Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

Para probar la interacción entre dos proteínas, los dos genes de interés deben clonarse en nuestros vectores BF y utilizando la técnica de clonación Gateway. Estos constructos se transforman en Agrobacterium GV3101. Las culturas bacterianas GV3101 que contienen cada constructo se mezclarán y co-infiltrarán en las hojas.

Si las dos proteínas candidatas interactúan entre sí, la señal de YFP se puede observar mediante microscopía de foco láser. El propósito principal de la técnica BFC es probar la interacción entre dos proteínas. En vavo, hemos creado una serie de vectores de BFC y de híbridos IS compatibles con Gateway, que proporcionan a los investigadores herramientas fáciles de usar para realizar ensayos híbridos duales de BFC e ISTO.

En este video, vamos a demostrar la facilidad de uso de nuestro sistema BFC. Para probar las interacciones entre proteínas, las proteínas en un sistema de expresión trascienden el método. Primero, debe preparar el cultivo bacteriano GV 3 1 0 1.

Debe seleccionar una colonia individual de su placa e inocularla en cinco mililitros de medio YEB con los antibióticos adecuados. Luego, debe agitar estos cultivos durante la noche a 28 grados. La velocidad es de 200 revoluciones por minuto.

Las culturas bacterianas deben estar listas la mañana siguiente. Asegúrese de que las bacterias D hayan sobrepasado el crecimiento. Saque las culturas del incubador y transfiera un macho de cada cultura a un tubo cónico estéril de 1,5 mL.

Coloque los tubos de centrífuga en una centrífuga de escritorio. Centrifugue las bacterias a 1000 G durante 10 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. Luego, observe el precipitado añadiendo un mililitro de medio de infiltración y realice la reevaluación agitando suavemente varias veces.

Repita el paso de lavado otras dos veces. Esto es importante porque ayuda a eliminar los residuos de antibióticos en el medio bacteriano, que podrían hacer que sus plantas se sellen después de la infiltración. Después del lavado final, re suspenda el pellet en 0,5 mL de medio de infiltración y mida la densidad óptica a 600 nm de esta suspensión bacteriana utilizando un espectrofotómetro, con el medio de infiltración como blanco de control.

Después de la medición de la DO, debe ajustar la DO utilizando el medio de infiltración. La DO final debe estar entre 1 y 1,2. Debe preparar todas las suspensiones bacterianas antes de pasar al siguiente paso.

Transfiera cantidades iguales de las suspensiones bacterianas correspondientes a sus dos proteínas candidatas y mézclelas en un nuevo tubo de 1,5 ml. La mezcla de bacterias negativas ya está lista para la infiltración. Prepare todas las combinaciones y no olvide incluir un control negativo. Debe utilizar cinco o seis plantas de código semanal y de mejor porte para la infiltración.

Puede retirar las plantas de la cámara de crecimiento y colocarlas bajo luz nocturna durante una hora antes de la infiltración para abrir los estomas. Esto facilitará el proceso de infiltración. Aspire aproximadamente 100 microlitros de bacterias suspendidas en Resus.

Mezcle cerca de una jeringa macho con punta deslizable sin la aguja. Coloque la punta de la jeringa contra la cara inferior de la hoja. Sostenga la cara superior de la hoja con el dedo.

Presione generalmente el émbolo hacia abajo. Debería poder observar cómo el líquido se difunde a través de la hoja, ya que aún se siente que el mesófilo tiene espacios aéreos más delgados. Después de la infiltración, marque el área infiltrada con un rotulador. De lo contrario, después de dos días, no podrá identificar la zona infiltrada. Si necesita infiltrar con mezclas bacterianas diferentes, asegúrese de rociar su guante con etanol al 50 % o de cambiar sus guantes G entre cada infiltración.

Intente dejar un espacio de un metro entre infiltraciones para evitar la contaminación cruzada. Las señales de PFA deben monitorearse cada 24 horas desde la infiltración hasta cinco días. Puede utilizar dos fundas protectoras de tamaños diferentes para sostener la muestra.

Primero, coloque una gota de agua mini en una manga de cubierta entallada. Luego, corte un pequeño trozo de tejido de cuchilla dentro de la zona infiltrada. Intente evitar la vena nauseosa en la muestra.

Coloque el tejido de cuchilla cortado en el agua sobre el portaobjetos colocado debajo, cúbralo utilizando un capilar más pequeño y presione suavemente. Ahora la muestra puede observarse bajo el microscopio de México. Aquí utilizamos este microscopio confocal NACA T CSS P dos de México para visualizar la señal BIFC.

Incluso se puede utilizar un olfato común de México. La microscopía confocal proporciona imágenes mejores y detecta señales débiles. Puede usar el parámetro YFP para detectar las señales VFC en este sistema NCAs P dos.

Puede hacer doble clic simplemente en este ajuste predeterminado de YFP aquí, lo que activará automáticamente la excitación y establecerá el rango de detección de emisión. Si está utilizando un sistema diferente, consulte el manual para configurar adecuadamente los parámetros. Es nuestro deseo que, tras ver este video, pueda realizar la BFCE para probar interacciones entre proteínas utilizando el sistema de expresión unbe MI Transcend.

También puede aplicar este procedimiento a plantas de tabaco y AY. Nuestros vectores BFC también contienen una etiqueta HA y una etiqueta flag, respectivamente, por lo que también puede realizar una co-inmunoprecipitación para validar las interacciones si es necesario.