Name: Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprende a detectar interacciones proteína-proteína en plantas mediante BiFC con YFP fragmentado y Gateway cloning. Este método permite visualizar en tiempo real las interacciones en células vegetales vivas.

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Damos las gracias a Nguyen Vi por leer el manuscrito y la asistencia de laboratorio en general.

1. Preparación de cultivo de Agrobacterium <ol><li> Cepa de Agrobacterium GV3101 previamente transformada con Gateway compatible BiFC vector pEarleyGate201-YC y pEarleyGate202 YN-, cada uno con una construcción de fusión de Gobierno de la India. </li><li> Inocular un 5 ml YEB (5 g L -1 extracto de carne, 1 g L -1 extracto de levadura, 5 g L -1 de peptona, 5 g L -1 de sacarosa, 2 mM MgSO 4, pH 7,2) la cultura de la proteína de fusión BiFC construye Agrobacterium transformado con el selección del antibiótico adecuado. Cultive hasta el día en 28 ° C con agitación a 200 rpm. </li><li> Retire 1 ml de la cultura en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml. </li><li> Precipitar las células a 1.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante. </li><li> Lavar el sedimento mediante la adición de 1 ml de los medios de infiltración (5 g L-1 D-glucosa, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na 3 PO 4, 0,1 mM acetosiringona) 11. Resuspender pellet con la pipeta, las células de pellets de nuevo a 1.000 g durante 10 minutos. </li><li> Repita el paso de lavado dos veces más. </li><li> Resuspender el precipitado en 0,5 ml de medio de infiltración. </li><li> Medir la absorbancia a 600 nm y ajustar el final de OD 600 a 1,0 a 1,2. </li><li> Alícuota de una cantidad igual de suspensión de Agrobacterium de cada construcción en un tubo de 1.5 ml nuevo, vortex durante 10 segundos. Para una sola infiltración, 100 L de cada construcción es más que suficiente. </li><li> La mezcla de Agrobacterium está listo para la infiltración. </li></ol> 2. Infiltración <ol start="11"><li> Plantas de N. benthamiana se cultivan a 21 ° C, con 16 horas de luz y 8 h oscuridad ciclos. Cinco de las plantas de seis semanas de edad, se debe utilizar para la infiltración. </li><li> Retire las plantas de la sala de crecimiento y de lugar en la luz blanca durante 1 h antes infiltratring que permite que los estomas se abra completamente. </li><li> Elaboración de mezcla Agrobacterium resuspendió en un 1 ml de deslizamiento punta de la jeringa de tuberculina sin aguja. </li><li> Coloque la punta de la jeringa contra la parte inferior de la hoja y suavemente el émbolo, mientras que apoyan directamente la parte superior de la hoja con un dedo. El líquido se difunden a través de la hoja, ya que llena los espacios de aire mesophyllar. </li><li> Etiqueta de la zona infiltrada con un marcador para la identificación futura. </li><li> Cuando la infiltración con diferentes construcciones, asegúrese de que cambie sus guantes o limpiar con etanol al 70% entre las infiltraciones. Si es posible, deje un espacio nervio central entre las diferentes muestras para evitar la contaminación cruzada. </li><li> Colocar las plantas en un armario de crecimiento bajo condiciones normales de crecimiento. </li></ol> 3. Observación de la señal de YFP reconstituido <ol start="18"><li> Al consumo de un segmento 5mm x 5mm de tejido de las hojas dentro de la zona infiltrada </li><li> Montaje de la muestra, en el agua, en un portaobjetos de vidrio, cubrir la muestra con un cubreobjeto y examinar las interacciones con un microscopio confocal o de fluorescencia. </li><li> Expresión deben ser controlados cada 24 horas desde el momento de la infiltración de hasta 5 días después de la sobre-expresión / la trata puede dar lugar a proteínas de fusión fluorescentes mostrando diferentes lugares durante un transcurso de tiempo. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Un ejemplo de interacción proteína-proteína a prueba mediante un ensayo BiFC se muestra en la Figura 1. AtTHP1 AtSAC3A y se cree que son los componentes de la Arabidopsis homólogo de la levadura-2 TREX complejo. Pueden interactuar con un AtNUP1 nuclearporin y facilitar la exportación del ARNm 10. AtTHP1 y AtSAC3A fueron clonados en pEarlyGate201-YC mientras AtNUP1 fue clonado en pEarlyGate202-SN. Las construcciones se transformaron posteriormente en GV3101. Las tres construcciones fueron emparejados con tres combinaciones posibles (AtTHP1 + AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 AtSAC3A +) para la infiltración. La reconstitución de la señal YFP se observó bajo un LCSM 48 horas después de la infiltración. Las señales se han observado en las células epidérmicas y localizadas en la periferia nuclear o plasma nuclear, lo cual es consistente con la localización subcelular de estas proteínas. Los controles negativos no mostraron ninguna señal de YFP. <img src="/files/ftp_upload/3473/3473fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Arabidopsis TREX-2 componentes de exportación de ARNm complejo interactúan unos con otros. N. benthamiana hojas, co-transformadas con construcciones de Gobierno de la India fusionado a pEarleyGate201-YC y pEarleyGate202-SN (como se indica), se obtuvieron imágenes de 48 a 72 h después de la infiltración, utilizando un microscopio Leica TCS SP2 confocol. Las imágenes se muestran como YFP fusión confocal y brillantes imágenes de campo de la epidermis N. benthamiana hoja de células

<ol><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).</li>
<li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiFC+imaging+assay+for+plant+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).</li>
<li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).</li>
<li>Hiatt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45, 185-191 (2008).</li>
<li>Barnard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+implementation+of+split-GFP-based+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nature. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis.</a> Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).</li>
<li>Earley, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).</li>
<li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).</li>
<li>Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+homolog+of+the+yeast+TREX-2+mRNA+export+complex%3A+components+and+anchoring+nucleoporin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+tobacco+plants+and+generation+of+stably+transformed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants.</a> Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).</li>
<li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells%3A+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).</li>
<li>Demidov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+complementation+of+split+fluorescent+protein+triggered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature. 3, 1693-1702 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

BiFC ensayo es una herramienta poderosa para el estudio de las interacciones proteína. A diferencia de la tradicional prueba de Y2H, BiFC no sólo permite la visualización de las interacciones proteína-proteína, sino que también proporciona más información sobre el complejo de proteínas, tales como localización subcelular. Además, es posible detectar interacciones directas e indirectas, siempre y cuando las dos proteínas candidatas pueden acercarse lo suficiente por un tercer socio. Como cualquier tecnología, BiFC tiene ...

<table><tbody><tr><td>Acetosiringona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa tuberculínica de 1 mL con punta cónica</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un gateway compatible complementación fluorescencia bimoleculares (bifc) del sistema

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Hemos desarrollado una técnica BiFC para probar la interacción entre dos proteínas in vivo. Esto se logra mediante la división de una proteína amarilla fluorescente (YFP) en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés. Estas construcciones se pueden co-transformado en Nicotiana benthamiana a través de la transformación mediada por Agrobacterium, permitiendo la expresión de tránsito de las proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación 1-7. Para probar y validar las interacciones proteína-proteína, BiFC se puede utilizar junto con la levadura de dos híbridos (Y2H) ensayo. Esto puede detectar interacciones directas e indirectas que se puede contemplar en el Y2H. La tecnología Gateway es una plataforma universal que permite a los investigadores para llevar a los genes de interés (GOI) como la expresión en muchos sistemas de análisis funcional como sea posible 8,9. Tanto la orientación y el marco de lectura se puede mantener sin el uso de enzimas de restricción o la ligadura de expresión para hacer listas para clones. Como resultado, se pueden eliminar todos los pasos de la secuencia de nuevo para asegurar resultados consistentes a lo largo de los experimentos. Hemos creado una serie de vectores Gateway compatible BiFC y Y2H que proporcionar a los investigadores y fácil de utilizar herramientas para llevar a cabo ensayos tanto BiFC y Y2H 10. Aquí se demuestra la facilidad de uso de nuestro sistema BiFC para probar interacciones proteína-proteína en N. benthamiana plantas.

Hemos desarrollado una técnica para probar interacciones proteína-proteína en las plantas. Una proteína amarilla fluorescente (YFP) se divide en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés a través del sistema de puerta de enlace, lo que permite la expresión de proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación.

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

Hemos desarrollado una técnica de BiFC para evaluar la interacción entre dos proteínas in vivo. Esto se logra dividiendo una proteína fluorescente amarilla...

Para probar la interacción entre dos proteínas, los dos genes de interés deben clonarse en nuestros vectores BF y utilizando la técnica de clonación Gateway. Estos constructos se transforman en Agrobacterium GV3101. Las culturas bacterianas GV3101 que contienen cada constructo se mezclarán y co-infiltrarán en las hojas.Si las dos proteínas candidatas interactúan entre sí, la señal de YFP se puede observar mediante microscopía de foco láser. El propósito principal de la técnica BFC es probar la interacción entre dos proteínas. En vavo, hemos creado una serie de vectores de BFC y de híbridos IS compatibles con Gateway, que proporcionan a los investigadores herramientas fáciles de usar para realizar ensayos híbridos duales de BFC e ISTO.En este video, vamos a demostrar la facilidad de uso de nuestro sistema BFC. Para probar las interacciones entre proteínas, las proteínas en un sistema de expresión trascienden el método. Primero, debe preparar el cultivo bacteriano GV 3 1 0 1.Debe seleccionar una colonia individual de su placa e inocularla en cinco mililitros de medio YEB con los antibióticos adecuados. Luego, debe agitar estos cultivos durante la noche a 28 grados. La velocidad es de

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Este artículo muestra cómo utilizar correctamente el BioRad Helios pistola de genes para introducir ADN plásmido en las células epidérmicas de cebolla y la forma de prueba para las interacciones proteína-proteína en las células de la cebolla basa en el principio de fluorescencia de Complementación bimolecular...

Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios

La localización subcelular de las proteínas es importante para determinar la regulación espacio-temporal de la señalización celular. Aquí se describe la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) como un método sencillo para el control de la interacción espacial de las proteínas en la célula.

Fluorescencia de Complementación bimolecular

Análisis citométrico de flujo de Complementación fluorescencia bimolecular proporciona un método cuantitativo de alto rendimiento para estudiar la interacción proteína-proteína. Esta metodología se puede aplicar a los sitios de unión de proteínas y de mapeo para los factores que regulan la interacción proteína-proteína de cribado.

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Las interacciones proteína-proteína se visualizan en células con resolución espacial nanométrica mediante la combinación de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) con microscopía de localización fotoactivada (PALM). Aquí se describe el uso de BiFC-PALM para obtener imágenes de las interacciones Ras-Raf en células U2OS para visualizar la agrupación y difusión a nanoescala de complejos Ras-Raf individuales.

Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Este manuscrito describe un procedimiento experimental fácil y rápido para la determinación de las interacciones proteína-proteína basadas en la medición de la actividad de luciferasa.

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Hemos desarrollado un novedoso método para expresar conjuntamente múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas a superar las dificultades de los métodos convencionales. Toma ventaja del uso de un plásmido de expresión única que contiene múltiples proteínas funcionalmente independiente expresando cassettes para lograr la expresión de la proteína.

La expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescente de manera eficiente en las plantas

Este protocolo demuestra el uso del ensayo de ligadura de proximidad para sondear las interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans.

Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

Aquí presentamos, un método para visualizar la formación de complejos ternarios entre tres socios de proteínas utilizando proteínas marcadas con fluorescentes mediante el ensayo FRET-FLIM basado en BiFC. Este método es valioso para estudiar los complejos de interacción proteína-proteína in vivo.

Determinación de la interacción tripartita entre dos monómeros de un factor de transcripción MADS-box y una proteína sensora de calcio mediante ensayo BiFC-FRET-FLIM

Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para realizar el experimento de marcaje de proximidad (PL) en pepino (Cucumis sativus L.) utilizando la proteína AT4G18020 (APRR2)-AirID como modelo. El método describe la construcción de un vector, la transformación de un constructo a través de la agroinfiltración, la infiltración de biotina, la extracción de proteínas y la purificación de proteínas marcadas con biotina a través de la técnica de purificación por afinidad.

Etiquetado de proximidad basado en AirID para la interacción proteína-proteína en plantas

La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) es una técnica de imagen para detectar interacciones de proteínas en células vivas. Aquí, se presenta un protocolo FRET para estudiar la asociación de enzimas modificadoras de histonas con factores de transcripción que las reclutan a los promotores objetivo para la regulación epigenética de la expresión génica en tejidos vegetales.

Investigación de las interacciones entre las enzimas modificadoras de histonas y los factores de transcripción in vivo mediante la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia

Aprende a detectar interacciones proteína-proteína en plantas mediante BiFC con YFP fragmentado y Gateway cloning. Este método permite visualizar en tiempo real las interacciones en células vegetales vivas.

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema (Video) | JoVE Journal

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

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