Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios

Este procedimiento prueba la interacción proteica proteica in vivo entre dos reguladores de la transcripción de Arabidopsis, seus deletreado SEU, en abreviatura y lu holog o LUH. Mediante la utilización de la complementación de fluorescencia biomolecular, el SEUS se fusiona con el fragmento terminal final de una proteína fluorescente amarilla, o YFP, y LUH se fusiona con el fragmento terminal C de Y-F-P-D-N-A de las dos construcciones de plásmidos. Seuss, NYFP y L-U-H-C-Y-F-P se bombardean en células epidérmicas de cebolla para probar su interacción.

Una interacción entre Seuss y LUH provoca la asociación de los fragmentos terminales finales y terminales C de YFP en los núcleos, lo que conduce a la fluorescencia de YFP en los núcleos. Después de la incubación durante 16 a 20 horas en la oscuridad, las cáscaras epidérmicas de la cebolla se observan bajo un microscopio de fluorescencia para visualizar la fluorescencia. Hola, soy Courtney Hollander del laboratorio del Dr. Zhi Lu en el Departamento de Biología Celular y Genética Molecular de la Universidad de Maryland.

Hoy le mostraremos un procedimiento para probar la interacción proteína-proteína en células de cebolla utilizando la pistola genética BioRad Helios. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para probar las interacciones proteína-proteína y la localización de proteínas en células vegetales. Así que comencemos.

Para comenzar este procedimiento, prepare los cartuchos para la pistola genética Helios siguiendo el Protocolo de Video Joe de Woods y Zeto 2008 que demuestra en detalle el procedimiento de preparación de cartuchos para cada preparación de cartuchos. Se mezclan 50 microgramos de ADN plasmático total con 12,5 miligramos de partículas de oro y 0,5 miligramos por mililitro de solución PVP para BIFC. Combinando la misma preparación de cartucho, los dos ADN plasmáticos de las proteínas interactuantes putativas Seuss se fusionaron con la mitad terminal N de YFP, seus abreviado, NYFP y LU Homólogo se fusionaron con la mitad terminal C de YFP abreviado L-U-H-C-Y-F-P.

La cantidad combinada es de 50 microgramos por preparación, lo que produce hasta 50 cartuchos a un microgramo de ADN por cada 0,25 miligramos de oro por cartucho. Cada cartucho es para un disparo. Después de la preparación del cartucho, pruebe los cartuchos para saber si las partículas de oro se impulsan de manera eficiente.

Envuelve una pieza cuadrada de paraform alrededor de una placa de Petri. A continuación, ajuste la presión de helio a entre 150 y 200 PSI y dispare los cartuchos recién fabricados en el cuadrado de parámetros. Observe tenues partículas de oro en el perfume.

Diferentes cantidades de partículas de oro pueden ser impulsadas sobre el perfume a diferentes presiones de helio. Sin embargo, si no hay una diferencia significativa, elija la presión más baja para el bombardeo. Esta prueba también indica el área cubierta por cada disparo.

Para preparar los tejidos de cebolla, pela la piel exterior de una cebolla amarilla grande con una cuchilla de afeitar limpia y afilada. Corta un área rectangular de dos por ocho centímetros, de cuatro a cinco capas de profundidad. Saque el pañuelo de cebolla rectangular y deseche las dos capas exteriores.

Corta las capas restantes de la cebolla en trozos cuadrados de aproximadamente 1,5 centímetros. Coloque los trozos de cebolla en una placa de Petri que contenga círculos de papel de filtro de tres mm. Humedecida con agua estéril cubrir la placa de Petri.

Los trozos de cebolla están listos para el bombardeo. Primero: cargue los cartuchos en los soportes de cartuchos redondos blancos, cargue los cartuchos que contienen diferentes construcciones de plásmidos en diferentes soportes de cartuchos. Cada soporte de cartucho puede contener hasta 12 cartuchos para 12 disparos.

Aquí se cargan tres soportes diferentes. El primer soporte tiene cartuchos que contienen 35 S-G-F-P-A promotor fuerte y constitutivo del virus del mosaico de la coliflor. Este plásmido sirve como control positivo.

El segundo soporte se carga con los cartuchos experimentales que contienen una cantidad igual de S-E-U-N-Y-F-P y L-U-H-C-Y-F-P. El tercer soporte de cartucho está cargado con cartuchos que contienen una mezcla molar igual del vector de la columna vertebral del disco y la especia del disco LUH. Esto también sirve como un control negativo.

Inserte la batería y el revestimiento del cañón nuevo en la pistola genética Helios. Asegúrese de que tanto el revestimiento del cañón como la pistola tengan sus respectivas juntas tóricas adjuntas. A continuación, inserte un soporte de cartucho vacío en la pistola genética con la marca número 12 en el soporte de cartucho hacia la parte superior de la pistola.

Acerquée el soporte del cartucho una o dos veces para asegurarse de que esté insertado correctamente. A continuación, conecte la pistola al depósito de helio y ajuste la presión entre 150 y 200 CV. Llevo protección para los oídos y disparo el arma un par de veces manteniendo pulsado el botón lateral mientras aprieto el gatillo. Al disparar el arma con el cartucho vacío, cargado se limpia la recámara del arma y se garantiza que la presión sea estable.

Antes de disparar el ADN, disparar un trozo de cebolla aquí puede ser un control negativo para la fluorescencia de fondo. Para disparar las partículas de oro recubiertas de ADN, retire el soporte del cartucho vacío e inserte el primer soporte de cartucho cargado que contenga el control positivo. Avance el soporte del cartucho de modo que el cartucho destinado al disparo quede colocado en la parte inferior del portacartuchos.

Ahora coloque los trozos de cebolla en el medio de una placa de Petri vacía con la capa más interna de la cebolla hacia arriba. Apoya el revestimiento del cañón de la pistola genética en la placa de Petri y dispara el arma. Avanza al siguiente cartucho y dispara un trozo de cebolla diferente.

Repita este paso hasta que se disparen de cuatro a cinco trozos de cebolla. Cada pieza de cebolla se dispara una sola vez después de disparar. Transfiera el trozo de cebolla bombardeado a una placa de Petri que contenga papel de filtro húmedo de tres mm para disparar los cartuchos experimentales.

Cambie al cartucho Holden. Número dos, recuerde cambiar el revestimiento del cañón para evitar la contaminación. Dispara de cuatro a cinco trozos de cebolla como se acaba de mostrar para el control positivo.

A continuación, cambie al cartucho Holden. Número tres, que contiene el ADN de control negativo. Y de nuevo, dispara de cuatro a cinco trozos de cebolla.

Cambie el revestimiento del cañón para evitar la contaminación. Después del bombardeo. Cubra las placas de Petri que contienen los trozos de cebolla con tapas.

Envuélvelos con paraform para evitar que se sequen. Incube los trozos de cebolla a temperatura ambiente en la oscuridad durante 16 a 48 horas. Una vez finalizado el bombardeo, apague el gas y libere la presión antes de separar la pistola genética del tanque de helio, desenrosque el revestimiento del cañón y retire el soporte del cartucho y los cartuchos usados.

Por último, limpie los soportes de los cartuchos y las camisas de los cañones sumergiéndolos en un vaso de precipitados con agua jabonosa y sonicate. Durante 20 minutos. Después, enjuague con agua para eliminar todos los residuos de jabón.

Remojar en etanol al 70% durante una hora y luego secar sobre toallas de papel. Proceda a observar los trozos de cebolla de 16 a 20 horas después del bombardeo. Después de incubar los trozos de cebolla bombardeados durante 16 a 20 horas a temperatura ambiente, use pinzas con extremos planos para pelar lentamente una sola capa celular de la epidermis interna de la cebolla.

Esta es la capa que se enfrenta directamente al cañón durante el bombardeo. Coloque la capa pelada sobre una gota de agua en una cubierta deslizante con un cubreobjetos. Pero tenga cuidado de minimizar las burbujas.

Observe la fluorescencia GFP o YFP utilizando un microscopio de fluorescencia como el observador zes axio, punto Z uno que se muestra aquí bajo el campo brillante del microscopio. En primer lugar, compruebe el flujo citoplasmático para asegurarse de que las células están vivas. Para ello.

Exponga el portaobjetos a la luz del campo brillante durante unos minutos para calentar el tejido de cebolla y luego busque plásticos en movimiento citoplasmático La transmisión no siempre es fácil de ver, así que no se desanime si no es claramente visible. Para la detección de fluorescencia, utilice filtros de excitación y detección adecuados para GFP o YFP. Comprueba también los controles negativos, que son los trozos de cebolla disparados con un plásmido no fluorescente.

Pueden aparecer señales amarillas tenues de las células heridas y de los escombros y las cebollas. Además, verifique los controles positivos. El plásmido que contiene un indicador fluorescente expresado constitutivamente.

La fluorescencia de GFP se observa en algunas células, pero no en todas. Las burbujas de aire también pueden producir fluorescencia de fondo. Las señales visibles de GFP de las células epidérmicas de la cebolla indican que los cartuchos, los tejidos de la cebolla y el disparo de la pistola genética están correctamente preparados y ejecutados.

Aquí se muestra la fuerte fluorescencia observada en el plásmido positivo 35 SGFP. La fuerte fluorescencia se observa en toda la célula, incluyendo tanto el núcleo como el citoplasma. La imagen de campo claro permite ver el contorno correspondiente de las células y los núcleos.

No todas las células se transforman. La señal fluorescente YFP se detecta en el núcleo de la célula de cebolla cuando la combinación experimental Seuss, NYFP y L-U-H-C-Y-F-P se bombardea en células de cebolla, lo que indica que Seuss NYFP y L-U-H-C-Y-F-P interactúan in vivo. Sin embargo, esta fluorescencia mediada por interacción es significativamente más débil que la fluorescencia mediada por 35 SGFP en el control positivo.

Además, los factores de transcripción SEUS y LUH se localizan en los núcleos. Por lo tanto, la fluorescencia de YFP solo se observa en el núcleo. Además, el número de células fluorescentes es significativamente menor que el de los 35 controles positivos SGFP.

Esto se debe a que B FFC solo funciona cuando ambos plásmidos asociados se expresan en las mismas células de cebolla. No se detecta ninguna señal fluorescente en las cebollas, bombardeadas con el cartucho número tres que contiene una mezcla de espina de disco, vector y L-U-H-C-Y-F-P Como se espera del control negativo. Acabamos de mostrarle cómo bombardear células de cebolla para probar las interacciones entre proteínas y proteínas utilizando el sistema de pistola de genes BioRad Helios.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar usar controles positivos y negativos adecuados y saber que la fluorescencia BIFC puede ser más débil en señal y menor en el número de células fluorescentes. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.