Name: La optimización y utilización de Agrobacterium Mediada por la producción de proteína transitoria en Nicotiana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: Aprende a producir proteínas recombinantes transitorias en plantas Nicotiana mediante infiltración al vacío con Agrobacterium. Este método optimizado permite la acumulación eficiente de antígenos vacunales y proteínas terapéuticas a gran escala.

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Este trabajo fue apoyado por Fraunhofer EE.UU. Centro para la Biotecnología Molecular, Ibio, Inc. y la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (subvención # HDTRA1-07-C-0054). Los autores agradecen los regalos generosos por los Dres. Stanton Gelvin de Ciencias Biológicas Departamento de la Universidad de Purdue (Agrobacterium tumefaciens cepas) y Wayne Fitzmaurice de Gran Escala Biología Corp. (semillas excelsiana N.), así como Jennifer Nicholson Colección de Nicotiana EE.UU., la Universidad Estatal de Carolina del Norte (semillas excelsior N. ). Los autores agradecen a Margaret Shillingford y Christopher casco para proporcionar plantas y su excelente asistencia técnica. Los autores también agradecen a los Dres. Stephen Streatfield y Natasha Kushnir por su asistencia editorial.

1. Planta que crece Para la posterior agroinfiltration evaluamos dos especies de Nicotiana de tipo salvaje (N. benthamiana y N. excelsior) y un híbrido (N. excelsiana) cultivadas hidropónicos en lana de roca en las instalaciones interiores. <ol><li> Remojar la lana de roca en una solución de abono para las plantas. </li><li> Siembre las semillas de tipo salvaje de N. benthamiana, N. excelsior y N. excelsiana (híbrido de N. benthamiana × N. excelsior) en los nutrientes empapada superficie de lana de roca. </li><li> Cultiva plantas de las semillas bajo condiciones controladas (24 ° C y humedad relativa de 40-65%) y un fotoperiodo de día largo (14 horas de luz y 10 horas de oscuridad, con iluminación de 130 a 150 E · m -2 s -1) para 4-5 semanas para N. benthamiana y N. excelsiana, y 5-6 semanas para N. excelsior. </li></ol> 2. Construcción de vectores para Agroinfiltration <ol><li> Inserte un gen indicador sintético (proteína verde fluorescente [GFP]), de larga duración de la hemaglutinina (HA) de la cepa del virus de la influenza A/California/04/2009 (HAC1), y re-ingeniería de la enzima liquenasa (LicKM) 18 por separado en el vector de lanzamiento pBID4 18 (vector basado en TMV) para obtener pBID4-GFP, pBID4-HAC1 y pBID4-LicKM, respectivamente 18,32,41,47. </li><li> Introducir 10-50 ng de pBID4 llevar las buenas prácticas agrarias o HAC1 en células electrocompetentes de A. tumefaciens cepa GV3101 y LicKM en células electrocompetentes de A. Agrobacterium cepas GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, At10, At77 y A4 con el electroporador MicroPulser gen. </li><li> Utilice la agrobacterias transformadas para los experimentos de infiltración a menos que se indique lo contrario. </li></ol> 3. Aspire infiltración de Agrobacterium en plantas de Nicotiana <ol><li> Crecer A. tumefaciens cepas durante la noche (O / N) en medio LB, med YEBio o medio AB suplementado con 50 mg / l de kanamicina a 28 ° C con agitación a 200-250 rpm. </li><li> Diluir agrobacterias en agua Milli-Q para una densidad óptica a 600 nm (600) de células 0.5 o Agrobacterium centrífuga crecido en LB o YEB o AB en 4000 × g durante 10 min a 4 ° C, volver a suspender en medio de inducción (sal 1x MS, MES 10 mM, acetosiringona 200 mM, 2% de sacarosa [MMA]) a A 600 de 0,5, y se agita a temperatura ambiente durante 1-3 hr, salvo que se indique lo contrario. </li><li> Infiltrarse en las plantas en una cámara de vacío sumergiendo tejidos aéreos de la planta Nicotiana en suspensión de Agrobacterium y la aplicación de un vacío 50-400 mbar durante 30 o 60 segundos. La infiltración óptima se aplica rutinariamente en 50-100 mbar durante 60 segundos. </li><li> Una vez que se rompe el vacío, retire las plantas de la cámara de vacío, enjuague en agua, y crecer durante 5-7 días en las mismas condiciones de crecimiento utilizadas para el crecimiento pre-infiltración. </li><li> Para probar la eficaciade productos químicos que inducen gen vir de Agrobacterium, diferentes concentraciones de acetosiringona (0, 100, 200 o 400 micras) se añadieron a la agrobacterias se suspendieron en tampón de infiltración (1x MS, MES 10 mM, 2% de glucosa). Para el efecto de monosacárido en la inducción del gen vir, diferentes porcentajes de glucosa (0, 1, 2 o 4%) se añadieron a agrobacterias en suspensión en el tampón de infiltración (1x MS, MES 10 mM, 200 mM de acetosiringona). N. benthamiana plantas se infiltraron como se ha mencionado anteriormente en las etapas 3.3 y 3.4). </li><li> Laboratorio de cepas de Agrobacterium GV3101, C58C1 y LBA4404 y las cepas de tipo salvaje A4, AT06, AT10 y At77 alberga el vector pBID4-LicKM se diluyeron en agua Milli-Q a A 600 de 0,5. N. benthamiana plantas se infiltraron con cada cepa en particular como se mencionó anteriormente en los pasos 3.3 y 3.4. </li></ol> 4. Procedimiento Co-agroinfiltration para el supresor de silenciamiento viral <ol><li> Mix las culturas Milli-Q agua-diluido Agrobacterium GV3101 que portan el gen GFP y el silenciamiento viral p19 supresor de tomate enanismo arbustivo del virus (TBSV) en 1:01, 2:01, 3:01 y 4:01 ratios. Infíltrate N. benthamiana plantas como se describió anteriormente. </li><li> Infíltrate N. benthamiana plantas con una mezcla de dos culturas Agrobacterium GV3101 diluidas en agua Milli-Q: el primero lleva el plásmido pBID4-HAC1 y el segundo que lleva uno de los supresores de silenciamiento - p19 de TBSV o p23 del virus de la tristeza de los cítricos, en el plásmido pCassp ( pCassp19) y en el plásmido binario pGR bajo el promotor 35S (PGR-P23), respectivamente, en la relación 04:01. </li></ol> 5. Análisis Western Blot <ol><li> Recoger muestras de hojas al azar de N. benthamiana, N. excelsior o N. plantas excelsiana en 4-7 ppp y pulverizar en nitrógeno líquido a un polvo fino. </li><li> Añadir tres volúmenes de tampón PBS 1x que contienen 0,5% de TritonX-100 a cada muestra. </li><li> Agite suavemente las muestras extraídas durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Haga girar el extracto durante 5 min y recoger la proteína soluble total en un tubo Eppendorf limpio. </li><li> Diluir los extractos a una dilución apropiada (1:50 1:100) en tampón de extracción 1x PBS, y añadir 5 × tampón de muestra (Tris-HCl 250 [pH 6,8], 10% de SDS, 0,5% azul de bromofenol, 50% de glicerol v / v, y DTT 500 mM) a una final concentración de 1 ×. </li><li> Muestras hervir durante 5 min. </li><li> Proteínas separadas en un 10% SDS-PAGE, transferencia a una membrana de transferencia Immobilon-P, y bloquean con un 0,5% I-bloque. </li><li> Detectar GFP usando anticuerpo policlonal de conejo anti-GFP antisuero a 1:5.000 y HAC1 usando anticuerpo monoclonal de ratón anti-poli-histidina en 1:1.000 en solución de bloqueo durante 1 hora. </li><li> Después de etiquetado anticuerpo primario, lavar las membranas tres veces durante 10 minutos cada uno con 1 × PBST-20 e incubar con una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo anti-conejo a 1:5.000 o un conjugado de HRPd anticuerpo anti-ratón en 1:10.000 durante 1 hora, por las buenas prácticas agrarias y la detección HAC1, respectivamente. </li><li> Procesar las transferencias de Western utilizando el sustrato SuperSignal West Pico quimioluminiscente. </li><li> Utilice la GeneTools Software para analizar la intensidad de banda de la proteína y obtener la cantidad calibrada banda. </li></ol> La producción de proteínas: (Calibrado cantidad x de dilución de la muestra) / cantidad de muestra cargada) x 4 = mg / kg. Ecuación: La producción de proteínas (P), la cantidad calibrada (C), la dilución de la muestra (D) y la cantidad de Muestra cargada (S). 6. Ensayo Zimograma <ol><li> N.-LicKM infiltrado-pBID4 Recoger benthamiana muestras de tejido al azar. </li><li> Extracto de proteínas usando los mismos métodos descritos anteriormente para el análisis de transferencia de Western y luego analizar por 10% de SDS-PAGE con 0,1% liquenano incluidos en los geles. </li><li> Después de la electroforesis, los geles de lavar dos veces durante 10 minutos cada uno en tampón de lavado (Tris-HCl 100 [pH 8,0] y 0,1% de Triton X-100) Y luego incubar en tampón de lavado a 65 ° C durante 1 hora. </li><li> Después de la incubación, desechar el tampón de lavado y manchar los geles con 0,5% de Rojo Congo durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague los geles en agua Milli-Q tres veces durante 10 minutos cada uno, y añadir 1 M NaCl para visualizar la actividad liquenasa. La proteína liquenasa bacteriana purificada se utilizó como control positivo para la actividad de la enzima. </li></ol> 7. Imaging GFP <ol><li> Realizar la detección visual de la fluorescencia de GFP en plantas enteras transformadas transitoriamente utilizando una lámpara UV de longitud de onda larga de mano. </li><li> Fotografía transitoriamente transformado plantas con una cámara digital a través de un Amarillo 8, ES 52 filtro (tiempo de exposición, 15 seg). </li><li> Obtener imágenes de Western blot análisis utilizando el software GeneSnap en un GeneGnome y cuantificar los resultados utilizando el software GeneTools, con una curva de calibración basada en el estándar GFP purificada. </li><li> Cuantificar proteína HAC1 utilizando una curva de calibración basada en purified HAC estándar de la proteína de la cepa del virus de la influenza A/Indonesia/05/05. </li><li> Calcule los valores medios 3-4 repeticiones para todos los experimentos. </li></ol>

No tenemos nada que revelar.

En este estudio, hemos desarrollado un protocolo agroinfiltration simple para la producción de proteína transitoria de rutina en las especies de Nicotiana seleccionados utilizando cepas de Agrobacterium que llevan el vector de lanzamiento. Además, hemos identificado las condiciones óptimas para lograr el nivel más alto de producción de proteína recombinante en nuestro sistema de expresión de la planta transitoria. Infiltración de vacío de la A. tumefaciens GV3101 diluida cepa que alberga los pBID4 vector de lanzamiento en N. benthamiana, N. excelsiana y N. Excelsior resultaron en niveles más altos de producción de proteína diana dentro de 7 dpi en comparación con otras especies de plantas, tales como Pisum sativum infiltrado con GV3101 que albergan el virus del mosaico de la alfalfa - o del mosaico del pepino vectores basados ​​en virus que expresan el gen reportero GFP bajo el promotor 35S 41, o Lactuca sativa, Solanum lycopersicumpersicum y Arabidopsis thaliana infiltrado con la cepa de A. C58C1 tumefaciens que portan el gen reportero de beta-glucuronidasa 57. N. benthamiana y N. excelsiana fuera fácil para aspirar infiltrarse a 50 mbar durante 30-60 segundos, con 90-95% de eficiencia de la infiltración. El 5-10% restante del área de la hoja no se infiltró a causa de algún flotante de hojas en la superficie de la suspensión de Agrobacterium durante la aplicación del vacío. Dado que el vector de lanzamiento tiene capacidad para el movimiento de célula a célula 18, la acumulación de proteína transitoria se produce en hojas enteras, así como los pecíolos a 7 dpi. A 10 dpi, la producción estimada de GFP fue ligeramente inferior debido a que el vector de expresión pBID4 es capaz de pasar de célula a célula, pero no para mover sistémicamente 18; por lo tanto, las hojas recién crecido no contienen el vector y no contribuyen a la producción de la meta. Además, la degradación de la proteína recombinante con el tiempo mAy contribuir a reducir el nivel de proteína en 10 dpi. Nuestros resultados mostraron que la infiltración de la A. altos niveles tumefaciens cepa GV3101 mediadas de la producción de proteína transitoria en N. benthamiana. Por otra parte, la proteína objetivo puede ser diseñado como fusiones N-terminales, C-terminales o internos a liquenasa (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanasa, que es una enzima termoestable a partir de Clostridium thermocellum y confiere termoestabilidad a muchos objetivo la proteína de fusión 18. Infiltración de N. benthamiana con A. tumefaciens cepas de tipo salvaje (AT6, AT10 y at77) que albergan el gen de interés provocado síntomas leves o graves encresparse hoja, pecíolo de elongación, y se encrespan. No se observaron síntomas patológicos en N. benthamiana infiltra con la cepa GV3101 de laboratorio que alberga el vector vacío pBID4, mientras que algunos genes insertados en pBID4 y se transforma en laboratorio cepas GV3101, C58C1 o LBA4404 suscitó reacciones necróticas suaves y hojasclorosis / síntomas de amarillamiento en las regiones infiltrados de hojas. Síntomas necróticos causados ​​por Agrobacterium de tipo salvaje o cepas desarmadas en las plantas solanáceas se ha informado anteriormente 56,57. La respuesta necrótica puede resultar de factores de virulencia del sistema de secreción de tipo III, proteínas bacterianas transferidos a la célula vegetal por el sistema de secreción de tipo IV, y / o sensibilidad a la flagelina 58-60. Hemos encontrado que la producción transitoria de proteínas heterólogas también puede provocar la patogenicidad y una respuesta hipersensible en planta infiltrado hojas. Muchos investigadores informaron que agroinfiltración de diferentes especies de plantas con vectores binarios de plantas producidas hasta 5-20 veces los niveles más altos de producción de proteína transitoria en comparación con plantas transformadas de forma estable 28,57. Nuestros datos muestran que N. benthamiana se infiltró con GV3101 que albergan pBID4-GFP altos niveles expresados ​​transitoriamente de GFP, que es similar a la reportada para el rendimiento de GFPN. benthamiana se infiltró con Agrobacterium que lleva el vector viral Pich-GFPSYS (hasta 80% de proteína soluble total) 44. Agroinfiltration utilizando nuestro vector de lanzamiento resultó en alta producción de la proteína LicKM termoestable, 50 veces mayor que la observada usando un plásmido binario estándar de 18. Para probar la infectividad de A. tumefaciens y la estabilidad del vector de lanzamiento, que se infiltraron en un plano de N. benthamiana cada hora durante un máximo de 8 horas con el mismo cultivo diluido en agua Milli-Q de GV3101 que alberga el plásmido pBID4-GFP. Nuestros datos muestran que la cepa GV3101 es infeccioso eficaz durante al menos 8 horas y pBID4 (el vector de lanzamiento) es muy estable durante el tiempo de 8 horas la infiltración. Glicerol de la cepa GV3101 que alberga el vector de lanzamiento pBID4-HAC1 (banco de células) se almacenan a -80 ° C se ha demostrado para ser muy estable durante tres años sin cambios en prote transitoriaen la producción en plantas infiltradas. Plantas de N. benthamiana cultivadas en condiciones óptimas y entre 35 y 42 días después de la siembra fueron óptimas para vacío infiltración mediada por la expresión génica transitoria 40. Plantas más jóvenes (3-4 semanas de edad) no pueden ser infiltrados por completo a causa de las hojas que flotan en la superficie de la suspensión celular y daño en los tejidos de los efectos mecánicos de la aplicación de vacío. En las plantas de más de 45 días, N. benthamiana atornillar etapa, en las condiciones óptimas de luz utilizados, el nivel de expresión transitoria es baja. Los compuestos de bajo peso molecular fenólicos (acetosiringona) y monosaccharaides (glucosa) se sabe que inducen genes vir en A. tumefaciens 55,61. Por otra parte, la infiltración de N. benthamiana con el vector pCAMBIA binario (GFP) en la presencia de acetosiringona en las concentraciones de 50-600 mM, se mostró a aumentar ligeramente transitoriala expresión del gen 40. Se estudió el efecto de diferentes concentraciones de acetosiringona y la glucosa en nuestro sistema mediante la adición de estos compuestos a las culturas GV3101 que albergan pBID4-GFP en las MMA durante 3 horas, y se encontraron diferencias en la expresión de GFP. Curiosamente, culturas GV3101 que albergan pBID4-GFP y diluidas en agua Milli-Q para una A 600 de 0,5 y se infiltraron sin la inducción de genes vir expresaron las mismas cantidades de GFP como aquellos infiltrado con los cultivos inducidos. El A. gen vir tumefaciens (s) potencialmente podría ser inducida por los compuestos fenólicos vegetales (acetosiringona y el ácido sinapínico) y monosaccharaides de plantas (glucosa y fructosa) presentes en el tejido de la hoja. Por lo tanto, se especula que niveles similares de expresión de GFP en presencia o ausencia de inductores exógenos de genes vir pueden ser el resultado del efecto de citoplásmicos inductores de genes vir presentes durante la replicación de la puesta en marcha del vector que expresa GFP en las células vegetales. N. benthamiana se ha utilizado como un modelo de acogida para la producción de proteína transitoria 49. Sin embargo, relativamente bajo rendimiento de biomasa de N. benthamiana &#39;s dificulta su aplicación para la producción a gran escala de proteínas recombinantes. El anfitrión óptima debe combinar un alto nivel de expresión transitoria, fácil crecimiento en un invernadero, y ser susceptible a la infiltración de Agrobacterium 2. Para seleccionar un huésped alternativo, hemos infiltrado en dos especies de tipo salvaje diferentes de Nicotiana (N. benthamiana y N. excelsior) y un híbrido N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) con la A. tumefaciens GV3101 cepa que alberga el plásmido pBID4-GFP. Entre estas tres especies, el nivel de expresión de GFP fue ligeramente superior en N. . N. benthamiana plantas excelsior mostraron dificultad para agroinfiltration vacío debido a sus hojas coriáceas y N. excelsianaproducido aproximadamente dos veces más biomasa en las mismas condiciones de crecimiento. La producción transitoria de GFP a los 7 dpi es relativamente similar en N. benthamiana y N. excelsiana. Por lo tanto, N. excelsiana puede ser un anfitrión más adecuado para la producción de proteína recombinante. La producción de proteína transitoria mediada por Agrobacterium está limitada por PTGS 26, que puede ser superado por la co-expresión de silenciamiento de genes supresores de origen virus de la planta 62. La producción de proteína transitoria ha sido previamente demostrado ser mejorado 50 veces en la presencia de la proteína p19 de TBSV, que inhibe PTGS en tejidos infiltrados 34. En nuestro estudio, se evaluó el efecto de dos supresores de silenciamiento virales (p19 y p23) por separado co-infiltrado con el vector de lanzamiento pBID4-HAC1. La co-infiltración de estos supresores de silenciamiento parecía tener poca influencia sobre la expresión transitoria de HAC1, con sólo un ligero aumento en HAC1la acumulación de proteínas (15-25%) en la presencia de p23 co-infiltrada o p19. Para influir positivamente en la producción de proteínas, pueden necesitar ser seleccionado específicamente para ser eficaz para las especies de plantas específicas y vector vírico 63 supresores de silenciamiento. TMV helicasa tiene un supresor de la actividad de silenciamiento de ARN 64,65. Nuestros datos confirman esta observación como co-infiltración de p23 o p19 con pBID4-HAC1 dio lugar a ningún aumento de GFP o un ligero aumento en la producción de proteínas HAC1 transitoria. En conclusión, se ha modificado y optimizado las condiciones de crecimiento de Agrobacterium y las plantas y la mejora de la eficiencia de infiltración al vacío. Esta tecnología nos permitió crecer y de infiltrarse en cientos de kilogramos de material vegetal en unas pocas horas. Éxito automatizamos la técnica de la expresión transitoria planta para la producción de vacunas de alto rendimiento a escalas industriales bajo las actuales prácticas correctas de fabricación (cGMP) condiciones. Para obtener más información aboautomatización ut y utilización del sistema de la planta transitoria de la producción de proteínas para la producción de proteínas recombinantes, incluyendo candidatos a vacuna subunidad, en condiciones de cGMP, se recomienda acudir a la página web <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Las plantas son ahora reconocidos como una plataforma segura, fiable, escalable y de bajo costo para la producción de productos biofarmacéuticos recombinantes heterólogas y proteínas industriales 1-3 y tienen importantes ventajas sobre los sistemas de expresión de células microbianas y animales 4. Las plantas son capaces de expresar proteínas correctamente plegadas con modificaciones post-traduccionales, incluyendo anticuerpos multiméricos reunidos 5-7. Varias proteínas farmacéuticas recombinantes derivados de las plantas están sufriendo evaluación clínica 8. Estos incluyen las vacunas específicas para cada paciente recombinantes idiotipo (scFv) para el tratamiento del linfoma no Hodgkin 9, pandemia basada en la hemaglutinina y candidatos para vacunas antigripales estacionales 10,11 (Cummings et al., Presentado a la Vacuna), anti-Streptococcus antígeno de superficie que / anticuerpo II para el tratamiento de la caries dental 12, y la insulina humana para el tratamiento de la diabetes 13. Además, Reco humanaglucocerebrosidasa mbinant para la terapia de reemplazo enzimático en pacientes con enfermedad de Gaucher ha sido aprobado en Israel y en los EE.UU. y está previsto en el Programa de Acceso Ampliado fuera de los EE.UU. 14,15. Proteínas heterólogas se pueden producir en transformada de manera estable (transgénica o transplastómica) o plantas transformadas transitoriamente. La producción de proteína transitoria ofrece varias ventajas sobre la producción en plantas transgénicas, incluyendo marco de tiempo corto para conseguir la expresión y acumulación 16, y se puede lograr mediante la introducción de vectores binarios bacterianas o vectores virales de plantas recombinante en tejidos de las plantas 4. El sistema de expresión transitoria más avanzado se basa en el uso de «vectores de lanzamiento &#39;que combinan los componentes de virus de plantas y plásmidos binarios, y se entregan por agroinfiltración 17,18. Agroinfiltration de un vector de lanzamiento basado en mosaico del tabaco (TMV) se ha aplicado con éxito en el laboratorioescala para producir antígenos de vacunas contra patógenos como el virus del papiloma humano 19, Yersinia pestis 20, los virus gripales A 21,22, Bacillus anthracis 23, y el virus de la viruela en 24 N. benthamiana hojas. expresión transitoria mediada por Agrobacterium es también un método prometedor para la producción simultánea de múltiples proteínas 2,25-27. Por ejemplo, los sistemas de expresión transitoria de plantas han sido utilizadas para producir anticuerpos recombinantes específicos de tumor 28,29, un anticuerpo recombinante glicosilada contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico 30, y un anticuerpo monoclonal específico para el ántrax antígeno protector 31,32. Co-infiltración de plantas de Nicotiana benthamiana con un gen diana y un supresor de resultados de silenciamiento de genes en una mayor expresión de la proteína diana 33,34. Agroinfiltration es un método común para introdu uniformementebacterias Cing que albergan un gen de interés en los tejidos vegetales 35-37. Infiltración al vacío de Agrobacterium para la expresión génica transitoria en planta intacta hojas es un método rápido, escalable, y útil para la producción de proteínas extrañas sin la necesidad de generar plantas transgénicas 38-41. Durante agroinfiltration vacío, las plantas se da la vuelta al revés y partes aéreas sumergidas en una suspensión de Agrobacterium. A continuación se aplica el vacío que causa los gases para la evacuación de los espacios intercelulares de la hoja a través de los estomas. Rápida re-presurización siguiente publicación de los resultados de vacío en la infusión de la suspensión de Agrobacterium en la hoja. A raíz de la infiltración de vacío de Agrobacteria, las plantas se cultivan más y expresión objetivo es monitoreado. Los niveles más altos de expresión diana se observan típicamente 2-3 días después de la infiltración (ppp) con un vector binario y 4-7 ppp con un vector de lanzamiento, después de lo cual el nivel de expresión típicamente dismiSES 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens es el vehículo más ampliamente utilizado para la entrega de un gen de interés en una planta para la producción de proteínas. Agroinfiltration funciona excepcionalmente bien en N. benthamiana pero relativamente poco en la mayoría de otras plantas, incluyendo Arabidopsis thaliana 46. En este estudio, hemos desarrollado un método simple, eficiente y económico para la producción de proteína transitoria en 5-6 semanas de edad N. benthamiana utilizando A. tumefaciens infiltración. El principal inconveniente de escalado industrial de la técnica de la agroinfiltración es la centrifugación de las bacterias cosechadas y la resuspensión del sedimento bacteriano en medio que contenía 4&#39;-hidroxi-3 &#39;, 5&#39;-dimetoxiacetofenona (acetosiringona), monosacáridos, y 2 - (N-morfolino) -etanosulfónico (MES) tampón para la inducción de los genes vir. Hemos sido capaces de superar estos problemas mediante la optimización de la Agrobacterium </em&gt; el crecimiento en medio AB (medio mínimo) seguido por la dilución directamente en agua Milli-Q y mediante el control de la duración y las condiciones de infiltración. También hemos comparado la producción de proteínas diana en el N. de tipo silvestre las especies de acogida tabaco benthamiana y N. Excelsior, así como en N. híbrido excelsiana.

<table><tbody><tr><td>Nicotiana benthamianaColección de</td> <td>germoplasma de tabaco, Departamento de Ciencias de los Cultivos, Universidad Estatal de Carolina del Norte</td><td>PI 555478 TW16</td><td>Infiltración</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsiorColección de</td> <td>germoplasma de tabaco, Departamento de Ciencias de los Cultivos, Universidad Estatal de Carolina del Norte</td><td>PI 555685 TW47</td><td>Infiltración</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsiana</td><td>Dr. Wayne Fitzmaurice, Corporación de Biología a Gran Escala, Vacaville, CA</td><td>LSBC EBA 042304.02</td><td>Infiltración</td></tr><tr><td>Patín de vacío</td><td>Abbas, Ashland, MA</td><td>Infiltración de plantas</td><td>a medida</td></tr><tr><td>Rockwool</td><td>Grodan Inc., Ontario, Canadá</td><td>AO 50/40</td><td>Medio hidropónico para el cultivo</td></tr><tr><td>de plantas 2-(N-Morpholino) ácido etanosulfónico</td><td>Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ</td><td>172595000</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Murashige & Sal de Skoog (sal MS)</td><td>Laboratorio de Fitotecnología</td><td>M524</td><td>Medios de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Acetosiringona</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D134406-5G</td><td>Inducción de agrobacterias</td></tr><tr><td>Membrana de transferencia Immobilon-P</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>IPVH00010</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>I-block Applied</td><td>Biosystems, Foster City, CA</td><td>T2015</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Antisuero policlonal anti-GFP de conejo&nbsp;</td><td>Washington Biotechnology, Baltimore, MD</td><td></td> Western <td>blotting</td></tr><tr><td>Mouse anti&ndash; anticuerpo monoclonal de polihistidina</td><td>Qiagen GmbH, Hilden</td><td>34670</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>111-035-003</td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115-035-003</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>SuperSignal&reg; Sustrato quimioluminiscente West Pico</td><td>Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td><td>34078</td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucano)</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irlanda</td><td>P-LICHN</td><td>Actividad de la liquenasa</td></tr><tr><td>Congo Red&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C6277</td><td>Tinción en gel</td></tr><tr><td>Cámara digital&nbsp;</td><td>Olympus, Center Valley, PA</td><td>C-8080 Imágenes de</td><td>quimioluminiscencia</td></tr><tr><td>GeneGnome</td><td>Syngene, Frederick, MD</td><td></td><td>Imágenes de quimioluminiscencia&nbsp;</td></tr><tr><td>Estándar GFP&nbsp;</td><td>Imágenes de quimioluminiscencia</td> <td>hechas en casa</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>Solución de fertilizante para plantas</td><td>Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE</td><td>67-23-20</td><td>Cultivo de plantas</td></tr><tr><td>Liquenase estándar</td><td>Purificado en casa</td><td></td><td>Western blot</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>BioRad, Hercules, CA</td><td>165-2100 Transformación de</td><td>agrobacterias&nbsp;</td></tr></tbody></table>

la optimización y utilización de<em&gt; agrobacterium</em&gt; mediada por la producción de proteína transitoria en<em&gt; nicotiana</em

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

La producción de proteína transitoria mediada por Agrobacterium en plantas es un enfoque prometedor para producir antígenos de vacunas y proteínas terapéuticas en un corto período de tiempo. Sin embargo, esta tecnología sólo está empezando a aplicar a la producción a gran escala, muchos obstáculos tecnológicos para aumentar la escala de ahora están siendo superados. Este sentido, demuestran un método simple y reproducible para la producción de proteína transitoria a escala industrial basado en la infiltración de vacío de plantas de Nicotiana con Agrobacteria llevar vectores de lanzamiento. Optimización del cultivo de Agrobacterium en medio AB permite la dilución directa del cultivo bacteriano en agua Milli-Q, lo que simplifica el proceso de infiltración. Entre tres especies estudiadas de Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) fue seleccionado como el anfitrión más prometedor debido a la facilidad de la infiltración, el alto nivel de producción de la proteína reportera, y alrededor de dos fedad mayor producción de biomasa en condiciones ambientales controladas. La inducción de de Agrobacterium que alberga pBID4-GFP (virus del mosaico del tabaco a base) usando productos químicos tales como acetosiringona y monosacárido no tuvo efecto sobre el nivel de producción de proteínas. La infiltración de planta bajo de 50 a 100 mbar durante 30 o 60 segundos dio como resultado aproximadamente 95% de la infiltración de tejidos de las hojas de plantas. La infiltración con GV3101 de Agrobacterium cepa de laboratorio mostró la mayor producción de proteínas en comparación con cepas de laboratorio de Agrobacteria LBA4404 y C58C1 y de tipo salvaje cepas Agrobacteria at6, AT10, at77 y A4. Co-expresión de un ARN viral de silenciamiento supresor, p23 o p19, en N. benthamiana resultado en la acumulación antes y aumento de la producción (15-25%) de proteína diana (hemaglutinina del virus de la gripe).

La producción de proteína transitoria en plantas de Nicotiana sobre la base de infiltración al vacío con agrobacterias llevando vectores de lanzamiento (virus del mosaico del tabaco a base) es un enfoque rápido y económico para producir antígenos de vacunas y proteínas terapéuticas. Hemos simplificado el procedimiento mejorado y la acumulación de destino mediante la optimización de las condiciones de cultivo de bacterias, la selección de especies huéspedes, y co-introducción de supresores de silenciamiento de ARN.

La optimización y utilización de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada por la producción de proteína transitoria en<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un método sencillo, eficiente y escalable para la producción transitoria de proteínas recombinantes en un sistema basado en plantas, utilizando la técnica de agroinfiltración. Esto se logra primero optimizando las condiciones de crecimiento de las plantas. El segundo paso consiste en transformar Agrobacterium con vectores lanzadera que combinen componentes de virus vegetales y plásmidos binarios, seguido del cultivo de Agrobacterium transformado para su uso en los experimentos de agroinfiltración.Durante la infiltración con agrobacterium, las plantas se invierten y las partes aéreas se sumergen en una suspensión de agrobacterium. Luego se aplica un vacío que provoca la evacuación del aire de los espacios intercelulares en los tejidos foliares. A través de St Rapid, la represurización tras la liberación del vacío resulta en la infusión de la suspensión de agrobacterium en las hojas.Finalmente, el inmunotransferencia y los ensayos de fluorescencia se utilizan para demostrar la producción de proteínas recombinantes en las plantas infiltradas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la infiltración manual es que el método de infiltración al vacío puede ampliarse para la producción industrial de proteínas recombinantes, incluyendo vacunas y proteínas terapéuticas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biotecnología vegetal y facilitar aún más el uso de plantas como una plataforma alternativa para la producción comercial de proteínas recombinantes.La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando descubrimos que escalar la agrofiltración en plantas cultivadas en suelo es un desafío. Por varias razones, el suelo contiene agentes patógenos como virus, bacterias y nematodos, además de que la composición del suelo y el agua de riego varían de un lote a otro y de una temporada a otra, y con el tiempo el suelo se deteriora durante el almacenamiento. Asimismo, voltear las plantas cultivadas en suelo provocaría goteo no deseado de tierra hacia el cultivo de agrobacterias durante la infiltración.Este procedimiento será demostrado por Rebecca Snow, una ayudante de investigación senior del laboratorio de biología vegetal e ingeniería, y Emma Gut Robin Lobe. Ella, junto con Adam Trevor, quienes son ayudantes de investigación de mi laboratorio. Este estudio utiliza un medio de crecimiento vegetal hidropónico y una solución nutritiva para garantizar la uniformidad del crecimiento de las plantas y eliminar las complejidades asociadas con el uso de suelo para el cultivo vegetal.Para comenzar este procedimiento, remoje los bloques de lana de roca en una solución de fertilizante para plantas durante cinco minutos y siembre manualmente las semillas sobre la superficie de lana de roca impregnada con nutrientes. En este estudio se evaluarán tres especies de Cedar Nico Oceana: dos especies silvestres, Nico Oceana Benham Ana y Nico Oceana Excelsior, y un híbrido de Benham, Ana y Excelsior denominado Nico Oceana Excela. Cultive las plantas a partir de las semillas bajo condiciones controladas y un fotoperíodo largo en un sistema hidropónico en cascada.Nico Oceana, Bentham Miana y Nico Oceana Excela durante cuatro a cinco semanas, y Nico Oceana Excelsior durante cinco a seis semanas. Las cepas de Agrobacterium tumefaciens utilizadas en este experimento han sido transformadas con los vectores de transferencia adecuados, tal como se describe en el manuscrito adjunto. A efectos de esta demostración, se utilizan cinco cepas de Agrobacterium transformadas.GV3101, que lleva un gen reportero de proteína verde fluorescente, o GFP; GV3101, que lleva el gen viral del supresor de silenciamiento del virus del enanismo del tomate P19; y A4 GV3101, y T10, que llevan el gen de una liasa modificada o proteína transportadora lick KM. Cultive cepas de Agrobacterium durante la noche en medio LB, suplementado con 50 miligramos por litro de canamicina a 28 grados Celsius con agitación de 200 a 250 RPM. Al día siguiente, prepare suspensiones de Agrobacterium para los experimentos deseados. Para examinar la viabilidad de usar múltiples cepas de Agrobacterium para la producción transitoria de proteínas, diluya una cepa de laboratorio y dos cepas silvestres, que portan el vector PBI4 lick KM, en agua miliq hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,5.Para investigar la necesidad de inducir los genes de virulencia de agrobacterium antes de la infiltración, primero centrifugue cultivos de agrobacterium que portan el vector P bid 4G FP, crecidos en medio LB, a 4.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, re suspenda en medio de inducción MMA hasta una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,5 y agite a temperatura ambiente durante dos horas. Para probar si la acetil coenzima A mejora la producción transitoria de proteínas, centrifugue y re suspenda el cultivo de agrobacterium. Incube durante la noche en medio LB y re suspenda en tampón de infiltración que contenga sales MS 1X, 10 milimolares de MES y 2 % de glucosa.Divida la suspensión celular en cuatro recipientes. Añada una concentración diferente de acetona a cada una de las suspensiones de agrobacterium e incube a temperatura ambiente durante tres horas. Para evaluar el efecto de la co-infiltración de un supresor viral de silenciamiento sobre la producción transitoria de la proteína GFP, mezcle.Una cultura de agrobacterium que porta el gen GFP, diluida en agua milli Q, y una cultura que porta el supresor de silenciamiento viral P19 en una proporción de cuatro a uno durante la infiltración al vacío de plantas, lo cual será demostrado. A continuación, es fundamental controlar la presión de vacío y la duración de la infiltración para infiltrar al vacío las plantas. Primero, transfiera la suspensión de agrobacterium preparada a un recipiente dentro de la cámara de vacío.Luego, invierta la planta boca abajo en la agrobacterium diluida y aplique un vacío de 50 a 400 milibares durante 30 o 60 segundos. La infiltración óptima se aplica habitualmente a 50-100 milibares durante 60 segundos. Una vez roto el vacío, retire las plantas de la cámara de vacío, enjuáguelas con agua y cultívelas durante cinco a siete días en las mismas condiciones de crecimiento utilizadas para el crecimiento previo a la filtración.Para preparar muestras para análisis Western, primero, recolecte muestras aleatorias de hojas de plantas de Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior o Nico Oceana Excela entre cuatro y siete días posteriores a la infiltración o DPI. Triture las muestras de hojas en nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. Añada tres volúmenes de un tampón 1XPBS que contenga 0,5 % de Triton X-100 a cada muestra y transfiera la muestra a un tubo eppendorf. Agite suavemente o rote las muestras extraídas durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.Centrifugue el extracto durante cinco minutos y recoja la proteína soluble total en un tubo eppendorf limpio. Diluya los extractos a una dilución adecuada en tampón de extracción PBS 1X y agregue tampón de muestra 5X hasta alcanzar una concentración final de 1X. Hierva las muestras durante cinco minutos antes de separar las proteínas mediante electroforesis SDS-PAGE.Después de que las proteínas se hayan transferido a una membrana de transferencia P inmóvil, detecte la GFP utilizando suero antiproteína GFP policlonal de conejo a una dilución de uno a 5.000 en solución bloqueante. Incube a temperatura ambiente durante una hora con agitación suave tras lavar las membranas tres veces con PBS-T 20 1X. Incube con el anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante a una dilución de uno a 5.000 durante una hora para la detección de GFP.Posteriormente, los blot de Western se procesan y se analizan las intensidades de las bandas correspondientes a las proteínas según se describe en el manuscrito adjunto. La detección visual de la fluorescencia GFP en plantas transitoriamente transformadas completas se realiza utilizando una lámpara de mano de longitud de onda larga UV; utilice una cámara digital y un tiempo de exposición de 15 segundos para fotografiar las plantas transitoriamente transformadas a través de un filtro amarillo eight ES 52. Obtenga imágenes de los análisis de blot de Western utilizando el software gene snapped en un genoma.Cuantifique los resultados utilizando el software de herramienta génica con una curva de calibración basada en un estándar de GFP purificado. Nick Oceana Bentham Miana se cultivó en placas Rockwell empapadas en fertilizantes comercialmente disponibles para determinar las condiciones óptimas para el crecimiento vegetal y la acumulación de biomasa. La presencia de fósforo es fundamental para lograr la germinación y el crecimiento de NICO Oceana. Las semillas de Bentham, como lo muestran estas plantas de seis semanas de edad creciendo en una solución fertilizante que contiene 4,8 % de fósforo o en una solución fertilizante que contiene 0 % de fósforo.Se examinaron los efectos del crecimiento de Agrobacterium y los medios de infiltración sobre la salud de la planta y la producción de proteínas mediante la comparación de la producción de GFP en Nicotiana. Plantas Hamana fueron infiltradas al vacío con PBI 4G FP que portaban cultivos de Agrobacterium crecidos en tres medios diferentes. Los cultivos de YEB, AB y LB crecidos durante la noche en medios YEB o LB fueron centrifugados a baja velocidad y resuspendidos en medio de inducción MMA, o crecidos durante la noche en medios YEB, LB o AB y directamente diluidos uno a cinco o uno a diez con agua Milli-Q. Como se ilustra en este resultado de inmunotransferencia, las plantas infiltradas con cultivos de Agrobacterium crecidos en medios YEB, LB o AB y diluidos con agua Milli-Q no mostraron diferencias significativas en la producción promedio de GFP en comparación con los cultivos centrifugados y resuspendidos en MMA.Por lo tanto, se recomienda utilizar agua milli Q para diluir cultivos de agrobacterium para la infiltración de plantas, y se utilizó rutinariamente en experimentos posteriores para alcanzar una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,5. A continuación, se examinaron los efectos de la densidad de la suspensión celular de agrobacterium y del curso temporal sobre la expresión del objetivo. Se evaluaron cuatro densidades diferentes de suspensión celular de agrobacterium que portaban PBI 4G FP, y se recolectaron muestras de hojas a los cuatro, siete y 10 días posteriores a la infiltración, o DPI. En el análisis por inmunotransferencia a los cuatro DPI, se observaron diferencias notables en la fluorescencia de GFP entre plantas infiltradas con distintas densidades de suspensión celular de agrobacterium; no se observó expresión de GFP a una densidad óptica a 600 nm de 0,05 a los siete DPI.La fluorescencia fue similar en las plantas infiltradas con densidades de suspensión celular de 0,60, 0,5 y 0,1, pero fue menor en las plantas infiltradas con una densidad de A600 de 0,05 en contraste a los 10 DPI. No se observaron diferencias en la producción de GFP entre las plantas infiltradas con cualquiera de las cuatro densidades de suspensión celular para aumentar la diversidad de cepas de Agrobacterium disponibles para la producción transitoria de proteínas.Las plantas de Nicotiana Benham miana fueron infiltradas al vacío con siete cepas diferentes de bacterias agrobacterianas que portaban el vector KBI four lick km. Las hojas infiltradas se recolectaron a los siete DPI y el nivel de expresión de quinasa se estimó mediante blot de Western. Como se muestra en este gráfico, el nivel más alto de producción de liasa se logró con las cepas GV 3 1 10, 1 A four y LBA 4 4 0 4, con diferencias leves.Aunque el nivel más bajo de expresión fue con C cinco ocho C uno, se logró una producción intermedia de lisasa con las cepas a T 77 A T cero seis y a T 10. La actividad enzimática de la lisasa se demostró mediante un ensayo de XMO Graham. La proteína bacteriana de lisasa purificada se utilizó como control positivo para la actividad enzimática. Es interesante observar que las plantas de nicotiana Benham miana infiltradas con las cepas silvestres de agrobacterium A cuatro y a T siete siete mostraron síntomas patológicos tales como enanismo, alargamiento y rizamiento del pecíolo, y rizamiento de hojas a los siete DPI.Los síntomas fueron leves en plantas de nicotiana benham infiltradas con la cepa silvestre T 10. No se observaron síntomas en plantas de Nico Oceana Benham infiltradas con la cepa de laboratorio GV 3 1 0 1. Una comparación de la producción de biomasa vegetal en la especie silvestre reveló que, bajo las mismas condiciones de crecimiento, la biomasa foliar más alta que puede generarse a partir de Nico Oceana Excela es aproximadamente dos veces mayor en comparación con Nico Oceana.La producción de proteína Benham se examinó en Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior y Nico Oceana Excela infiltradas con la cepa de agrobacterium. Se evaluó la acumulación de PBI 4G F-P-G-F-P en GV 3 1 0 1 a los siete DPI en hojas enteras infiltradas. El examen visual de la expresión de GFP bajo luz ultravioleta mostró una distribución uniforme de GFP en Nico Oceana Hamana y Nico Oceana Excela, y una distribución irregular en Nico Oceana Excelsior debido a la dificultad para infiltrar completamente el área foliar de Nico Oceana Excelsior. El análisis por inmunotransferencia de la acumulación de GFP en estas hojas infiltradas a los siete DPI mostró que el nivel de GFP fue mayor en Nico Oceana Hamana que en Nico Oceana Excela y Nico Oceana Excelsior, lo que indica un bajo nivel de producción proteica en Nico Oceana.Excelsior se debe a una infiltración desigual y una distribución irregular de la GFP acumulada en la hoja recolectada. Para evaluar el efecto de la presión de vacío sobre las hojas, las plantas de Nico Oceana Benham fueron infiltradas con la cepa de agrobacterium GV 3 1 0 1 que portaba PBI 4G FP, bajo presiones de vacío de 400, 200, 100 o 50 milibares y tiempos de mantenimiento en vacío de 30 o 60 segundos. No se observaron diferencias en la producción de GFP ni impactos perjudiciales, leves o nulos, sobre la salud de las plantas cuando se aplicaron presiones de vacío de 5, 100 y 200 milibares durante 30 o 60 segundos.Se evaluó el efecto de la duración del vacío sobre la expresión del gen objetivo infiltrando una bandeja de plantas de Nico Oceana Benham cada hora con una A600 de 0,5 de GV3101 que portaba PBI4GFP durante ocho horas. En la misma cultura de agrobacterium mostrada en este resultado representativo, el nivel de producción de GFP fue similar en todos los puntos temporales hasta las ocho horas, lo que sugiere que durante este período el agrobacterium mantiene su capacidad para transferir ADN de cadena sencilla. Dado que se ha reportado que muchas sustancias químicas y monosacáridos aumentan la producción transitoria de proteínas en diversas especies vegetales.Este estudio también evaluó el efecto de diferentes concentraciones de aceto, crinona y glucosa sobre la producción transitoria de la proteína GFP en Nicotiana occidentalis Benham, infiltrada con la cepa de Agrobacterium GV3101 que portaba PBI4GFP. Las bacterias agrobacterianas se cultivaron durante la noche en medio YEB, se centrifugaron y se resuspendieron hasta una A600 de 0,5 ya sea en medio MMA que contenía 2 % de glucosa con acetosirone en las concentraciones indicadas, o en medio MMA que contenía acetofenona a 200 micromolares con glucosa en las concentraciones indicadas. Como se muestra aquí, ninguna de las concentraciones ensayadas de estos compuestos indujo un aumento significativo en la producción de proteína GFP en comparación con el control, en el que el medio de inducción no contenía acetofenona ni glucosa.A continuación, se examinó el efecto de la coinfiltración de un supresor de silenciamiento sobre la expresión transitoria de los genes GFP y HAC en hojas de Nicotiana benthamiana. Las hojas de Nicotiana benthamiana se examinaron previamente a la infiltración; cultivos de Agrobacterium GV3101 que portaban PBI 4G FP y el supresor viral de silenciamiento P19 del virus del enanismo del tomate se mezclaron respectivamente en proporciones de 1:1, 2:1, 3:1 y 4:1. Tal como indican los resultados del análisis por inmunotransferencia (Western blot) a los 7 DPI, la presencia de P19 no aumentó ni disminuyó la producción de GFP en Nicotiana benthamiana en ninguna de las proporciones utilizadas entre las suspensiones de Agrobacterium.Además, se investigó el efecto de dos supresores virales del silenciamiento génico, P 23 y P 19, sobre la prevención del silenciamiento génico postranscripcional de HAC uno. POS de Agrobacterium que portaban el vector lanzadera PBI cuatro HAC uno, y uno de los dos plásmidos supresores del silenciamiento viral, se mezclaron en una proporción de cuatro a uno, respectivamente, y se coinfiltraron en Nicotiana Benthamiana. Las muestras de hojas infiltradas se recolectaron entre tres y ocho DPI.Este gráfico muestra los niveles promedio de expresión de HAC uno obtenidos en tres experimentos, determinados mediante análisis de blot de Western. La co-infiltración de Nico Oceana Benham con P 23 o P 19 resultó en un aumento en la producción de HAC uno en comparación con el uso de ningún supresor de silenciamiento a las 60 hpi. Esto sugiere que P 23 y P 19 son eficientes en este sistema.También se observó que tanto en presencia como en ausencia de un supresor de silenciamiento, el nivel de producción de la proteína HAC1 comenzó a disminuir a los siete DPI. Esto indica que el momento del descenso en la producción transitoria de proteínas en Nicotiana benthamiana infiltradas con el vector lanzadera es específico del blanco. Por último, la estabilidad del banco de células de Agrobacterium se evalúa anualmente infiltrando plantas de Nicotiana benthamiana con el mismo lote del banco de células de Agrobacterium para evaluar la acumulación de proteína.Estos resultados representativos indican que la producción de la proteína HA uno ha sido muy estable durante más de tres años. La producción promedio de HAC uno en plantas de Nicotiana benam es de 651 más o menos 49,4 miligramos por kilogramo. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar la técnica de agroinfiltración para la producción a gran escala de proteínas recombinantes, que pueden utilizarse para fabricar vacunas de subunidades, anticuerpos contra proteínas terapéuticas y antígenos diagnósticos.Al intentar este procedimiento, es importante recordar controlar el cruzamiento de plantas hidropónicamente, utilizar bacterias agrobacterianas viables, controlar la presión de vacío y la agitación, y monitorear el vehículo de expresión proteica. Una vez dominada, la técnica de filtración agro puede realizarse en 24 horas si se lleva a cabo adecuadamente bajo condiciones controladas.

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