Variaciones negativas manchan métodos de microscopía electrónica: herramientas para afrontar un reto sistemas

El objetivo general de este video es demostrar varias variaciones diferentes en las técnicas para preparar muestras de microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa. La tinción negativa es la mejor manera de evaluar rápidamente la calidad de una muestra EM. Es importante reconocer que las diferentes técnicas de preparación de la rejilla funcionan mejor para algunas muestras.

La técnica que funciona mejor para una muestra dada debe determinarse por ensayo y error. Para comenzar, prepare las rejillas EM utilizando el método de lámina de carbón y prepare los reactivos de tinción negativos como se describe en el protocolo de texto adjunto. Coloque una rejilla EM recubierta de lámina de carbono hacia arriba en un portaobjetos de microscopio.

Coloque el portaobjetos en una unidad de descarga incandescente y trate la rejilla durante un mínimo de 30 segundos a 10 miliamperios para que la rejilla sea hidrófila. Cuando termine, retire la muestra de la unidad de descarga. Luego, use un par de pinzas de presión negativa para agarrar el borde de la rejilla.

Para teñir con el método de secado lateral, primero aplique de tres a cinco microlitros de la muestra a la superficie de soporte. Deje que la muestra se adsorba en la superficie de la rejilla durante 10 segundos a un minuto, luego toque el borde de la rejilla con una hoja de papel de filtro y permita que la acción capilar retire el líquido. A continuación, coloque 50 gotas de microlitros de agua ultrapura o una solución tampón volátil adecuada en una hoja de película de laboratorio.

Toque suavemente la superficie de carbono de la rejilla con la gota y levante una pequeña gota sobre la superficie de la rejilla. Luego, toque el borde de la rejilla con una hoja de papel de filtro y permita que la acción capilar extraiga el líquido. A continuación, coloque dos gotas de 50 microlitros de reactivo de tinción en una hoja de película de laboratorio.

Toque suavemente la superficie de carbono de la rejilla con la gota y levante una pequeña gota sobre la superficie superior de la rejilla. Si la mancha migra a la parte posterior de la rejilla, entonces la película de carbón se ha roto y debe desecharse. Después de 10 a 15 segundos, toque el borde de la rejilla con una hoja de papel de filtro y permita que la acción capilar extraiga el líquido.

Repita este paso de tinción una vez más y luego deje que la rejilla se seque al aire. Para teñir la muestra con el método de deslizamiento, sujete el borde de la rejilla con un par de pinzas de presión negativa y aplique de tres a cinco microlitros de muestra a la superficie de soporte. Sosteniendo las pinzas con una mano, incline la rejilla de modo que quede aproximadamente a 45 grados hacia afuera y mueva rápidamente la muñeca para quitar la mayor parte de la gota que está en la parte superior de la rejilla.

A continuación, utilice una pipeta Pasteur de vidrio para aplicar una gota de solución de lavado sobre la superficie de apoyo. Retire la gota y repita varias veces para lavar la muestra. A continuación, aplique una gota de reactivo de tinción en la superficie de soporte y vuelva a retirar la gota.

Repita este paso de tinción de una a tres veces, dependiendo de la profundidad de tinción que se requiera para la visualización de la muestra. Elimine el exceso de mancha tocando el borde rasgado de un trozo de papel de filtro con el borde de la rejilla y luego deje que la rejilla se seque al aire. Para teñir la muestra con el método de lavado rápido, primero extraiga de 30 a 70 microlitros de tinte en la punta de una pipeta de 200 microlitros.

Gire el dial de volumen para extraer cinco microlitros de aire, luego extraiga de cinco a 30 microlitros del reactivo de lavado, seguido de otro pequeño espacio de aire, antes de otros cinco microlitros de muestra. Sujete el borde de una rejilla con un par de pinzas de presión negativa e incline la rejilla aproximadamente 45 grados hacia afuera. Con un movimiento rápido, expulse todo el contenido de la punta de la pipeta a través de la cara de la rejilla EM recubierta de carbono.

Elimine el exceso de mancha tocando el borde rasgado de un trozo de papel de filtro con el borde de la rejilla y deje que la rejilla se seque al aire. La opción ideal para una tinción negativa depende en gran medida de la muestra. La tinción más utilizada es el acetato de uranilo, pero también se pueden utilizar tinciones de lantánidos.

En el caso de las muestras profundamente incrustadas, las tinciones a base de lantánidos, el acetato de tulio y el acetato de erbio, produjeron una tinción negativa de calidad equivalente al acetato de uranilo, a juzgar por el contraste y la nitidez aparentes de las partículas teñidas, y el acetato de tulio produjo imágenes más claras y nítidas que el acetato de erbio. El gran tamaño de grano del acetato de tulio se hace evidente a gran aumento, como se muestra aquí cuando una muestra de partículas fibrosas del mosaico de tabaco se tiñó con acetato de tulio al 1%. Usando acetato de tulio, la repetición de 23 angstrom de la partícula fibrosa del mosaico del tabaco es claramente visible a simple vista.

Ninguna de las otras tinciones de lantánidos probadas fue capaz de resolver esta característica. Otra muestra difícil de visualizar es la proteína C derivada del músculo. Esta muestra produce imágenes significativamente diferentes dependiendo del método de tinción.

Cuando se tiñe con un método de transferencia lateral, aparece como una estructura globular colapsada en forma de ala. Cuando las cuadrículas se preparan por el método de balanceo, la proteína C se observa como una serie de dominios que se asemejan a cuentas en una cuerda. Esto representa mejor la estructura real de la proteína C.

Una vez dominado, sólo se tarda un minuto en preparar una muestra teñida negativamente. Es importante recordar que cada muestra responde de manera diferente a cada técnica de tinción. En el caso de las muestras nuevas, el mejor enfoque debe determinarse experimentalmente.

No olvide que los reactivos de tinción de uranilo son tóxicos y ligeramente radiactivos. Asegúrese de que se desechen en un flujo de residuos adecuado.