La optimización y utilización de Agrobacterium Mediada por la producción de proteína transitoria en Nicotiana

La producción de proteína transitoria en plantas de Nicotiana sobre la base de infiltración al vacío con agrobacterias llevando vectores de lanzamiento (virus del mosaico del tabaco a base) es un enfoque rápido y económico para producir antígenos de vacunas y proteínas terapéuticas. Hemos simplificado el procedimiento mejorado y la acumulación de destino mediante la optimización de las condiciones de cultivo de bacterias, la selección de especies huéspedes, y co-introducción de supresores de silenciamiento de ARN.

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un método simple, eficiente y escalable para la producción de proteínas recombinantes transitorias en un sistema basado en plantas utilizando la técnica de agroinfiltración. Esto se logra optimizando primero las condiciones de crecimiento de las plantas. El segundo paso es transformar la agrobacteria con vectores de lanzamiento que combinen componentes de virus de plantas y plásmidos binarios, seguido del cultivo de la agrobacteria transformada para su uso en los experimentos agrícolas.

Durante la infiltración de agrobacterias, las plantas se voltean boca abajo y las partes aéreas se sumergen en una suspensión de agrobacterias. A continuación, se aplica un vacío que hace que el aire sea evacuado de los espacios intercelulares en los tejidos de las hojas. A través de St Rapid, la represurización después de la liberación del vacío da como resultado la infusión de la suspensión de agrobacteria en las hojas.

En última instancia, se utilizan ensayos de inmunotransferencia y fluorescencia para mostrar la producción de proteínas recombinantes en las plantas infiltradas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la infiltración manual, es que el método de infiltración al vacío puede ampliarse para la producción industrial de proteínas recombinantes, incluidas vacunas y proteínas terapéuticas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biotecnología vegetal y facilitar aún más el uso de las plantas como plataforma alternativa para la producción comercial de proteínas recombinantes.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando descubrimos que la ampliación de la agrofiltración en las plantas que cultivan el suelo es un desafío. Por varias razones, el suelo contiene uchinas como virus, bacterias, nematodos y, además, el contenido del suelo y el agua de riego varían de un lote a otro y de una estación a otra, y el suelo se convierte con el tiempo en el almacenamiento. Además, el volteo de las plantas en crecimiento del suelo daría lugar a un goteo no deseado del suelo en el cultivo de agrobacterias durante la infiltración.

La demostración de este procedimiento estará a cargo de Rebecca Snow, asistente de investigación sénior del laboratorio de biología vegetal e ingeniería, y Emma Gut Robin Lobe. Ella, ella y Adam Trevor, que son asistentes de investigación de mi laboratorio. Este estudio utiliza un medio de crecimiento hidropónico de plantas y una solución de nutrientes para garantizar la uniformidad del crecimiento de las plantas y eliminar las complejidades asociadas con el uso del suelo para el cultivo de plantas.

Para comenzar este procedimiento, remoje las losas de lana de roca en una solución de fertilizante para plantas durante cinco minutos, siembre manualmente las semillas en la superficie de lana de roca empapada en nutrientes. Utilizando el cedro se evaluarán tres especies de Nico Oceana en este estudio, dos especies de tipo silvestre, Nico Oceana, Benham Ana y Nico Oceana Excelsior, y un híbrido de Benham, Ana y Excelsior llamado Nico Oceana. Excela cultiva plantas a partir de las semillas en condiciones controladas y un largo período de fotografía en un sistema hidropónico en cascada.

Nico Oceana, Bentham Miana y Nico Oceana Excela durante cuatro o cinco semanas, y Nico Oceana Excelsior durante cinco o seis semanas. Las cepas de Agrobacterium tumor Fasion utilizadas en este experimento se han transformado con los vectores de lanzamiento apropiados, tal y como se describe en el manuscrito adjunto. Para los fines de esta demostración, se utilizan cinco cepas de agrobacterias transformadas.

GV 3 1 0 1, portador de una proteína fluorescente verde reportera, o gen GFP GV 3 1 0 1, portador del gen viral del supresor silenciador del virus del achaparramiento del tomate P 19 y A cuatro GV 3 1 0 1, y un T 10. Portando el gen de una proteína transportadora modificada con liase o lamer KM, cultive cepas de agrobacterias durante la noche en medio LB, suplementado con 50 miligramos por litro de micina en lata a 28 grados Celsius con agitación a 200 a 250 RPM al día siguiente. Preparar suspensiones de agrobacterias para los experimentos deseados para examinar la factibilidad de utilizar múltiples cepas de agrobacterias para la producción de proteínas transitorias, diluir una cepa de laboratorio y dos cepas de tipo salvaje, albergando el vector PBI de cuatro km de lamida en agua mili Q a una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,5.

Para investigar la necesidad de inducir genes de virulencia de agrobacterium antes de la infiltración, primero se centrifugaron cultivos de agrobacterias que portan el vector P bid 4G FP cultivado en medio LB a 4.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, vuelva a suspender en medio de inducción MMA a una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,5 y agite a temperatura ambiente durante dos horas para comprobar si el cono de acetilo mejora la producción transitoria de proteínas, la centrífuga y el cultivo de agrobacterias. Llevando el vector PBI 4G FP cultivado durante la noche en medio LB y resuspendido en tampón de infiltración que contiene un X ms de sal 10 milimolar, MES y 2% de glucosa.

Divida la suspensión celular en cuatro recipientes. Agregue una concentración diferente de cono de aceto a cada una de las suspensiones de agrobacterium e incube a temperatura ambiente durante tres horas. Probar el efecto de la infiltración de co de un supresor silenciador viral en la mezcla transitoria de producción de proteínas GFP.

Un cultivo de agrobacteria diluido en agua mili Q portador del gen GFP y un cultivo portador del supresor silenciador viral P 19 en una proporción de cuatro a uno durante la infiltración al vacío de las plantas, lo que se demostrará. A continuación, es fundamental controlar la presión de vacío y la duración de la infiltración para infiltrar plantas de vacío. Primero, transfiera la suspensión de agrobacteria preparada a un recipiente dentro de la cámara de vacío.

A continuación, voltee la planta boca abajo en la agrobacteria diluida y aplique una aspiradora de 50 a 400 milibares durante 30 o 60 segundos. La infiltración óptima se aplica de forma rutinaria a 50 a 100 milibares durante 60 segundos. Una vez que se rompa el vacío, retire las plantas de la cámara de vacío, enjuague con agua y crezca durante cinco a siete días en las mismas condiciones de crecimiento que se usan para el crecimiento previo a la filtración.

Para preparar muestras para el análisis occidental, primero, recoja muestras de hojas aleatorias de las plantas Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior o Nico Oceana Excela a los cuatro a siete días después de la infiltración o DPI pulverize las muestras de hojas en nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. Añada tres volúmenes de un tampón XPBS que contenga 0,5%Triton X 100 a cada muestra y transfiera la muestra a un tubo de einor. Agite o gire suavemente las muestras extraídas durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

Centrifuga el extracto durante cinco minutos y recoge la proteína soluble total en un tubo de einor limpio. Diluya los extractos hasta una dilución adecuada en un tampón de extracción XPBS y agregue cinco tampones de muestra a una concentración final de una X. Hervir las muestras durante cinco minutos antes de separar las proteínas por página SDS.

Después de que las proteínas se hayan transferido a una membrana de transferencia de P inmóvil y se detecte GFP utilizando antisuero policlonal anti GFP de conejo en una dilución de 1 a 5.000 en solución de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante una hora con un suave balanceo después de lavar las membranas tres veces con un X-P-B-S-T 20. Incubar con el anticuerpo antirrabioso conjugado con peroxidasa de rábano picante, agregue una dilución de uno a 5, 000 durante una hora para la detección de GFP.

Posteriormente, se procesan los Western blots y se analizan las intensidades de banda correspondientes a las proteínas, tal y como se describe en el manuscrito adjunto. La detección visual de la fluorescencia de GFP en plantas enteras transformadas transitoriamente se realiza utilizando una lámpara UV de longitud de onda larga de mano, utilizando una cámara digital y un tiempo de exposición de 15 segundos para fotografiar plantas transformadas transitoriamente a través de un filtro amarillo ocho ES 52. Obtenga imágenes de análisis de Western blot utilizando el software de captura de genes en un genoma.

Para cuantificar los resultados utilizando el software de la herramienta genética con una curva de calibración basada en un estándar GFP purificado, Nick Oceana Bentham Miana se cultivó en losas Rockwell empapadas en fertilizantes disponibles comercialmente para determinar las condiciones óptimas para el crecimiento de las plantas y la acumulación de biomasa. La presencia de fósforo es fundamental para lograr la germinación y el crecimiento de NICO Oceana. Semillas de Bentham, como se muestra en estas plantas de seis semanas de edad, que crecen en una solución de fertilizante que contiene 4,8% de fósforo o una solución de fertilizante que contiene 0% de fósforo.

Se examinaron los efectos del crecimiento de agrobacterias y los medios de infiltración en la salud de las plantas y la producción de proteínas comparando la producción de GFP en nicotiana. Plantas de Hamana infiltradas al vacío con PBI 4G FP que albergan cultivos de agrobacterias cultivadas en tres medios diferentes. Los cultivos YEB AB y LB cultivados durante la noche en medios YEB o LB se centrifugaron a baja velocidad y se resuspendieron en medio de inducción MMA o se cultivaron durante la noche en medios YEB LB o AB y se diluyeron directamente de uno a cinco o de uno a 10 con agua Milli Q, como se ilustra en este resultado de Western blot, las plantas infiltradas con cultivos de agrobacterias cultivadas en medios YEB LB o AB y diluidas con Milli Q. El agua no mostró diferencias significativas en la producción promedio de GFP a partir de cultivos centrifugados y resuspendidos en MMA.

Por lo tanto, el agua mili Q se recomienda para diluir cultivos de agrobacterias para la infiltración de plantas y se usó de manera rutinaria en experimentos posteriores para lograr una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,5. A continuación, se examinaron los efectos de la densidad de suspensión celular de agrobacterias y su curso temporal en la expresión de la diana. Se evaluaron cuatro densidades diferentes de suspensión celular de agrobacteria portadora de PBI 4G FP y se recolectaron muestras de hojas a los cuatro, siete y 10 días después de la infiltración o DPI para el análisis de Western blot a cuatro DPI, hubo diferencias notables en la fluorescencia de GFP entre plantas infiltradas con diferentes densidades de suspensión celular de agrobacterium no se observó expresión de GFP a un 600 de 0.05 a siete D-P-I-G-F-P.

La fluorescencia fue similar en las plantas infiltradas en la suspensión celular. Densidades de un 601.0 0.5 y 0.1, pero fue menor infiltrado de implantes a un A 600 de 0.05 en contraste a 10 DPI. No se observaron diferencias en la producción de GFP entre las plantas infiltradas con cualquiera de las cuatro densidades de suspensión celular para aumentar la diversidad de cepas de agrobacterias disponibles para la producción de proteínas transitorias.

Las plantas de miana de Nicotiana Benham se infiltraron al vacío con siete cepas diferentes de agrobacterias que albergaban el vector KBI a cuatro kilómetros de lamejanza. Las hojas infiltradas se recolectaron a siete DPI y el nivel de expresión de quinasas se estimó por Western blot. Como se muestra en este gráfico, el nivel más alto de producción de liasa se alcanzó con las cepas GV 3 1 10, 1 A cuatro y LBA 4 4 0 4 con ligeras diferencias.

Mientras que el nivel más bajo de expresión fue con C, cinco, ocho, C, una producción intermedia de liasa se logró con cepas, una T 77, A, T cero, seis y una T 10, la actividad enzimática de la liasa se demostró mediante un ensayo XMO Graham. La proteína liasa bacteriana purificada se utilizó como control positivo de la actividad enzimática. Es interesante notar que las plantas de nicotiana Benham miana infiltradas con las cepas de agrobacterias de tipo silvestre A four y T seven seven mostraron síntomas patológicos como retraso en el crecimiento, elongación y rizado de mascotas y rizado de hojas a siete DPI.

Los síntomas fueron leves en las plantas de nicotiana benham infiltradas con el tipo silvestre en la cepa T 10. No se observaron síntomas en las plantas de Nico Oceana Benham infiltradas con la cepa de laboratorio GV 3 1 0 1. Una comparación de la producción de biomasa vegetal en las especies de tipo silvestre reveló que, en las mismas condiciones de crecimiento, la mayor biomasa foliar que se puede generar a partir de Nico Oceana Excela es aproximadamente dos veces mayor en comparación con Nico Oceana.

Se examinó la producción de proteína Benham en Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior y Nico Oceana Excela infiltrados con la cepa agrobacterium. La acumulación de GV 3 1 0 1 que alberga PBI 4G F-P-G-F-P se evaluó en siete DPI en hojas enteras infiltradas. El examen visual de la expresión de GFP bajo luz ultravioleta mostró una distribución uniforme de GFP en Nico Oceana Hamana y Nico Oceana Excela y una distribución desigual en Nico Oceana Excelsior debido a la dificultad de infiltrar un área foliar completa de Nico Oceana Excelsior, el análisis de Western blot de la acumulación de GFP en estas hojas infiltradas a siete DPI mostró que el nivel de GFP era mayor en Nico Oceana Hamana que en Nico Oceana Excela y Nico Oceana Excelsior el bajo nivel de producción de proteínas en Nico Oceana.

Excelsior se debe a una infiltración desigual y a una distribución desigual de la GFP acumulada en la hoja recolectada. Para probar el efecto de la presión de vacío en las hojas, las plantas de Nico Oceana Benham se infiltraron con la cepa de agrobacteria GV 3 1 0 1 que alberga PBI 4G FP bajo presiones de vacío de 400, 200, 100 o 50 milibar a un tiempo de retención al vacío de 30 o 60 segundos. No se observaron diferencias en la producción de GFP y un impacto leve o nulo en la salud de la planta cuando se aplicaron presiones de vacío de 5, 100 y 200 milibares durante 30 o 60 segundos.

El efecto de la duración del vacío sobre la expresión diana se evaluó infiltrando un piso de plantas de Nico Oceana Benham cada hora con un A 600 de 0,5 de GV 3 1 0 1 que albergan PBI 4G FP durante ocho horas. En el mismo cultivo de agrobacterias que se muestra en este resultado representativo, el nivel de producción de GFP fue similar en todo momento, apuntes de hasta ocho horas, lo que sugiere que durante este período de tiempo la agrobacteria mantiene su capacidad de lanzar un solo ADN catenario. Dado que se ha informado que muchos productos químicos y monosacáridos mejoran la producción transitoria de proteínas en varias especies de plantas.

Este estudio también evaluó el efecto de diferentes concentraciones de aceto, crinona y glucosa. En la producción transitoria de proteína GFP en Nico Oceana Benham, Ana infiltrada con la cepa agrobacterium, GV 3 1 0 1 que alberga PBI 4G FP. Las agrobacterias se cultivaron durante la noche en medios YEB, se centrifugaron y se resuspendieron a un 600 de 0,5, ya sea en MMA que contenía 2% de glucosa con acetilserona a las concentraciones indicadas o en MMA que contenía 200 micromolares de acetofenona con glucosa en las concentraciones indicadas. Como se muestra aquí, ninguna de las concentraciones probadas de estos compuestos indujo un aumento significativo en la producción de proteínas GFP en comparación con el control donde los medios de inducción no contenían acetofenona o glucosa.

A continuación, se analiza el efecto de la infiltración de un silenciador en la expresión transitoria de los genes GFP y HAC uno en Nico Oceana. Las hojas de Benham se examinaron antes de la infiltración de la agrobacteria GV tres uno diez un cultivos que albergaban PBI 4G FP y el supresor silenciador viral P 19 del virus del achaparramiento del tomate se mezclaron respectivamente en proporciones de uno a uno, dos a uno, tres a uno y cuatro a uno. Como lo indican los resultados del análisis de Western blot a siete DPI, la presencia de P 19 no aumentó ni disminuyó la producción de GFP en nicotiana Benham Miana en ninguna proporción de dos de las suspensiones de agrobacterias.

Además, se investigó el efecto de dos supresores de silenciamiento génico viral P 23 y P 19 en la prevención del silenciamiento génico postranscripcional para HAC uno. Los POS de agrobacterias portadoras del vector de lanzamiento PBI, cuatro HAC, uno, y uno de los dos plásmidos supresores de silenciamiento viral se mezclaron en una proporción de cuatro a uno respectivamente y se infiltraron en Nicotiana Bentham Miana. Las muestras de hojas infiltradas se recolectaron de tres a ocho DPI.

Este gráfico muestra los niveles promedio de HAC una expresión de tres experimentos, según lo determinado por el análisis de Western blot. La infiltración de Nico Oceana Benham con P 23 o P 19 resultó en un aumento en la producción de HAC uno en comparación con el uso de ningún supresor silenciador a 60 pi. Esto sugiere que P 23 y P 19 son eficientes en este sistema.

También se observó que tanto en presencia como en ausencia de un supresor silenciador, el nivel de producción de la proteína HAC una comenzó a disminuir a los siete DPI. Esto indica que el momento de la disminución en la producción de proteína transitoria en Nico Oceana Benham Miana infiltrada con el vector de lanzamiento es específico del objetivo. Por último, la estabilidad del banco de células Agrobacterium se evalúa cada año infiltrando plantas de nicotiana benham con el mismo lote del banco de células Agrobacterium para evaluar la acumulación de proteínas.

Estos resultados representativos indican que la producción de proteína HA one ha sido muy estable durante más de tres años. La producción promedio de HAC uno en las plantas de Nicotiana benam es de 651 más o menos 49.4 miligramos por kilogramo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aplicar la técnica de infiltración agrícola para la producción de proteínas recombinantes a gran escala, que se pueden usar para fabricar vacunas de subunidades, anticuerpos de proteínas theo y antígenos de diagnóstico.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar controlar el cruce de plantas hidropónicamente, utilizar agrobacterias viables, controlar la presión y la radiación de vacío, y monitorear el vehículo de expresión de proteínas. Una vez dominada, la técnica de agrofiltración se puede realizar en 24 horas si se realiza correctamente en condiciones controladas.