor FRET. Se esperaba una reducción en la vida útil de fluorescencia del donante si había una interacción positiva entre las dos proteínas. En caso de control positivo, eso es CCFP y MYFP.Observamos una reducción en la vida útil de fluorescencia del donante de 3,3 a 2,5 nanosegundos y la eficiencia FRET fue del 56%Un ejercicio similar con YFP reconstituido resultó de la interacción entre dos amonómeros y proteínas C también resultó en una interacción FRET positiva que condujo a la reducción de la vida útil de fluorescencia del donante a 2,6 nanosegundos. La eficiencia FRET calculada fue de aproximadamente el 55% en este caso. La reducción en la vida útil de fluorescencia del donante FRET proporciona una fuerte evidencia de una interacción tripartita entre estas proteínas.El protocolo descrito aquí es una herramienta poderosa para determinar las interacciones tripartitas proteína-proteína en las células vivas. Este procedimiento también puede ayudar a determinar la localización intracelular de los complejos resultantes, lo cual es importante para descifrar la función y el significado fisiológico de cualquier complejo de proteínas. En conclusión, el ensayo FRET-FLIM basado en BiFC brinda la oportunidad de estudiar y caracterizar aspectos importantes de las interacciones tripartitas de proteínas, lo que puede ser útil en estudios de interacción proteína-proteína en sistemas animales y vegetales.

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Determinación de la interacción tripartita entre dos monómeros de un factor de transcripción MADS-box y una proteína sensora de calcio mediante ensayo BiFC-FRET-FLIM (Video) | JoVE Journal

Determinación de la interacción tripartita entre dos monómeros de un factor de transcripción MADS-box y una proteína sensora de calcio mediante ensayo BiFC-FRET-FLIM

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