La optimización y utilización de

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un método sencillo, eficiente y escalable para la producción transitoria de proteínas recombinantes en un sistema basado en plantas, utilizando la técnica de agroinfiltración. Esto se logra primero optimizando las condiciones de crecimiento de las plantas. El segundo paso consiste en transformar Agrobacterium con vectores lanzadera que combinen componentes de virus vegetales y plásmidos binarios, seguido del cultivo de Agrobacterium transformado para su uso en los experimentos de agroinfiltración.

Durante la infiltración con agrobacterium, las plantas se invierten y las partes aéreas se sumergen en una suspensión de agrobacterium. Luego se aplica un vacío que provoca la evacuación del aire de los espacios intercelulares en los tejidos foliares. A través de St Rapid, la represurización tras la liberación del vacío resulta en la infusión de la suspensión de agrobacterium en las hojas.

Finalmente, el inmunotransferencia y los ensayos de fluorescencia se utilizan para demostrar la producción de proteínas recombinantes en las plantas infiltradas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la infiltración manual es que el método de infiltración al vacío puede ampliarse para la producción industrial de proteínas recombinantes, incluyendo vacunas y proteínas terapéuticas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biotecnología vegetal y facilitar aún más el uso de plantas como una plataforma alternativa para la producción comercial de proteínas recombinantes.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando descubrimos que escalar la agrofiltración en plantas cultivadas en suelo es un desafío. Por varias razones, el suelo contiene agentes patógenos como virus, bacterias y nematodos, además de que la composición del suelo y el agua de riego varían de un lote a otro y de una temporada a otra, y con el tiempo el suelo se deteriora durante el almacenamiento. Asimismo, voltear las plantas cultivadas en suelo provocaría goteo no deseado de tierra hacia el cultivo de agrobacterias durante la infiltración.

Este procedimiento será demostrado por Rebecca Snow, una ayudante de investigación senior del laboratorio de biología vegetal e ingeniería, y Emma Gut Robin Lobe. Ella, junto con Adam Trevor, quienes son ayudantes de investigación de mi laboratorio. Este estudio utiliza un medio de crecimiento vegetal hidropónico y una solución nutritiva para garantizar la uniformidad del crecimiento de las plantas y eliminar las complejidades asociadas con el uso de suelo para el cultivo vegetal.

Para comenzar este procedimiento, remoje los bloques de lana de roca en una solución de fertilizante para plantas durante cinco minutos y siembre manualmente las semillas sobre la superficie de lana de roca impregnada con nutrientes. En este estudio se evaluarán tres especies de Cedar Nico Oceana: dos especies silvestres, Nico Oceana Benham Ana y Nico Oceana Excelsior, y un híbrido de Benham, Ana y Excelsior denominado Nico Oceana Excela. Cultive las plantas a partir de las semillas bajo condiciones controladas y un fotoperíodo largo en un sistema hidropónico en cascada.

Nico Oceana, Bentham Miana y Nico Oceana Excela durante cuatro a cinco semanas, y Nico Oceana Excelsior durante cinco a seis semanas. Las cepas de Agrobacterium tumefaciens utilizadas en este experimento han sido transformadas con los vectores de transferencia adecuados, tal como se describe en el manuscrito adjunto. A efectos de esta demostración, se utilizan cinco cepas de Agrobacterium transformadas.

GV3101, que lleva un gen reportero de proteína verde fluorescente, o GFP; GV3101, que lleva el gen viral del supresor de silenciamiento del virus del enanismo del tomate P19; y A4 GV3101, y T10, que llevan el gen de una liasa modificada o proteína transportadora lick KM. Cultive cepas de Agrobacterium durante la noche en medio LB, suplementado con 50 miligramos por litro de canamicina a 28 grados Celsius con agitación de 200 a 250 RPM. Al día siguiente, prepare suspensiones de Agrobacterium para los experimentos deseados. Para examinar la viabilidad de usar múltiples cepas de Agrobacterium para la producción transitoria de proteínas, diluya una cepa de laboratorio y dos cepas silvestres, que portan el vector PBI4 lick KM, en agua miliq hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,5.

Para investigar la necesidad de inducir los genes de virulencia de agrobacterium antes de la infiltración, primero centrifugue cultivos de agrobacterium que portan el vector P bid 4G FP, crecidos en medio LB, a 4.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, re suspenda en medio de inducción MMA hasta una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,5 y agite a temperatura ambiente durante dos horas. Para probar si la acetil coenzima A mejora la producción transitoria de proteínas, centrifugue y re suspenda el cultivo de agrobacterium. Incube durante la noche en medio LB y re suspenda en tampón de infiltración que contenga sales MS 1X, 10 milimolares de MES y 2 % de glucosa.

Divida la suspensión celular en cuatro recipientes. Añada una concentración diferente de acetona a cada una de las suspensiones de agrobacterium e incube a temperatura ambiente durante tres horas. Para evaluar el efecto de la co-infiltración de un supresor viral de silenciamiento sobre la producción transitoria de la proteína GFP, mezcle.

Una cultura de agrobacterium que porta el gen GFP, diluida en agua milli Q, y una cultura que porta el supresor de silenciamiento viral P19 en una proporción de cuatro a uno durante la infiltración al vacío de plantas, lo cual será demostrado. A continuación, es fundamental controlar la presión de vacío y la duración de la infiltración para infiltrar al vacío las plantas. Primero, transfiera la suspensión de agrobacterium preparada a un recipiente dentro de la cámara de vacío.

Luego, invierta la planta boca abajo en la agrobacterium diluida y aplique un vacío de 50 a 400 milibares durante 30 o 60 segundos. La infiltración óptima se aplica habitualmente a 50-100 milibares durante 60 segundos. Una vez roto el vacío, retire las plantas de la cámara de vacío, enjuáguelas con agua y cultívelas durante cinco a siete días en las mismas condiciones de crecimiento utilizadas para el crecimiento previo a la filtración.

Para preparar muestras para análisis Western, primero, recolecte muestras aleatorias de hojas de plantas de Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior o Nico Oceana Excela entre cuatro y siete días posteriores a la infiltración o DPI. Triture las muestras de hojas en nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. Añada tres volúmenes de un tampón 1XPBS que contenga 0,5 % de Triton X-100 a cada muestra y transfiera la muestra a un tubo eppendorf. Agite suavemente o rote las muestras extraídas durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.

Centrifugue el extracto durante cinco minutos y recoja la proteína soluble total en un tubo eppendorf limpio. Diluya los extractos a una dilución adecuada en tampón de extracción PBS 1X y agregue tampón de muestra 5X hasta alcanzar una concentración final de 1X. Hierva las muestras durante cinco minutos antes de separar las proteínas mediante electroforesis SDS-PAGE.

Después de que las proteínas se hayan transferido a una membrana de transferencia P inmóvil, detecte la GFP utilizando suero antiproteína GFP policlonal de conejo a una dilución de uno a 5.000 en solución bloqueante. Incube a temperatura ambiente durante una hora con agitación suave tras lavar las membranas tres veces con PBS-T 20 1X. Incube con el anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante a una dilución de uno a 5.000 durante una hora para la detección de GFP.

Posteriormente, los blot de Western se procesan y se analizan las intensidades de las bandas correspondientes a las proteínas según se describe en el manuscrito adjunto. La detección visual de la fluorescencia GFP en plantas transitoriamente transformadas completas se realiza utilizando una lámpara de mano de longitud de onda larga UV; utilice una cámara digital y un tiempo de exposición de 15 segundos para fotografiar las plantas transitoriamente transformadas a través de un filtro amarillo eight ES 52. Obtenga imágenes de los análisis de blot de Western utilizando el software gene snapped en un genoma.

Cuantifique los resultados utilizando el software de herramienta génica con una curva de calibración basada en un estándar de GFP purificado. Nick Oceana Bentham Miana se cultivó en placas Rockwell empapadas en fertilizantes comercialmente disponibles para determinar las condiciones óptimas para el crecimiento vegetal y la acumulación de biomasa. La presencia de fósforo es fundamental para lograr la germinación y el crecimiento de NICO Oceana. Las semillas de Bentham, como lo muestran estas plantas de seis semanas de edad creciendo en una solución fertilizante que contiene 4,8 % de fósforo o en una solución fertilizante que contiene 0 % de fósforo.

Se examinaron los efectos del crecimiento de Agrobacterium y los medios de infiltración sobre la salud de la planta y la producción de proteínas mediante la comparación de la producción de GFP en Nicotiana. Plantas Hamana fueron infiltradas al vacío con PBI 4G FP que portaban cultivos de Agrobacterium crecidos en tres medios diferentes. Los cultivos de YEB, AB y LB crecidos durante la noche en medios YEB o LB fueron centrifugados a baja velocidad y resuspendidos en medio de inducción MMA, o crecidos durante la noche en medios YEB, LB o AB y directamente diluidos uno a cinco o uno a diez con agua Milli-Q. Como se ilustra en este resultado de inmunotransferencia, las plantas infiltradas con cultivos de Agrobacterium crecidos en medios YEB, LB o AB y diluidos con agua Milli-Q no mostraron diferencias significativas en la producción promedio de GFP en comparación con los cultivos centrifugados y resuspendidos en MMA.

Por lo tanto, se recomienda utilizar agua milli Q para diluir cultivos de agrobacterium para la infiltración de plantas, y se utilizó rutinariamente en experimentos posteriores para alcanzar una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,5. A continuación, se examinaron los efectos de la densidad de la suspensión celular de agrobacterium y del curso temporal sobre la expresión del objetivo. Se evaluaron cuatro densidades diferentes de suspensión celular de agrobacterium que portaban PBI 4G FP, y se recolectaron muestras de hojas a los cuatro, siete y 10 días posteriores a la infiltración, o DPI. En el análisis por inmunotransferencia a los cuatro DPI, se observaron diferencias notables en la fluorescencia de GFP entre plantas infiltradas con distintas densidades de suspensión celular de agrobacterium; no se observó expresión de GFP a una densidad óptica a 600 nm de 0,05 a los siete DPI.

La fluorescencia fue similar en las plantas infiltradas con densidades de suspensión celular de 0,60, 0,5 y 0,1, pero fue menor en las plantas infiltradas con una densidad de A600 de 0,05 en contraste a los 10 DPI. No se observaron diferencias en la producción de GFP entre las plantas infiltradas con cualquiera de las cuatro densidades de suspensión celular para aumentar la diversidad de cepas de Agrobacterium disponibles para la producción transitoria de proteínas.

Las plantas de Nicotiana Benham miana fueron infiltradas al vacío con siete cepas diferentes de bacterias agrobacterianas que portaban el vector KBI four lick km. Las hojas infiltradas se recolectaron a los siete DPI y el nivel de expresión de quinasa se estimó mediante blot de Western. Como se muestra en este gráfico, el nivel más alto de producción de liasa se logró con las cepas GV 3 1 10, 1 A four y LBA 4 4 0 4, con diferencias leves.

Aunque el nivel más bajo de expresión fue con C cinco ocho C uno, se logró una producción intermedia de lisasa con las cepas a T 77 A T cero seis y a T 10. La actividad enzimática de la lisasa se demostró mediante un ensayo de XMO Graham. La proteína bacteriana de lisasa purificada se utilizó como control positivo para la actividad enzimática. Es interesante observar que las plantas de nicotiana Benham miana infiltradas con las cepas silvestres de agrobacterium A cuatro y a T siete siete mostraron síntomas patológicos tales como enanismo, alargamiento y rizamiento del pecíolo, y rizamiento de hojas a los siete DPI.

Los síntomas fueron leves en plantas de nicotiana benham infiltradas con la cepa silvestre T 10. No se observaron síntomas en plantas de Nico Oceana Benham infiltradas con la cepa de laboratorio GV 3 1 0 1. Una comparación de la producción de biomasa vegetal en la especie silvestre reveló que, bajo las mismas condiciones de crecimiento, la biomasa foliar más alta que puede generarse a partir de Nico Oceana Excela es aproximadamente dos veces mayor en comparación con Nico Oceana.

La producción de proteína Benham se examinó en Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior y Nico Oceana Excela infiltradas con la cepa de agrobacterium. Se evaluó la acumulación de PBI 4G F-P-G-F-P en GV 3 1 0 1 a los siete DPI en hojas enteras infiltradas. El examen visual de la expresión de GFP bajo luz ultravioleta mostró una distribución uniforme de GFP en Nico Oceana Hamana y Nico Oceana Excela, y una distribución irregular en Nico Oceana Excelsior debido a la dificultad para infiltrar completamente el área foliar de Nico Oceana Excelsior. El análisis por inmunotransferencia de la acumulación de GFP en estas hojas infiltradas a los siete DPI mostró que el nivel de GFP fue mayor en Nico Oceana Hamana que en Nico Oceana Excela y Nico Oceana Excelsior, lo que indica un bajo nivel de producción proteica en Nico Oceana.

Excelsior se debe a una infiltración desigual y una distribución irregular de la GFP acumulada en la hoja recolectada. Para evaluar el efecto de la presión de vacío sobre las hojas, las plantas de Nico Oceana Benham fueron infiltradas con la cepa de agrobacterium GV 3 1 0 1 que portaba PBI 4G FP, bajo presiones de vacío de 400, 200, 100 o 50 milibares y tiempos de mantenimiento en vacío de 30 o 60 segundos. No se observaron diferencias en la producción de GFP ni impactos perjudiciales, leves o nulos, sobre la salud de las plantas cuando se aplicaron presiones de vacío de 5, 100 y 200 milibares durante 30 o 60 segundos.

Se evaluó el efecto de la duración del vacío sobre la expresión del gen objetivo infiltrando una bandeja de plantas de Nico Oceana Benham cada hora con una A600 de 0,5 de GV3101 que portaba PBI4GFP durante ocho horas. En la misma cultura de agrobacterium mostrada en este resultado representativo, el nivel de producción de GFP fue similar en todos los puntos temporales hasta las ocho horas, lo que sugiere que durante este período el agrobacterium mantiene su capacidad para transferir ADN de cadena sencilla. Dado que se ha reportado que muchas sustancias químicas y monosacáridos aumentan la producción transitoria de proteínas en diversas especies vegetales.

Este estudio también evaluó el efecto de diferentes concentraciones de aceto, crinona y glucosa sobre la producción transitoria de la proteína GFP en Nicotiana occidentalis Benham, infiltrada con la cepa de Agrobacterium GV3101 que portaba PBI4GFP. Las bacterias agrobacterianas se cultivaron durante la noche en medio YEB, se centrifugaron y se resuspendieron hasta una A600 de 0,5 ya sea en medio MMA que contenía 2 % de glucosa con acetosirone en las concentraciones indicadas, o en medio MMA que contenía acetofenona a 200 micromolares con glucosa en las concentraciones indicadas. Como se muestra aquí, ninguna de las concentraciones ensayadas de estos compuestos indujo un aumento significativo en la producción de proteína GFP en comparación con el control, en el que el medio de inducción no contenía acetofenona ni glucosa.

A continuación, se examinó el efecto de la coinfiltración de un supresor de silenciamiento sobre la expresión transitoria de los genes GFP y HAC en hojas de Nicotiana benthamiana. Las hojas de Nicotiana benthamiana se examinaron previamente a la infiltración; cultivos de Agrobacterium GV3101 que portaban PBI 4G FP y el supresor viral de silenciamiento P19 del virus del enanismo del tomate se mezclaron respectivamente en proporciones de 1:1, 2:1, 3:1 y 4:1. Tal como indican los resultados del análisis por inmunotransferencia (Western blot) a los 7 DPI, la presencia de P19 no aumentó ni disminuyó la producción de GFP en Nicotiana benthamiana en ninguna de las proporciones utilizadas entre las suspensiones de Agrobacterium.

Además, se investigó el efecto de dos supresores virales del silenciamiento génico, P 23 y P 19, sobre la prevención del silenciamiento génico postranscripcional de HAC uno. POS de Agrobacterium que portaban el vector lanzadera PBI cuatro HAC uno, y uno de los dos plásmidos supresores del silenciamiento viral, se mezclaron en una proporción de cuatro a uno, respectivamente, y se coinfiltraron en Nicotiana Benthamiana. Las muestras de hojas infiltradas se recolectaron entre tres y ocho DPI.

Este gráfico muestra los niveles promedio de expresión de HAC uno obtenidos en tres experimentos, determinados mediante análisis de blot de Western. La co-infiltración de Nico Oceana Benham con P 23 o P 19 resultó en un aumento en la producción de HAC uno en comparación con el uso de ningún supresor de silenciamiento a las 60 hpi. Esto sugiere que P 23 y P 19 son eficientes en este sistema.

También se observó que tanto en presencia como en ausencia de un supresor de silenciamiento, el nivel de producción de la proteína HAC1 comenzó a disminuir a los siete DPI. Esto indica que el momento del descenso en la producción transitoria de proteínas en Nicotiana benthamiana infiltradas con el vector lanzadera es específico del blanco. Por último, la estabilidad del banco de células de Agrobacterium se evalúa anualmente infiltrando plantas de Nicotiana benthamiana con el mismo lote del banco de células de Agrobacterium para evaluar la acumulación de proteína.

Estos resultados representativos indican que la producción de la proteína HA uno ha sido muy estable durante más de tres años. La producción promedio de HAC uno en plantas de Nicotiana benam es de 651 más o menos 49,4 miligramos por kilogramo. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar la técnica de agroinfiltración para la producción a gran escala de proteínas recombinantes, que pueden utilizarse para fabricar vacunas de subunidades, anticuerpos contra proteínas terapéuticas y antígenos diagnósticos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar controlar el cruzamiento de plantas hidropónicamente, utilizar bacterias agrobacterianas viables, controlar la presión de vacío y la agitación, y monitorear el vehículo de expresión proteica. Una vez dominada, la técnica de filtración agro puede realizarse en 24 horas si se lleva a cabo adecuadamente bajo condiciones controladas.