Name: Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprende a detectar interacciones proteína-proteína in vivo mediante BiFC en células epidérmicas de cebolla utilizando la pistola de genes Helios. Este método permite visualizar interacciones nucleares con fluorescencia YFP.

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Agradecemos a los Dres. Steve Monte y Zhang Xiaoning para el 35S:: GFP pGlowbug la construcción y la Comunidad Hokensen Doctorado de Investigación en el laboratorio de CH Z. L&#39;s es apoyado por los EE.UU. National Science Foundation (IOB0616096 y MCB0744752). ZL es parcialmente financiado por la Universidad de Maryland Estación Experimental Agrícola.

I. plásmido preparación El ADN plásmido utilizado para el bombardeo debe ser de gran pureza y una concentración de 500ng/μl o mayor. Para BiFC que participan dos construcciones de plásmidos, 25 mg de cada plásmido se necesita. En otras palabras, una relación de 1:1 molar de los dos plásmidos se mezclan para dar lugar a 50 ug de plásmido ADN total de la preparación de los cartuchos. Tenga en cuenta que la adición de más de 50 mg de ADN puede causar la aglomeración de las partículas de oro y deben ser evitados. Kits comerciales de extracción de ADN plásmido se recomiendan para el aislamiento de ADN de plásmido. Vectores del plásmido debe ser relativamente pequeño en tamaño, tales como pUC19. Hemos clonado SEU y LUH cDNA en pUC19 y pUC19-Spyne SPYCE, respectivamente 3. Vectores binarios para la transformación mediada por Agrobacterium son demasiado grandes e inadecuado para el bombardeo. II. Cartucho de preparación Preparación del cartucho consiste en partículas de recubrimiento de oro con el ADN del plásmido y colocarlos en un tubo de plástico que posteriormente se corta en trozos media pulgada de largo, que se pueden cargar en los titulares de cartucho de pistola de genes. Preparación del cartucho se describe en gran detalle en un artículo separado Jove 4 y por lo tanto no se describe aquí. Para el bombardeo de las células de la cebolla, se recomienda mezclar 50 g de ADN plásmido con 12,5 mg de partículas de oro por la preparación, que produce alrededor de un 50 cartuchos a 1 g de oro DNA/0.25 mg / cartucho. Cada cartucho es de un solo disparo. Las partículas de oro pueden ser 0,6 m ó 1,0 m de diámetro (Cat # 1652262 # 1652263 o gato, BioRad). También recomendamos el uso de 0,5 mg / ml de solución de PVP para la preparación del cartucho. Para BiFC, combine los dos ADN plásmido de cada socio que interactúan putativo en la preparación de un mismo cartucho. Después de la preparación del cartucho, es importante para poner a prueba los cartuchos por el disparo de los cartuchos nuevos hechos a una presión de helio de 150 a 200 psi en un Parafilm cuadrados que se envuelve alrededor de una placa de Petri. Esto pondrá a prueba si las partículas de oro pueden ser impulsados ​​de manera eficiente de los cartuchos, usted debe ver las partículas de oro débil en el Parafilm. Esto le da una idea del área que cubrirá cada disparo. Usted puede notar diferentes cantidades de partículas de oro impulsó a la Parafilm a diferentes presiones de helio (en el rango de 150 a 200 psi). Si no hay una diferencia significativa, elegir el de menor presión para el bombardeo. III. La preparación de los tejidos de cebolla En el día de rodaje, despegue la piel exterior de una cebolla amarilla grande. Usando una hoja de afeitar limpias y afiladas, corte 4-5 capas profundas de un área rectangular de aproximadamente 2 x 8 cm. Sacar el tejido rectangular cebolla, deseche el exterior dos capas, corte el resto de las capas de la cebolla en trozos de 2x1.5 cm. Coloque los trozos de cebolla en una placa de Petri con papel filtro (papel Whatman 3MM cortado en círculos) humedecido con agua estéril. Cubrir la placa de Petri y que están dispuestos a ir. IV. Bombardeo <ol><li> La carga de los cartuchos en los soportes del cartucho redondo blanco. Cartuchos que contienen diferentes construcciones de plásmidos se deben cargar en los titulares de cartucho diferente. Cada titular de cartucho puede almacenar hasta 12 cartuchos de 12 tiros. </li><li> Inserte la batería y el revestimiento de barril fresca en la pistola de genes Helios. Asegúrese de que tanto el revestimiento de barril y el arma han respectivas juntas tóricas adjunto. </li><li> En primer lugar, insertar un soporte para el cartucho vacío en la pistola de genes, con la marca # 12 en el soporte del cartucho hacia la parte superior de la pistola. Titular de avance cartucho de una o dos veces para asegurarse de que está correctamente colocada. </li><li> Adjuntar pistola en el tanque de helio y ajustar la presión de 150 a 200 psi. </li><li> Use protección para los oídos y un arma de fuego un par de veces con el soporte del cartucho vacío para limpiar la cámara de la pistola y para asegurarse de que la presión es estable. </li><li> Retire el soporte del cartucho vacío e insertar un soporte para el cartucho cargado. Avanzar en el soporte del cartucho para que el cartucho que desea el fuego se coloca en el fondo (6:00) del soporte del cartucho. Disparar a un pedazo de cebolla aquí proporciona una forma de control negativo para la fluorescencia de fondo. </li><li> Coloque pedazos de la cebolla en el centro de un plato vacío de Petri con la capa más interna de la cebolla hacia arriba. Resto de línea de la pistola de genes de barril en una placa de Petri y disparar el arma pulsando el botón lateral, mientras que apretar el gatillo. La transferencia de la cebolla bombardeados con una placa de Petri que contiene el papel de filtro húmedo 3MM. </li><li> Avanzar a la siguiente cartucho y fuego un pedazo de cebolla diferentes. Repita este paso hasta cuatro a cinco piezas de la cebolla se disparó. Cada pieza de cebolla se disparó una sola vez. </li><li> Cambiar al titular de un cartucho cargado con diferentes cartuchos que contienen una combinación diferente plásmido plásmido o diferentes. Recuerde que para cambiar el revestimiento barrils bien para prevenir la contaminación. Dispara cuatro hasta cinco trozos de cebolla. </li><li> Después del bombardeo, devolver todas las cebollas a los platos de Perti. Cubrir las placas con las tapas. Envuelva con Parafilm para evitar la desecación. Incubar los trozos de cebolla a temperatura ambiente en la oscuridad durante 16-48 horas. </li><li> Apague la presión del gas y la liberación antes de desmontar la pistola de genes desde el tanque de helio. Desenroscar el barril de línea, y quitar el soporte del cartucho y los cartuchos usados ​​(o no). </li><li> Limpieza de cartucheras y fundas barril sumergiéndolas en un vaso con agua y jabón. Colocar el vaso en un baño de ultrasonido y sonicar durante 20 minutos. Después, enjuague con agua para eliminar todos los residuos de jabón. Ponga en remojo en el 70% de etanol durante una hora y luego séquelas con toallas de papel. </li></ol> V. Observación <ol><li> Después de la incubación bombardeado trozos de cebolla durante 16-20 horas a temperatura ambiente, se puede observar las buenas prácticas agrarias o de fluorescencia YFP utilizando un microscopio de fluorescencia, como el Observer.z1 Zeiss Axio utilizados en este estudio. </li><li> El uso de fórceps con los extremos planos que poco a poco la cáscara de una capa única célula de la epidermis interna de la cebolla (la capa que está directamente enfrente de la pistola durante el bombardeo). Colocar la cáscara en una gota de agua sobre un portaobjetos. Añadir cubreobjetos pero tenga cuidado para minimizar las burbujas. </li><li> En campo claro del microscopio, en primer lugar comprobar corriente citoplasmática para asegurarse de que las células están vivas. Para ello, exponen en la diapositiva a la luz brillante campo durante unos minutos para calentar el tejido de la cebolla y luego buscar plástidos en movimiento. Corriente citoplasmática no siempre es fácil de ver, así que no se desanime si no puede ver. </li><li> Para la detección de fluorescencia, excitación uso apropiado y filtros de detección de buenas prácticas agrarias o YFP. Es importante incluir controles negativos, tales como trozos de cebolla disparó con un plásmido que no fluorescente. Débiles señales amarillas pueden aparecer a partir de células heridos, las burbujas de aire, o los escombros. También es importante incluir controles positivos. Un plásmido que contiene el reportero expresa constitutivamente fluorescentes, como 35S:: GFP es un excelente control positivo. Señales visibles las buenas prácticas agrarias de las células epidérmicas de cebolla (Figura 1 A, D) indicó que los cartuchos, los tejidos de cebolla, y el despido pistola de genes están debidamente preparados y ejecutados. Posteriormente, se observaron interacciones entre SEU-pSPYNE y LUH pSPYCE en trozos de cebolla bombardeados con cartuchos que contienen una mezcla de 35S:: SEU-pSPYNE y 35S:: LUH-pSPYCE AND. Débil fluorescencia YFP se observó en el único núcleo (Figura 1 B, E), lo que indica la interacción física directa entre SEU y LUH que llevó a los fragmentos de YFP dividir juntos en el núcleo. Tenga en cuenta que la señal de YFP BiFC es significativamente más débil que la señal de las buenas prácticas agrarias del 35S:: GFP. </li></ol> Resultados representante En nuestro presente estudio, el 35S:: control de plásmido GFP emite fluorescencia positiva fuerte que llena toda la celda, incluyendo el núcleo y el citoplasma (Figura 1 A, D). La proteína GFP es lo suficientemente pequeño como para difundir en el núcleo, sin una señal de localización nuclear. Por el contrario, SEU y LUH son dos factores de transcripción Arabidopsis demostrado previamente para participar en una levadura de dos híbridos de ensayo 2. SEU-pSPYNE (SEU fusionado con el fragmento N-terminal de YFP) y LUH-pSPYCE (SEU fusionado con el fragmento N-terminal de YFP), a la vez demasiado grande para difundir en el núcleo, contienen señales de localización nuclear 2,5. La señal fluorescente YFP detectados en el núcleo de la célula de cebolla (Figura 1 B, E) indica que el SEU-pSPYNE y LUH pSPYCE-pueden interactuar en los núcleos de cebolla. No hay señal de fluorescencia se detecta en las cebollas bombardeados con la mezcla de plásmidos de pSPYNE vector plásmido que contenía el fragmento N-terminal de YFP y LUH-pSPYCE (Figura 1 C, F). La fluorescencia BiFC mediada YFP es significativamente más débil que la fluorescencia de GFP-mediado desde el 35S:: GFP plásmido. En nuestro estudio, también mostraron la localización subcelular diferente (comparar Figura 1 A con B). Además, el número de células fluorescentes es significativamente menor para BiFC, como BiFC sólo funciona cuando ambos plásmidos asociados con éxito entrar y se expresan en las células de la cebolla mismo. <img src="/files/ftp_upload/1963/1963fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluorescente (A, B, C) ​​y de campo claro (D, E, F) las imágenes de las células de cebolla bombardeados con diferentes construcciones de plásmidos. (A) y (D), las células de cebolla bombardeados con 35S:: GFP. GFP se difunde en todo el citoplasma y núcleo. (B) y (E), las células de cebolla bombardeados con la misma mezcla molar del 35S:: SEU-pSPYNE (SEU fusionado con el fragmento N-terminal de YFP) y 35S:: LUH-pSPYCE (LUH fusionados al fragmento C-terminal ) del ADN del plásmido. Una interacción entre el SEU-pSPYNE y LUH pSPYCE-se muestra por un núcleo fluorescente. (C) y (F), un control negativo que muestra las células de cebolla bombardeados con mezclas de vector pUC19-Spyne y plasmi LUH-pSPYCEds. No se detecta la señal fluorescente.

<ol><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).</li>
<li>Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEUNIG_HOMOLOG+and+LEUNIG+perform+partially+redundant+functions+during+Arabidopsis+embryo+and+floral+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development.</a> Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).</li>
<li>Walter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEUSS+and+AINTEGUMENTA+mediate+patterning+and+ovule+initiation+during+gynoecium+medial+domain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).</li>
<li>Zhang, X. N., Mount, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+alternatively+spliced+isoforms+of+the+Arabidopsis+SR45+protein+have+distinct+roles+during+normal+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).</li>
</ol>

<ol><li> Para los usuarios de primera vez, se recomienda la práctica de todo el procedimiento, desde la preparación del cartucho a la observación, con un único plásmido reportero constitutiva como 35S:: GFP o 35S:: GUS. Se utilizó un 35S:: GFP plásmido obtenido de los Dres. Steve Monte y Zhang Xiaoning 6 (Figura 1 A, D). Los cartuchos de inyección de genes de control en la venta RioRad (Cat. 165-2244) no son adecuados para las plantas. </li><li> Para BiFC, un control positivo es necesario, que debe constar de dos socios conocidos que...

<table><tbody><tr><td>Cebolla amarilla</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cañón génico Helios</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente con filtros adecuados para GFP o YFP</td><td>Zeiss, Nikon, Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bimolecular complementación de fluorescencia (bifc) ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes helios

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigación de la función de genes en diversos organismos se basa en el conocimiento de cómo los productos de los genes interactúan unos con otros en su ambiente celular normal. La complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) Ensayo<sup&gt; 1</sup&gt; Permite a los investigadores visualizar interacciones proteína-proteína en las células vivas y se ha convertido en una herramienta de investigación fundamental. Este ensayo se basa en la asociación facilitado de dos fragmentos de una proteína fluorescente (GFP), que son cada uno unido a un socio potencial de interacción proteína. La interacción de los dos socios de la proteína que facilitaría la asociación de la N-terminal y C-terminal del fragmento de la GFP, lo que lleva a la fluorescencia. Para los investigadores de plantas, células epidérmicas de cebolla son un sistema ideal de experimentación para la realización de la prueba BiFC debido a la facilidad en la obtención de tejidos y la preparación de la cebolla y la visualización directa de la fluorescencia con un mínimo de fluorescencia de fondo. La pistola de genes Helios (BioRad) se utiliza comúnmente para bombardear plásmido de ADN en células de cebolla. Se demuestra el uso de Helios pistola de genes para introducir construcciones de plásmidos durante dos interactuando<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Factores de transcripción, Seuss (SEU) y homólogo Leunig (LUH)<sup&gt; 2</sup&gt; Y la visualización de sus interacciones mediadas por las células de cebolla BiFC en la epidermis.

Este artículo muestra cómo utilizar correctamente el BioRad Helios pistola de genes para introducir ADN plásmido en las células epidérmicas de cebolla y la forma de prueba para las interacciones proteína-proteína en las células de la cebolla basa en el principio de fluorescencia de Complementación bimolecular (BiFC)

Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios

La investigación de la función génica en diversos organismos depende del conocimiento de cómo interactúan los productos génicos entre sí en su entorno celular normal...

Este procedimiento evalúa la interacción proteína-proteína in vivo entre dos reguladores transcripcionales de Arabidopsis, SEU (abreviado de seus) y LUH (abreviado de lu holog). Mediante el uso de la complementación de fluorescencia biomolecular, SEU se fusiona al fragmento terminal N del proteína fluorescente amarilla (YFP), y LUH se fusiona al fragmento terminal C del ADN-YFP. Los constructos plasmidiales Seus-NYFP y LUH-CYFP son bombardeados en células epidérmicas de cebolla para evaluar su interacción.Una interacción entre Seuss y LUH provoca la asociación de los fragmentos terminal N y terminal C de YFP en los núcleos, lo que lleva a la fluorescencia de YFP en los núcleos. Tras una incubación de 16 a 20 horas en la oscuridad, se observan las láminas de epidermis de cebolla bajo un microscopio de fluorescencia para visualizar la fluorescencia. Hola, soy Courtney Hollander del laboratorio del Dr. Zhi Lu del Departamento de Biología Celular y Genética Molecular de la Universidad de Maryland.Hoy les mostraremos un procedimiento para probar la interacción proteína-proteína en células de cebolla utilizando la pistola génica BioRad Helios. Utilizamos este procedimiento en nuestro lab

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Biología

Este protocolo describe cómo la imagen de interacciones proteína-proteína mediante un ensayo basado en la proximidad FRET.

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

La localización subcelular de las proteínas es importante para determinar la regulación espacio-temporal de la señalización celular. Aquí se describe la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) como un método sencillo para el control de la interacción espacial de las proteínas en la célula.

Fluorescencia de Complementación bimolecular

Hemos desarrollado una técnica para probar interacciones proteína-proteína en las plantas. Una proteína amarilla fluorescente (YFP) se divide en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés a través del sistema de puerta de enlace, lo que permite la expresión de proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación.

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

Análisis citométrico de flujo de Complementación fluorescencia bimolecular proporciona un método cuantitativo de alto rendimiento para estudiar la interacción proteína-proteína. Esta metodología se puede aplicar a los sitios de unión de proteínas y de mapeo para los factores que regulan la interacción proteína-proteína de cribado.

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Las interacciones proteína-proteína se visualizan en células con resolución espacial nanométrica mediante la combinación de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) con microscopía de localización fotoactivada (PALM). Aquí se describe el uso de BiFC-PALM para obtener imágenes de las interacciones Ras-Raf en células U2OS para visualizar la agrupación y difusión a nanoescala de complejos Ras-Raf individuales.

Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Este manuscrito describe un procedimiento experimental fácil y rápido para la determinación de las interacciones proteína-proteína basadas en la medición de la actividad de luciferasa.

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Hemos desarrollado un novedoso método para expresar conjuntamente múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas a superar las dificultades de los métodos convencionales. Toma ventaja del uso de un plásmido de expresión única que contiene múltiples proteínas funcionalmente independiente expresando cassettes para lograr la expresión de la proteína.

La expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescente de manera eficiente en las plantas

Este protocolo demuestra el uso del ensayo de ligadura de proximidad para sondear las interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans.

Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

Aquí presentamos, un método para visualizar la formación de complejos ternarios entre tres socios de proteínas utilizando proteínas marcadas con fluorescentes mediante el ensayo FRET-FLIM basado en BiFC. Este método es valioso para estudiar los complejos de interacción proteína-proteína in vivo.

Determinación de la interacción tripartita entre dos monómeros de un factor de transcripción MADS-box y una proteína sensora de calcio mediante ensayo BiFC-FRET-FLIM

El protocolo presenta un método para la unión covalente in vivo de biotina a proteínas basado en su proximidad a una biotina ligasa fusionada con una proteína de interés. Esta modificación permite un enriquecimiento selectivo de las proteínas utilizando perlas de estreptavidina según sea necesario en los estudios de interacción de proteínas.

In vivo Biotinilación de proximidad para estudios de interacción de proteínas en Paramecium tetraurelia

Aprende a detectar interacciones proteína-proteína in vivo mediante BiFC en células epidérmicas de cebolla utilizando la pistola de genes Helios. Este método permite visualizar interacciones nucleares con fluorescencia YFP.

Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios (Video) | JoVE Journal

Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios

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