Optimizado tinción negativa: un protocolo de alto rendimiento para el examen de Estructura Pequeña y asimétrica de proteínas por Microscopía Electrónica

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de proteínas pequeñas y asimétricas mediante un protocolo optimizado de alto rendimiento de microscopía electrónica con tinción negativa. Esto se logra primero incubando la proteína en una estación de incubación preparada mientras se prepara una estación de trabajo para tinción negativa. El segundo paso del procedimiento consiste en lavar rápidamente la muestra en tres gotas de agua de forma secuencial.

El tercer paso consiste en teñir cuidadosamente la muestra en tres gotas de tinte de forma secuencial. El paso final es eliminar la solución en exceso mediante absorción desde la parte posterior de la rejilla de ME y luego secarla suavemente con gas nitrógeno. En última instancia, los resultados pueden mostrar imágenes de alta resolución de proteínas pequeñas mediante imágenes de ME bajo una condición de defoco bajo.

La principal ventaja de esta técnica frente a la microscopía electrónica criogénica es que permite el examen de alto rendimiento y la obtención de imágenes con alto contraste de estructuras proteicas pequeñas y asimétricas, al tiempo que reduce los artefactos estructurales derivados de la tinción negativa convencional. Aunque este método puede proporcionar información sobre la base estructural de mecanismos proteicos pequeños, como la proteína transferasa de ésteres de colesterol.

También puede aplicarse a otras proteínas, como la IgG, un anticuerpo, la lipoproteína de alta densidad y el proteasoma, que varían ampliamente en tamaño. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de lavado y tinción son difíciles de aprender debido a las variaciones en el tiempo, e incluso el secado de la muestra puede provocar efectos drásticos en la proteína teñida final. La demostración del procedimiento estará a cargo de Z.A., becario de investigación de mi laboratorio. Al prepararse para este protocolo, es necesario preparar una solución de formamida al 1 % prestando la máxima atención para minimizar su exposición a la luz.

Esto incluye envolver las partes del filtro de 0,2 micrones para jeringa en papel de aluminio cuando es el momento de filtrar la solución por primera vez. Después de filtrar, almacene alícuotas de dos mililitros en viales envueltos en papel de aluminio a menos 80 grados Celsius el día del experimento. Derrita una alícuota en un baño de agua a temperatura ambiente una vez que se haya descongelado completamente.

Vuelva a filtrarlo a través de un filtro de 0,02 micrones con las piezas envueltas en papel de aluminio. El frasco de recolección también debe estar envuelto en papel de aluminio. Transfiera la tinción negativa a una caja de hielo hasta que se utilice.

Prepare una lámina para gotas presionando un trozo de param de ocho pulgadas de longitud sobre un soporte para puntas de pipeta. Esto crea indentaciones en forma de surcos que sirven como pozos de cinco milímetros de diámetro. Después de hacer seis filas de pozos, alise el hielo sobre la superficie de una bandeja de poliestireno y luego coloque la lámina sobre el hielo.

A continuación, agregue 35 microlitros de agua DI en los tres primeros pocillos de la hoja del lado izquierdo. Luego, cargue los tres pocillos de la derecha en la hoja con 35 microlitros de la solución preparada de tinción negativa. Cubra la bandeja para minimizar la exposición de la solución a la luz.

Esto servirá como estación de tinción. Ahora prepare una estación de incubación para rejillas de microscopía electrónica a partir de una caja vacía de puntas de pipeta con un soporte al que se puedan fijar pinzas. Llene la caja hasta la mitad con hielo, de modo que la superficie del hielo quede cerca de la punta de las pinzas cuando estén colocadas.

Primero, realice una descarga eléctrica en las rejillas de cobre EM de malla 300 recubiertas con carbono delgado durante aproximadamente 10 segundos. A continuación, tome una rejilla con pinzas que se enganchen a la estación de incubación de rejillas EM. Cuelgue las pinzas con la rejilla, de modo que la rejilla quede inclinada a 45 grados y a media pulgada por encima del hielo.

Ahora diluya la muestra de proteína en DPBS a 50-100 microgramos de proteína por mililitro de solución. Aplique inmediatamente alrededor de cuatro microlitros de la dilución sobre la rejilla de microscopía electrónica. Deje que la muestra incube durante aproximadamente un minuto.

Después de un minuto, toque rápidamente la malla con papel de filtro para eliminar la solución excesiva. Luego, en la estación de tinción, coloque la malla sobre la primera gota de agua en la película para parafina. Repita rápidamente el proceso de secado del filtro y humedecido con la siguiente gota.

Utilice un total de tres gotas de agua y hágalo lo más rápidamente posible. El lavado de la rejilla con agua debe realizarse rápidamente para evitar el efecto adverso del cambio de tampón sobre la proteína. Tras secar la última lavada en tres segundos, comience a flotar la rejilla sobre la primera gota de la solución de tinción negativa.

Déjelo flotar durante 10 segundos. Mientras tanto, limpie las pinzas presionando las puntas sobre papel de filtro. Varias veces después del flotado de diez segundos, retire la solución con papel de filtro y comience otro flotado en la siguiente gota de tinción durante dos segundos.

Limpie las pinzas durante dos segundos. A continuación, seque la rejilla con papel absorbente y colóquela sobre la tercera gota. Cubra la estación de tinción durante un minuto completo en este paso.

La eliminación del colorante debe realizarse tocando el reverso de la rejilla de microscopía electrónica durante un tiempo preciso para asegurar que la rejilla se seque de manera uniforme. Si el papel filtro toca el colorante durante demasiado tiempo, podría eliminarse demasiado colorante, lo que resultaría en un mal rendimiento de la imagen. A continuación, continúe con el secado de la rejilla.

Primero, toque todo el lado no carbonado con el papel filtro hasta que la solución se transfiera. Segundo, aplique un flujo suave de gas nitrógeno. Ahora transfiera la rejilla a un recipiente forrado con papel filtro y cúbralo parcialmente.

Deje secar la rejilla en el recipiente durante 30 minutos a temperatura ambiente. Alternativamente, las muestras que contienen lípidos pueden incubarse a 40 grados Celsius durante una hora. Una vez completamente secas, transfiera la rejilla de microscopía electrónica (EM) a un estuche de almacenamiento para rejillas de EM antes de comenzar, alinee primero el microscopio electrónico de transmisión (TEM).

Verifique la resolución del anillo de descongelación más alto visible con el espectro de potencia de un área de película de carbono de la rejilla teñida negativamente, que debe ser mejor que la resolución objetivo. Luego, para ajustar la alineación, revise cuidadosamente el espectro de potencia en el área de la película de carbono del espécimen. En condiciones adecuadamente alineadas, se pueden visualizar más de 20 anillos T tho, lo que corresponde a una visualización mejor que cinco angstroms.

Los anillos se fabricaron mediante transferencia de peletería de una imagen de carbono amorfo bajo un desenfoque de 1,6 micrones y una dosis de 20,4 electrones por angstrom cuadrado. Ahora, restablezca el enfoque a una condición cercana al enfoque de Scherzer, aproximadamente 0,1 micrómetros, para la visualización de proteínas pequeñas durante el examen de la rejilla de microscopía electrónica. Idealmente, las áreas teñidas suelen estar cerca del borde de las áreas nubladas más gruesas y teñidas, a baja magnificación.

La estructura de las muestras de lipoproteínas se observó con OPNS. Ejemplos incluyen HDL recombinante, plasma humano, LDL, IDL de plasma humano y VLDL de plasma humano. También se observaron estructuras más pequeñas como CETP de 53 kilodalton.

Esta es una de las proteínas más pequeñas que se han logrado visualizar mediante eem. La superposición de la estructura cristalina de CETP coincide muy bien con la imagen, siendo muy dinámica. También se observaron proteínas heterogéneas en anticuerpos de inmunoglobulina G de 160 kilodalton.

Tres subdominios eran claramente visibles. Un examen más detallado del anticuerpo IgG uno se utilizó para realizar una comparación con su estructura cristalina. La estructura cristalina del anticuerpo IgG uno coincide con la vista de microscopía electrónica de estos anticuerpos en muchos aspectos, como en las posiciones de los dominios y sus formas.

Las demás moléculas observadas incluyen la apolipoproteína A-1 libre de lípidos de 28 kilodalton, EL crecimiento y los proteasomas. Esencialmente, el método OPNS mejora significativamente los límites de la imagenología por ME para estructuras asimétricas pequeñas, así como para estudios mecanicistas asociados durante el intento del procedimiento. Es importante reducir al máximo la exposición a la luz del reactivo de tinción, lavar rápidamente el espécimen y utilizar enfoque cercano al punto de congelación para la imagenología tras seguir este procedimiento.

Otros métodos como la tomografía electrónica pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como las estructuras de resolución a nivel nanométrico de moléculas individuales y los cambios conformacionales entre ellas. Tras este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural exploraran los intercambios de ésteres del grupo entre las lipoproteínas plasmáticas humanas.