Optimizado tinción negativa: un protocolo de alto rendimiento para el examen de Estructura Pequeña y asimétrica de proteínas por Microscopía Electrónica

Más de la mitad de las proteínas son proteínas pequeñas (masa molecular <200 kDa) que son difíciles tanto para formación de imágenes de microscopio electrónico y reconstrucciones tridimensionales. Tinción negativa optimizado es un protocolo robusto y de alto rendimiento para obtener imágenes de alto contraste y de pequeñas proteínas o complejos asimétricos en diferentes condiciones fisiológicas relativamente alta resolución (~ 1 nm).

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de proteínas pequeñas y asimétricas utilizando un protocolo optimizado de microscopía electrónica de tinción negativa de alto rendimiento. Esto se logra incubando primero la proteína en una estación de incubación preparada mientras se prepara una estación de trabajo de tinción negativa. El segundo paso del procedimiento es lavar rápidamente la muestra en tres gotas de agua secuencialmente.

El tercer paso es teñir cuidadosamente la muestra en tres gotas de tinte secuencialmente. El paso final es eliminar el exceso de solución mediante un secado de la parte posterior de la rejilla EM y luego secar suavemente bajo gas nitrógeno. En última instancia, los resultados pueden mostrar imágenes de alta resolución de proteínas pequeñas a través de imágenes TEM en una condición de bajo desenfoque.

La principal ventaja de esta técnica sobre la crioelectromicroscópica está establecida. Puede permitir un examen de alto rendimiento e imágenes de alto contraste de estructuras de proteínas pequeñas y asimétricas, al tiempo que reduce los artefactos estructurales de la tinción negativa convencional. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la base estructural de los mecanismos de proteínas pequeñas, como la proteína de transferencia de éster de colesterol.

También se puede aplicar a otras proteínas como IgG, un anticuerpo, lipoproteína de alta densidad y proteasoma, que varían ampliamente en tamaño. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de lavado y tinción son difíciles de aprender debido a la variación en el tiempo, e incluso el secado de la muestra puede causar efectos dramáticos en la proteína teñida terminada. Al prepararse para este protocolo, es necesario hacer una solución de urinario al 1% en forma de ocho con la máxima atención prestada a minimizar su exposición a la luz.

Esto incluye envolver las piezas del filtro de la jeringa N de 0,2 micras en papel de aluminio cuando sea el momento de filtrar primero la solución. Después de filtrar, almacene dos alícuotas de viales envueltos en papel de aluminio de dos mililitros a menos 80 grados centígrados el día del experimento. Descongele una alícuota en un baño de agua a temperatura ambiente una vez que esté completamente descongelado.

Fíltralo de nuevo a través de un filtro de 0,02 micras con las partes envueltas en papel de aluminio. El vial de recolección también debe estar envuelto en papel de aluminio. Transfiera la mancha negativa a una nevera hasta que se use.

Haga una hoja de retención de gotas presionando una longitud de ocho pulgadas de parámetro sobre un soporte de punta de pipeta. Esto hace hendiduras en las carreteras que sirven como pozos de cinco milímetros de diámetro. Después de hacer seis filas de pozos, aplana el hielo en la superficie de una bandeja de espuma de poliestireno, luego coloca la lámina sobre el hielo.

A continuación, agregue 35 microlitros de agua desionizada en los primeros tres pozos de la hoja en el lado izquierdo. A continuación, cargue los tres pocillos correctos en la lámina con 35 microlitros de la solución de tinción negativa preparada. Cubra la bandeja para minimizar la exposición a la luz de la solución.

Esto servirá como una estación de tinción. Ahora prepare una estación de incubación de rejilla EM a partir de una caja de puntas de pipeta vacía con un accesorio en el que se pueden montar pinzas. Llena la caja hasta la mitad con hielo para que la superficie del hielo quede cerca de la punta de las pinzas cuando estén montadas.

El primer resplandor descarga las delgadas rejillas EM de cobre de malla 300 recubiertas de carbono durante unos 10 segundos. A continuación, tome una rejilla con pinzas que se enganchen a la estación de incubación de rejilla EM. Cuelgue las pinzas con la rejilla, de modo que la rejilla tenga una inclinación de 45 grados a media pulgada por encima del hielo.

Ahora diluya la muestra de proteína en DPBS a 50 a 100 microgramos de proteína por mililitro de solución. Aplique inmediatamente unos cuatro microlitros de la dilución a la rejilla EM. Deje que la muestra se incube durante aproximadamente un minuto.

Después de un minuto, frote rápidamente la malla con papel de filtro para eliminar el exceso de solución. Y luego, en la estación de tinción, toque la malla con la primera gota de agua en la película para. Repita rápidamente el proceso de secado del filtro y enriado con la siguiente gota.

Use un total de tres gotas de agua y hágalo lo más rápido posible. El lavado de la rejilla con agua debe realizarse rápidamente para evitar efectos adversos del cambio de tampón en la proteína. Después de frotar el último lavado en tres segundos, comience a flotar la rejilla en la primera gota de solución de tinción negativa.

Déjalo flotar allí durante 10 segundos. Mientras tanto, limpie las pinzas presionando las puntas en el papel de filtro. Unas cuantas veces después de los diez segundos de flotación, seque la solución con papel de filtro y comience otra flotación en la siguiente gota de mancha durante dos segundos.

Limpie las pinzas durante los dos segundos. A continuación, seque la rejilla y colóquela en la tercera gota. Durante un minuto completo, cubra la estación de tinción durante este paso.

La eliminación de la mancha debe hacerse tocando la parte posterior de la rejilla EM durante un tiempo preciso para garantizar que la rejilla se seque de manera uniforme. Si el papel de filtro toca la mancha durante demasiado tiempo, es posible que se elimine demasiada mancha, lo que provocaría una mala imagen. A continuación, proceda a secar la rejilla.

Primero, toque todo el lado que no es de carbono con el papel de filtro hasta que la solución se transfiera. En segundo lugar, aplique un chorro suave de gas nitrógeno. Ahora transfiera la rejilla a un plato forrado con papel de filtro y cubra parcialmente el plato.

Deje que la rejilla se seque en el plato durante 30 minutos a temperatura ambiente. Alternativamente, las muestras que contienen lípidos se pueden hornear a 40 grados centígrados durante una hora. Una vez que esté completamente seca, transfiera la rejilla EM a una caja de almacenamiento de rejilla EM antes de comenzar primero, alinee el TEM.

Verifique la resolución del anillo de descongelación visible más alto con el espectro de potencia de un área de película de carbono de la rejilla teñida negativamente, que debería ser mejor que la resolución objetivo. Luego, para ajustar la alineación, verifique cuidadosamente el espectro de potencia en el área de la película de carbono de la muestra. En una condición correctamente alineada, se pueden visualizar más de 20 anillos T tho, lo que corresponde a una visualización mejor que cinco angstroms.

Los anillos se fabricaron mediante la transferencia de una imagen de carbono amorfo bajo un desenfoque de 1,6 micras y una dosis de 20,4 electrones por cuadrado. Angstrom. Ahora vuelva a enfocar el enfoque a una condición de enfoque cercana a la de Scherzer de aproximadamente 0,1 micrómetros para imágenes de proteínas pequeñas durante el examen de la rejilla EM. Idealmente, las áreas manchadas suelen estar cerca del borde de las áreas turbias teñidas más gruesas con bajo aumento.

La estructura de las muestras de lipoproteínas se observó con OPNS. Algunos ejemplos son el HDL recombinante, el plasma humano, el LDL, el IDL en plasma humano y el VLDL en plasma humano. También se observaron estructuras más pequeñas como 53 kilodalton, CETP.

Esta es una de las proteínas más pequeñas fotografiadas con éxito por eem. La superposición de la estructura cristalina CETP se adapta muy bien a la imagen, muy dinámica. También se observaron proteínas heterogéneas en 160 anticuerpos de inmunoglobulina G de kilodalton.

Tres subdominios eran claramente visibles. Se utilizó un examen más detallado del anticuerpo IgG para hacer una comparación con su estructura cristalina. La estructura cristalina del anticuerpo IgG one coincide con la visión EM de estos anticuerpos de muchas maneras, como en las posiciones de dominio y sus formas.

Otras moléculas observadas incluyen 28 kilodalton, lipoproteína A apo libre de lípidos un crecimiento EL y proteosomas. Esencialmente, el método OPNS avanza significativamente el límite de las imágenes EM para pequeñas estructuras asimétricas, así como los estudios mecanicistas asociados mientras se intenta el procedimiento. Es importante reducir la exposición a la luz al reactivo de tinción tanto como sea posible para lavar rápidamente la muestra y usar un foco cercano al tesoro para obtener imágenes Después de este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la tomografía electrónica, para responder a preguntas adicionales como las estructuras de resolución nanométrica de moléculas individuales y los cambios de confirmación entre ellas. Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural exploraran los imanes de una transferencia de éster de grupo entre las lipoproteínas del plasma humano.