Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

Para probar la interacción entre dos proteínas, los dos genes de interés deben clonarse en nuestro BF y vectores utilizando la técnica de anhelo de puerta de enlace. Estas construcciones se transforman en aerium GV 3 1 0 1. Los cultivos bacterianos GV 3 1 0 1 que contengan para construir se mezclarán y se coinfiltrarán en las hojas.

Si las dos proteínas candidatas interactúan entre sí, la señal de YFP se puede observar utilizando el resultado focal México. El objetivo principal de la técnica BFC es probar la interacción entre dos proteínas. En vavo, hemos creado una serie de vectores híbridos BFC e IS compatibles con pasarelas que proporcionan a los investigadores herramientas fáciles de usar para realizar dos ensayos híbridos BFC e ISTO.

En este video, vamos a demostrar la facilidad de uso de nuestro sistema BFC. Para probar la proteína, las interacciones de las proteínas de manera indiscutible trascienden el sistema de expresión. Primero debe preparar el cultivo bacteriano GV 3 1 0 1.

Debe elegir una sola colonia de su plato e inocular en cinco machos de medio YEB con antibióticos apropiados. Entonces hay que agitar este cultivo durante la noche a 28 grados. La velocidad es de 200 carreras por minuto.

Los cultivos bacterianos deberían estar listos a la mañana siguiente. Asegúrate de que la bacteria D haya crecido demasiado. Saque los cultivos de la incubadora y transfiera un macho de cada cultivo a un tubo de centrífuga estéril de 1,5 machos.

Coloque los tubos de la centrífuga en una centrífuga de escritorio. Gire las bacterias a 1000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, deseche el snet. A continuación, observe el castigo añadiendo una comida de medio de infiltración y la reevaluación mediante caricias unas cuantas veces.

Repita el paso de lavado dos veces más. Esto es importante porque ayuda a eliminar el rastro de antibióticos en el medio bacteriano, que hacen que las plantas se conviertan en focas después de la infiltración. Después del lavado final, resus suspendió la paleta en medio de infiltración macho de 0,5 medidas debido a 600 de estas suspensiones de bacterias utilizando un fotómetro espectrométrico utilizando medio de infiltración como banco de control.

Después de la medición del diámetro exterior, debe ajustar el diámetro exterior utilizando un medio de infiltración. El OD final debe estar entre uno y 1,2. Debes preparar todas las suspensiones bacterianas antes de continuar con el siguiente paso.

Transfiera la misma cantidad de suspensiones bacterianas correspondientes a sus dos proteínas candidatas y mézclelas en un nuevo tubo macho 1.5 La mezcla de bacterias negativas ahora está relacionada con el infiltrado. Prepara todas las combinaciones y no olvides incluir un control negativo. Debe usar el código de cinco a seis semanas y las plantas de la mejor manera para la infiltración.

Puede quitar las plantas de la sala de crecimiento y colocarlas en la noche durante una hora antes de la infiltración para abrir el ataque de tormenta. Esto ayudará con el proceso de infiltración. Extraer unos 100 microlitros de bacterias en suspensión Resus.

Mezcle cerca de una jeringa macho de punta deslizada sin la aguja. Coloque la punta de la jeringa contra el envés de la hoja. Sostenga la parte superior de la rodilla con el dedo.

Por lo general, presione el émbolo. Debería poder ver el líquido difundiéndose a través de la hoja, pero siente que los espacios de aire más delgados después de la infiltración permiten la aerodinámica infiltrada con un rotulador. De lo contrario, después de dos días, no podrá identificar el A infiltrado. Si necesita infiltrarse con una mezcla de bacterias diferente, asegúrese de rociar su guante con etanol al 50% o cambie sus guantes G entre infiltraciones.

Trate de dejar un espacio de un metro entre las costillas para evitar la contaminación cruzada. Las señales de PFA deben monitorearse cada 24 horas desde la infiltración hasta cinco días. Puede utilizar dos fundas de cubierta de diferentes tamaños para sujetar la muestra.

Primero, coloque una gota de mini agua en una funda de cubierta de muesca. A continuación, corte un pequeño trozo de tejido de cuchillo dentro de la zona infiltrada. Trate de evitar las náuseas en la vena de la muestra.

Coloque el pañuelo de la cuchilla cortada en el agua en el tobogán debajo de la mesa, cúbralo con una funda de corriente más pequeña y presione suavemente. Ahora la muestra se puede observar bajo el ámbito de México. Aquí usamos este NACA T CSS P dos confocal México para visualizar la señal BIFC.

Incluso se puede utilizar el aroma regular de México. Confocal proporciona mejores imágenes y detecta señales débiles. Puede utilizar el parámetro YFP para detectar las señales VFC en este sistema NCAs P two.

Simplemente puede hacer doble clic en este ajuste preestablecido de YFP aquí, que encenderá automáticamente la excitación y establecerá el rango de detección de emisiones. Si está utilizando un sistema diferente, consulte el manual para configurar correctamente los parámetros. Esperamos que después de ver este video, pueda realizar el BFCE para probar las interacciones proteína-proteínas utilizando el sistema de expresión unbe MI Transcend.

También puede aplicar este procedimiento a las plantas de tabaco y AY. Nuestros vectores BFC también contienen una etiqueta HA y flag respectivamente, por lo que también puede realizar co IP para validar las interacciones si es necesario.