Name: Optimizado tinción negativa: un protocolo de alto rendimiento para el examen de Estructura Pequeña y asimétrica de proteínas por Microscopía Electrónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprende un protocolo optimizado de tinción negativa para examinar proteínas pequeñas y asimétricas mediante microscopía electrónica de transmisión. Este método de alto rendimiento permite obtener imágenes de alta resolución con contraste elevado.

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Agradecemos al Dr. Mickey Yang para la edición y los comentarios, y los Dres. Lei Zhang y Bo Peng para obtener ayuda. Este trabajo fue apoyado por la Oficina de Ciencia, Oficina de Ciencias Básicas y Energía del Departamento de Energía de Estados Unidos (contrato no. DE-AC02-05CH11231), el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud (sin . R01HL115153), y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (no. R01GM104427).

1 Preparación de la solución de tinción negativa fresca al 1% (w / v) <ol><li> Ponga 1 mg de uranilo formiato de (UF) en polvo en la botella de vidrio que contiene 100 ml de agua desionizada en un cuarto oscuro o caja. </li><li> Agitar la solución O / N a temperatura ambiente en una habitación / caja oscura. Envuelva la botella de solución con papel de aluminio para evitar que la luz dé la solución. </li><li> Filtrar la solución suavemente a través de 0,2 micras (tamaño de poro) de filtro montado en una jeringa de 5 ml. La solución filtrada se recogió en tubos Falcon de varias cubiertas de papel de aluminio. La jeringa filtro también debe ser envuelto con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. </li><li> Filtrar la solución a través de nuevo 0,02 m (tamaño de poro) de filtro montado en 1 ml jeringa. La solución filtrada se recogió y alícuota en viales de 2 ml. Las jeringas y viales están cubiertos con papel de aluminio antes de su uso. </li><li> Congele los viales alícuotas utilizando fórceps mango largo sumergiendo los viales en un contenedor lleno de nitrógeno líquido inmediatamentedespués la solución se filtró. </li><li> Transfiera los viales congelados en un congelador -80 ° C para el almacenamiento y el uso futuro. </li></ol> 2 Preparación de la estación de trabajo negativo de tinción e Incubación de estación de trabajo <ol><li> Descongelar un vial de solución de UF 1% en un baño de agua a temperatura ambiente. Asegúrese de que el papel de aluminio permanece envuelta alrededor del vial para evitar la exposición a la luz. </li><li> Filtrar la solución después de que esté completamente descongelado mediante el uso de una lámina de aluminio envuelto 1 ml de la jeringa montada con un filtro de 0,02 micras. Recoja la solución filtrada en un nuevo papel de aluminio envuelto vial, y la colocó en el hielo dentro de una caja de hielo tapa cubierta a la espera de su uso. </li><li> Hacer placas solución por el dedo empujando una hoja larga Parafilm ~ 8 pulgadas sobre la superficie de una placa de cristalización de proteínas vacío. Se generará filas de placas circulares con un diámetro de ~ 5 mm. Hacer 6 placas en cada lugar fila las placas Parafilm sobre una superficie de hielo aplastado dentro de un hielo contienener tapa, como una estación de trabajo de tinción. </li><li> Pipeta ~ 35 l de agua desionizada en cada uno de izquierda tres placas de cada fila, y pipeta ~ 35 l filtran solución UF a tres placas correctas en cada fila. Cubra la estación de trabajo de tinción con una tapa para evitar la exposición a la luz antes de la tinción de proteínas. </li><li> Preparar una estación de incubación rejilla EM llenando una caja vacía hasta la mitad con hielo, y se adhiere al lado de una percha que se puede montar en una base de soporte. Colocar las pinzas de la muestra en la percha, en el que los consejos pinzas &#39;están cerca de la superficie del hielo. Cubrir la mitad de las pinzas &quot;consejos de la altura del labio caja. Una caja de hielo ideal para hacer una estación de incubación está utilizando un recipiente vacío de puntas de pipeta. </li></ol> 3. opns Operación <ol><li> Glow-descargue la película fina de carbono recubierto de malla de 300 redes de EM de cobre durante 10 s. </li><li> Hacerse con una rejilla con pinzas y enganche la pinza en la percha al mantener la red a una inclinación de 45 ° y 1 pulgada sobre el hielosuperficie interior de la estación de incubación. </li><li> Diluir la muestra de proteína con fosfato de Dulbecco Buffered Saline (DBP) a una concentración final de proteína de ~ 0,01 a ~ 0,005 mg / ml. Depósito ~ 4 l diluyó la muestra inmediatamente después de la dilución en el lado de carbono de la red de EM. (DPBS se pueden cambiar a otro búfer si la proteína es sensible a DPBS) </li><li> Incubar la muestra en las redes de EM para ~ 1 min dentro de la estación de incubación. </li><li> Retire el exceso de solución a través de tocar rápidamente el borde de la rejilla con papel de filtro. </li><li> Toque la rejilla rápidamente a la primera gota (~ 35 l) de la superficie de agua pura encima de la lámina de Parafilm justo después de la solución en exceso se eliminó en la red EM. Y a continuación, retire el exceso de agua con prontitud con papel de filtro. </li><li> Repita el paso 3.6 para otras dos veces por lavado de la rejilla de EM en los dos gotas de agua restantes en el Parafilm (Paso 3.6 y 3.7 se pueden omitir si la muestra es muy sensible al agua). </li><li> Flotador del gri EMd inmediatamente en la superficie de la primera gota de solución de UF justo después el exceso de agua en la rejilla EM fue eliminado. Y luego incubar durante 10 seg. Asegúrese de terminar los procedimientos de lavado con agua a menos de 3 segundos antes de la flotación de la cuadrícula en la superficie de la solución de UF. Cuanto más corto sea el tiempo de lavado, mejor será la calidad. </li><li> Limpie las pinzas penetrando las puntas en un papel de filtro de ~ 2 - 3 veces. </li><li> Retire el exceso de solución de la parrilla a través de contacto con el borde de la rejilla con el papel de filtro, y luego flotar la cuadrícula en la segunda gota de UF. </li><li> Continuar por encima de paso 3.10 en la segunda gota. </li><li> Flotar la cuadrícula de la tercera gota de solución de UF y para abarcar la estación de tinción para ~ 1 min. </li><li> Paso opcional: lavar la rejilla rápidamente en una parte superior de agua como se describe en 3.6. Este paso adicional beneficiará a las muestras que contienen más de partículas de oro gratis cargados o fondo mancha. </li><li> Retire el exceso de solución al tocar el papel de filtro a the toda la parte trasera de rejilla (opuesto al lado de carbono). Secar la rejilla bajo una corriente suave de nitrógeno gaseoso a temperatura ambiente justo después de la observación de la solución absorbente al papel de filtro. </li><li> Coloque la rejilla sobre una hoja de papel de filtro dentro de una caja de Petri, y cubrir el plato parcialmente con una tapa que se seque por lo menos durante 30 min bajo RT. Para algunas muestras, colocar la rejilla en un 40 ° C incubadora hornear por una hora. </li><li> Guarde la rejilla en una celda de la malla EM para el futuro examen de EM. </li></ol> 4. EM Examinar <ol><li> Alinear el TEM correctamente antes de EM examen de las pequeñas proteínas de la parrilla. <ol><li> Compruebe la resolución de la más alta visible Thon-anillo que es el espectro de potencia de una película de carbono amorfo para determinar si el TEM se ha alineado correctamente. Desde el TEM es compartido por muchos usuarios diferentes, el TEM no era a menudo alineada correctamente. </li><li> Revise cuidadosamente el espectro de potencia en el área de la película de carbono de la muestra para ajustar la alineación condition de la máquina. Los más altos visibles Thon tóricas son mejores que la resolución específica. NOTA: Como un ejemplo de una alineación apropiada de un filamento de TEM LaB6 operado bajo 120 kV de alta tensión, más de 20 Thon-anillos pueden ser visualizados, en el que, la correspondiente resolución puede ser mejor que 5,0 Å. Este Thon-anillo se logró mediante la transferencia de Fourier de una película de carbono amorfo fotografiado bajo un desenfoque de ~ 1,6 micras y una dosis de 20,4 electrónico / A2 (Figura 5). NOTA: La observación de la alta resolución Thon-ring es una condición necesaria, pero no es una condición suficiente para la correcta alineación. Para lograr realmente las imágenes de alta resolución, muchos otros parámetros también son importantes, tales como la calidad de la muestra, daño por radiación, la carga y la deriva, así como la tasa de dosis iluminación. </li></ol></li><li> Llevar el desenfoque de nuevo a casi Scherzer enfoque para obtener imágenes de las pequeñas proteínas en una zona ideal de colores. </li><li> Búsqueda de área &quot;nublado&quot; a image. Un área idealmente manchado normalmente se encuentra cerca del borde de un área de la mancha más gruesa, que se parece a una zona &quot;nublado&quot; en la red puesto que el espesor de la mancha es normalmente no se distribuye de manera uniforme sobre la rejilla recubierta de carbono (Figura 6). Normalmente, un bajo aumento (&lt;100x) era ayudar a encontrar estas áreas nubladas primero antes de hacer zoom para imágenes. </li></ol>

No tenemos nada que revelar.

En comparación con las técnicas convencionales NS, opns pueden evitar artefactos rouleaux (Figura 1 y 9), que proporcionan alta resolución fiable y razonable (~ 1 nm) detalles estructurales de las proteínas pequeñas (Figura 2). En comparación con la crio-EM, opns proporciona un método de alto rendimiento y se puede examinar una amplia variedad de proteínas y las interacciones proteína-proteína 6. Sin embargo, NPA todavía tiene sus desventajas. En comparación con los convencionales NS, opns implica: i) los más complicados pasos en la preparación de muestras; ii) el uso de una sustancia radiactiva, UF; iii) mantener la mancha fresca debido a la potencia más corta de la mancha UF debido a su sensibilidad a la luz; iv) para evitar la precipitación de la solución UF debe ser almacenado en -80 ° C y requiere descongelación antes de su uso; v) y finalmente todo UF debe ser manejado como residuo peligroso. En comparación con la crio-ME, opns ofrece imágenes de resolución relativamente más bajos y ninguna garantía para cualquier artefacto aún no descubiertoen el futuro. Operación NS efectos procesales sobre la formación de rollos lipoproteína NS protocolos para la preparación de proteínas para su examen 16,29-36,55 se pueden clasificar en tres grandes grupos de métodos de mezcla 50: 55, gota a gota 16, y los procedimientos de lavado 29. i) El protocolo de mezcla requiere la mezcla preliminar de la muestra mancha y proteína en una proporción específica, y luego aplicando la solución mezclada en una placa de carbono recubierta por una rejilla, finalmente eliminar el exceso de solución con papel de filtro antes del secado de aire para el examen EM 55. ii) El protocolo gota a gota implica la aplicación (~ 4 l) gota de la muestra directamente a una rejilla EM recubierta de carbono para sentarse dejando ~ 1 min, posteriormente eliminar el exceso de solución de la muestra antes de la aplicación de una gota (~ 4 l) de la mancha solución en el mismo lado de la rejilla. Después de ~ 1 min de incubación, retire los exces mancha a través del contacto con papel de filtro limpio, finalmente someter a secado al aire 16,56-58. iii) El protocolo de lavado (Figura 7) que requieren aplicación de la solución de muestra a una rejilla EM recubierta de carbono durante 1 min, a continuación, lavar con agua desionizada tres veces justo después de retirar el exceso de solución cada vez por papel de filtro 3,29,30. Opns protocolo fue modificado a partir de este procedimiento de lavado. Tipos de manchas NS y los efectos sobre la formación de rollos lipoproteína En NS, más fuerte dispersión de electrones debido a las manchas de metales pesados ​​proporcionar contraste de las proteínas 17-20,59. Muestras NS pueden sufrir, además, mayores dosis de radiación, y mejorar las características de la proteína por un contraste más agudo negativo 8,9,60. Manchas de metales pesados ​​se pueden clasificar como: aniónicos, incluyendo ácido fosfotúngstico (PTA) 16, tungstato de metilamina 14 y tungstato de silicio 61; y cationesic, tales como acetato de uranilo (UA) 62, UF 3,29,30, y nitrato de uranilo (UN) 63. Una de las manchas NS aniónicos que se usa más comúnmente es PTA 33,64-67. PTA es un heteropoliácido, que se utiliza típicamente alrededor de un pH 7,0 a 7,5. La PTA también se puede utilizar para la tinción positiva 3,16,68. Las cargas negativas de PTA pueden mediar interacciones electrostáticas con los lípidos insaturados cargados positivamente grupos de cabeza, como POPC, en ambas superficies de lipoproteínas y liposomas. PTA puede causar la formación de rollos a través de esta interacción, incluso bajo 29,30 29,30 salinidad tampón regular (Figura 1). Manchas de uranilo, como UA, UF y la ONU son opciones alternativas para metales catiónicos manchas y UA pesados, en particular, se utilizan con frecuencia para NS de una variedad de muestras biológicas 62,69,70. Experimentos encontraron UF no causa rouleaux de las lipoproteínas que contienen lípidos de ácido grasa insaturados, tales como POPC. Sin embargo, todavía puede inducir UF rouleaux en la formación de lipoproteína que contienen lípidos de ácidos grasos saturados, tales como la fosfatidilcolina dimiristoil (DMPC) y 1-hexadecanoil-2-octadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PSPC). El mecanismo detallado de esta interacción es desconocido. UA / UF / ONU puede todo el trabajo a valores de pH más bajos fluctúa entre 3,5 y 4.6. Tales valores de pH más bajo puede no adecuado para ciertas macromoléculas biológicas que son sensibles a pH 14,71. Curiosamente, UA / UF puede fijar la estructura de proteínas dentro de unos pocos milisegundos a través de un mecanismo desconocido 72. A diferencia de PTA, UA / UF es más similar a una sal de un ácido. UF informes, puede proporcionar mejores resultados que UA 73, en el que, UF y de la ONU manchas tienen tamaños más pequeños granos que UA (UF: 0,3 nm, de la ONU: ~ 0.5 nm) 3,74. Un ejemplo interesante, de estructura como detalles secundarios de una proteína pequeña (53 kDa CETP) se puede visualizar directamente desde las micrografías primas cuando se utilizó como reactivo de UF de tinción negativa por la siguienteanteriormente reportado crio--tinción positiva (crio-PS) método (Figura 8) 6. En la crio-PS, la muestra teñida se congelaron rápidamente siguiendo la crio-EM procedimiento de preparación de la muestra en lugar del procedimiento de secado en el protocolo NPA, que puede causar el colapso de la estructura secundaria. La crio-PS es un método de alto contraste e imágenes de alta resolución de las proteínas pequeñas 75. Dado que las imágenes de crio-PS han invertido contraste en comparación con los del protocolo de la crio-NS reportado 22, pero tienen un contraste de imagen consistente a los de las imágenes de crio-EM convencionales, por lo que se llamó el método crio-PS. Las imágenes de crio-PS muestran que el reactivo de tinción, uranilo formato, penetra en la superficie molecular, desafiando la visión convencional de que la tinción puede visualizar sólo la estructura de la superficie exterior. El mecanismo de cómo formiato de uranilo penetra en la superficie molecular es desconocida. Una posibilidad es que el catión uranilo se une grupos carboxilo de proteína disponibles, y por lo tanto lacircundante hielo vítreo es de menor densidad que la tinción de la proteína y los grupos de uranilo, actuando así como una mancha positiva. El método de la crio-PS es similar al método de reemplazamiento isomórfico múltiple (MIR), que era un enfoque común para resolver el problema de la fase en la cristalografía de rayos X 76-78. En MIR, muestras de cristal se empapan con una solución átomo pesado, incluyendo uranio, para obtener un formulario isomorfo a su forma nativa. La adición del átomo pesado a veces no afecta a la formación de cristal o dimensiones de la celda unidad, pero proporciona información adicional de determinación de la estructura cristalina 76-78. Si aprovecha el pequeño grano de UF, la crio-PS podría proporcionar una imagen de alta resolución de alto contraste y de una sola proteína, que es importante para los estudios de estructura de proteínas, sobre todo si se considera que casi todas las proteínas son, naturalmente, dinámica y heterogénea en solución. Para la validación de este método crio-PS, abrimos para cualquier prueba a ciegas desde el campo EM. </p&gt; Efectos de la concentración de sal en la formación de rollos en las lipoproteínas El uso de reactivos de tinción negativa PTA tradicional, la formación de rollos observado es más probable en relación con las interacciones de lípidos en lugar de interacción de proteínas. Imágenes de las muestras de vesículas de liposomas POPC preparados bajo considerable salinidad (NaCl 0,5 M), salinidad moderada (NaCl 0,25 M), relativamente débil salinidad (NaCl 0,1 M), y agua pura (Figura 9), las micrografías electrónicas muestran la formación de rollos era correlacionada con la concentración de sal (Figura 9A - D). Usando UF reactivo de tinción negativa, no rouleaux se observó en POPC muestra vesículas de liposomas 30 (Figura 2 l), lo que sugiere el procedimiento de lavado para reducir rápidamente la concentración de sal justo antes es necesario una tinción, pero no paso de forma independiente suficiente para prevenir rouleaux en POPC relacionada muestras. pequeña proteína de imágenes TEM requiere una condición de enfoque cerca-Scherzer. Imágenes TEM exitosa de proteínas pequeñas a mayor resolución requiere dos condiciones críticas, una alineación adecuada del haz y una condición adquisición enfoque casi Scherzer. i) Una alineación adecuada del haz puede ser juzgado a través del número de timbres Thon visible (espectro de energía) a la transferencia de Fourier de una imagen de la película de carbono adquiridos en virtud de un relativamente alto desenfoque. Cuanto mejor sea la condición de alineación de la viga, los más anillos Thon puede ser visualizado y medible .. ii) La adquisición de imagen con un cerca-Scherzer enfoque es otra condición crítica. Una estrategia tradicional estándar para obtener imágenes de especímenes biológicos utiliza típicamente alta desenfoque (1 - 2 micras y aún más), que puede mejorar la muestra biológica imagen de contraste 79. Esta estrategia es significativo diferente de la estrategia típica para obtener imágenes de la estructura atómica resolución de materiales duros, que a menudoutiliza un enfoque cerca Scherzer (~ 50 nm de desenfoque). Aunque, un desenfoque mayor podría fortalecer contraste muestra biológica, señales de alta resolución serían parcialmente eliminados. Como resultado, la complicidad de señal de alta resolución sería inferior en una condición de formación de imágenes desenfoque superior. La razón es que, la imagen TEM es la convolución de la estructura de la muestra y la CTF instrumento. El CTF es una curva oscilante frente a la frecuencia, en el que la curva de frecuencia osciló cruzar amplitud cero a alta frecuencia. Cada vez que CTF través de cero, la señal estructural de la muestra a esta frecuencia específica será eliminado (cero veces cualquier número será cero). La señal eliminado en esta frecuencia nunca puede ser recuperado por cualquier algoritmo de corrección de CTF (un cero dividido por un cero puede ser cualquier número aleatorio en lugar de la señal estructural original). Bajo desenfoque de imagen superior, el CTF oscilará mucho más agresiva, así la CTF cruza amplitud cero con más frecuencia, como resultado,las señales estructurales a un mayor número de frecuencias específicas serán eliminados. Los más señales de que se eliminan, menos la complicidad de la imagen tendrán. En particular, la complicidad de la imagen no se puede recuperar o corregido por cualquier corrección CTF. Sin embargo, un número de imágenes incompletas adquiridos bajo diferentes desenfoca se puede utilizar para llenar sus huecos entre sí para obtener una señal estructural completa de la estructura de la muestra a través de un método de promedio, en el que incluso una resolución atómica puede lograrse 9-12. El método de promedio es un enfoque poderoso para lograr la estructura de algunas proteínas altamente simétricas y proteínas relacionadas estructuralmente rígidas. Sin embargo, todavía sigue siendo un reto en el estudio estructural de las proteínas pequeñas y asimétricas, especialmente para la dinámica de las proteínas estructurales y flexibles, tales como anticuerpos y HDLs. Promedio se basa en la suposición de que las partículas de proteína son idénticos en estructura y conformación pero diferente en orientaciones, sin embargo, muchas proteínas se sabe que someterse fluctuación termodinámico en solución. Al aplicar el método de promedio sin conocer previamente las proteínas fluctuaciones termodinámicas de fluctuación, la estructura promedio puede causar a menudo dominios 10,80 o variación local en la resolución 81 en las reconstrucciones crio-EM falta. El éxito en el logro de la reconstrucción 3D de la pequeña proteína, tal como 53 kDa de la CETP, y la estructura 3D de una sola proteína, tales como 160 kDa anticuerpo IgG1, beneficios del uso de la condición de formación de imágenes de enfoque cerca-Scherzer bajo una condición de alineación adecuada. Aunque el contraste de la imagen parece baja en los cerca de Scherzer-imágenes de enfoque, el contraste se puede mejorar fácilmente mediante la simple aplicación de un filtrado de paso bajo para reducir el ruido de alta frecuencia en el fondo. Creemos que, a corto Scherzer enfocar imágenes transmiten las señales estructurales máximos, y puede aumentar la exactitud de la alineación de partículas y mejorar la efieficiencia en la reconstrucción 3D de una sola partícula y partícula individual tomografía electrónica reconstrucción.

La comprensión de la función de proteínas requiere el conocimiento de la estructura de proteínas. Determinación estructural es un reto para las proteínas cuya masa molecular se encuentran dentro de 40 a 200 kDa. Cristalografía de rayos X está limitada por la cristalización de proteínas; resonancia magnética nuclear (RMN) se limita a las masas moleculares menores de 40 kDa, mientras que crio-microscopía electrónica (crio-ME) tiene dificultades tanto en la adquisición de imágenes y tridimensionales (3D) de las reconstrucciones de las proteínas pequeñas, que las masas moleculares son menos de 200 kDa. En particular, más de 50% de proteínas tienen una masa molecular dentro de la gama de 40 a 200 kDa 1,2, como los métodos actuales son difíciles en el estudio de proteínas de este tamaño, se necesita un nuevo método. Aunque la mayoría de microscopios electrónicos de transmisión (TEM) son capaces de resolución atómica, es decir, mejor que 3 Å de resolución, incluso lograr una estructura de resolución nanométrica cerca de unas muestras biológicas es más bien challenging 7. El daño por radiación, bajo contraste, desviaciones estructurales, así como los artefactos tales como deshidratación todos obstaculizan alta resolución TEM imágenes 3,8. Entre los diversos enfoques de TEM, crio-EM es un método avanzado y borde de corte para lograr estructuras de resolución atómica de grandes macromoléculas altamente simétricas en condiciones fisiológicas cerca de 9-12. La muestra crio-EM se prepara flash de congelación de la solución de muestra, la incorporación de las macromoléculas en hielo vítreo, que es imaginada posteriormente a temperaturas criogénicas, tales como nitrógeno o helio temperaturas del líquido 13. Cryo-EM es la ventaja de que las muestras no presentan artefactos y son casi nativa en la estructura 8-12. Cryo-EM tiene sus desventajas: i) se requieren dispositivos adicionales para ser instalado o adquirido para actualizar un instrumento TEM estándar para una capacidad de crio-EM. Los dispositivos incluyen: anti-contaminador, crio-titular, software de modo de baja dosis y dosis bajas de sensitiva cámara CCD, aunque los precios de estos dispositivos son mucho más bajos que el precio del propio instrumento TEM; ii) el funcionamiento de la crio-EM necesita más tiempo que el servicio de NS. Examinar una muestra de la crio-EM a menudo requiere más tiempo para preparar muestras y operar el instrumento TEM que la de NS porque crio-EM requiere afrontar dificultades adicionales, incluyendo: operación líquido la temperatura del nitrógeno, la carga de la muestra, la deriva de imágenes, gradientes de temperatura, de baja dosis operación del modelo, muestra la sensibilidad de radiación y las limitaciones de dosis. Estos pasos adicionales se ralentizará la velocidad de adquisición de datos útiles en comparación con la adquisición de datos de NS, aunque algunas imágenes de crio-EM ciertamente se pueden obtener en 1 hora o menos por los expertos de la crio-EM con el instrumento preparado con un gradiente de temperatura equilibrada; iii) los usuarios requieren una formación adicional, como el manejo de nitrógeno líquido, la congelación rejillas crio-EM, operación de baja dosis, la medición de la dosis, el manejo de la carga, a la deriva y el conocimiento en proc imágenesesser; iv) la falta de formación de imágenes repetible para las mismas crio-espécimen durante las diferentes sesiones de TEM. Especímenes Cryo-EM se dañan fácilmente con la contaminación de hielo durante la carga y descarga para la muestra / del instrumento TEM. Este daño es especialmente una preocupación cuando las muestras son difíciles de ser aislado / purificado 14; v) las proteínas pequeñas (&lt;200 kDa de masa molecular) son difíciles de obtener imágenes debido a la baja de contraste; vi) el bajo contraste y alto nivel de ruido de las imágenes de crio-EM reduce el valor de correlación cruzada entre las imágenes, por lo tanto, la disminución de la precisión global en la determinación de las orientaciones de proteínas, conformaciones y clasificaciones, especialmente para proteínas que son estructuralmente flexible y fluctúan de forma natural en solución 4,5. Tinción negativa (NS) es un relativamente &quot;antiguo&quot; e histórica método que cualquier laboratorio, con cualquier tipo de EM, se puede utilizar para examinar la estructura de proteínas. Brenner y Horne desarrollaron por primera vez el concepto of tinción negativa hace medio siglo para el examen de los virus 15. NS se logra mediante el revestimiento de la muestra con sales de metales pesados ​​cargados. Este concepto originalmente viene de microscopía de luz y la práctica de la incorporación de bacterias en una solución de tinción que proporciona la oscuridad alrededor de las muestras, lo que permite un mayor contraste de la imagen cuando ve la imagen negativa 16. Puesto que los iones de metales pesados ​​tienen una mayor capacidad para dispersar electrones en comparación con átomos de menos densas en las proteínas de 17-20, y de la mancha de recubrimiento de metales pesados ​​permite una limitación de dosis más alta con un contraste mejorado. Espécimen NS pueden proporcionar imágenes de alto contraste para facilitar la determinación 8 orientación de las partículas y la reconstrucción 3D de imágenes de crio-EM. NS tradicionales, por desgracia, se pueden producir artefactos inducidos por las interacciones proteína-la mancha, como adición general, la disociación molecular, aplanado y apilado 8,21,22. Para lípidos relacionados proteins, tales como lipoproteínas 16,23-30, un artefacto común resultados en partículas que se apilan y se embalan juntos en una rouleaux (Figura 1) 31-36. Muchos estudios de lipoproteínas, tales como electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente de poliacrilamida, crio-EM estudia 13,29,37-40, espectrometría de masas 39,41, y pequeñas datos de difracción de rayos X de ángulo 42 todas las partículas de lipoproteínas espectáculo son partículas aisladas en lugar de apilado naturalmente juntos formando un rouleaux 21,29,30,35,42-45. La observación de la formación de rollos por NS convencional es posiblemente causado por interacciones dinámicas entre lipoproteínas compuestas de apolipoproteínas (apo) y fosfolípidos que son estructuralmente flexibles en solución 13,29,30,46-49 y la sensibilidad con el protocolo estándar NS. Para identificar este artefacto, la apolipoproteína E4 (apoE4) palmitoil-oleoylphosphatidylcholine (POPC) lipoproteína de alta densidad (HDL) de la muestra se utilizó como muestra de ensayo y crioEM imágenes para una libre artefacto norma 29, la selección de las muestras NS preparados bajo una serie de condiciones. Mediante la comparación de los tamaños de partícula y las formas obtenidas a partir de NS y crio-EM, el tipo específico de reactivo de tinción y la concentración de sal se encontró que dos parámetros clave que causan los fenómenos rouleaux bien conocidos. De este modo, se informó de un protocolo de tinción negativa optimizado (NPA). Por NPA, el fenómeno bien conocido de rouleaux apoE4 HDL fue eliminado por NPA (Figura 2A). El análisis estadístico demostró opns rendimientos imágenes muy similares (menos de 5% de desviación) en tamaño y forma en comparación con los de la crio-EM, sin embargo, el contraste fue eliminado. Las validaciones de NPA se realizaron mediante el examen de la eliminación del artefacto rouleaux de casi todas las clases o subclases de lipoproteínas de muestras 6,29,30,50,51, incluyendo apoA-I 7,8 nm (Figura 2B), 8,4 nm (Figura 2C) , 9,6 nm discoidal reconstituido HDL (rHDL) (Figura 2D), 9,3 nm esférica rHDL (Figura 2E), HDL de plasma humano (Figura 2F), lípido libre apoA-I (Figura 2G), HDL plasmática (Figura 2H), lipoproteínas de baja densidad (LDL ) (Figura 2I), lipoproteínas de densidad intermedia (IDL) (Figura 2J), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) (Figura 2K), y POPC liposoma (Figura 2L) 30. Validaciones adicionales fueron realizadas por la formación de imágenes pequeñas proteínas y asimétricas, incluyendo la proteína de 53 kDa de transferencia de ésteres de colesterol (CETP) (Figura 3A - C) 6,29, y altamente flexible 160 de anticuerpos IgG kDa (Figura 4A y B) 4,5,29 , 52, y dos proteínas estructuralmente bien conocidos, GroEL y proteasoma (Figura 2 M y N). Para requerir ninguna validación adicional de colleagues, estamos abiertos a cualquier prueba a ciegas en este método de NPA. NPA como un protocolo de alto rendimiento también se ha utilizado para estudiar mecanismo de proteína a través de examen de cientos de muestras de proteínas pequeñas, tales como la CETP que fue la unión a diversas proteínas bajo una serie de condiciones (incluyendo la CETP interactuar a 4 clases de lipoproteínas, recombinado HDL, plasma HDL, LDL y VLDL, con / sin 2 anticuerpos, H300 y N13, bajo los tiempos de incubación, 9 de los cuales 3 min, 20 min, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 24 horas, 48 ​​horas y 72 horas, menores de 4 relaciones molares, es decir, 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, y 3 diluciones, es decir, / ml, 0,01 mg / ml y 0,001 / ml, además de las muestras de control adicionales mg 0,1 mg, incluyendo CETP solo, LDL solo, y VLDL solo, con pruebas triples de experimentos anteriores por diferentes personas) 6,29. Opns imágenes de CETP proporcionado imágenes de alto contraste con bastante finos detalles estructurales; lo que nos permite reconstruir con éxito un mapa de densidad de 3D de los 53 kDa small proteína CETP (Figura 3D - F) por la reconstrucción de una sola partícula. Por otra parte, las imágenes de alto contraste opns nos proporcionan una señal suficiente de una proteína individual (Figura 4 A - C), lo que nos permitió lograr la resolución intermedia (~ 1,5 nm) de un único (un objeto, sin promedio) estructura IgG anticuerpo 3D a través del método (Figura 4 E - J) tomografía electrónica-partícula individual (IPET) 5. La descripción detallada de la estrategia IPET reconstrucción, la metodología, los procesos paso a paso y el análisis de la variación estructural previamente se notificaron 4. Una película sobre los procedimientos de reconstrucción de anticuerpos IPET, incluyendo las imágenes en bruto y los resultados intermedios, mapa de densidad de 3D ​​y de acoplamiento estructural también estaba disponible para el público por el subido a YouTube 5. La comparación de las reconstrucciones en 3D de diferentes partículas de anticuerpos individuales podría revelar la dinámica de proteínas y conformational cambios durante las reacciones químicas 4,5. Teniendo en cuenta que más del 50% de las proteínas tienen una masa molecular que varía desde 40 hasta 200 kDa 1,2, el éxito en la formación de imágenes de estas pequeñas proteínas pone de manifiesto que el método de NPA es una herramienta útil para empujar el límite EM convencional hacia pequeñas y asimétricos determinaciones estructurales y el mecanismo de descubrimientos . Así, se proporciona el protocolo detallado a continuación.

<table><tbody><tr><td>Tinte: Formiato de uranilo</td><td>La División de Suministros SPI de Structure Probe, Inc.</td><td>02545-AA</td><td>http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml</td></tr><tr><td>Jeringa: 1 ml NORM-JECT</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td></td></tr><tr><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491 Filtro de jeringa: 0,2 &mu; m&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28145-487</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa: 0,02 &mu; Filtro m (Anotop 10)</td><td>Whatman</td><td>6809-1002</td><td>http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&region=US Parafilm: 4 pulgadas x 125 pies</td><td>VWR</td><td>470152-246</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A</td></tr><tr><td>Rejilla TEM recubierta de película de carbono: malla 300</td><td>Pacific Grid-Tech</td><td>Cu-300CN</td><td>http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon</td></tr><tr><td>Rejilla TEM recubierta de película de carbono: malla 200</td><td>EMS (Ciencias de la Microscopía Eléctrica)</td><td>CF200-Cu</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx</td></tr><tr><td>Pinza: Dumont Pinza L5</td><td>EMS (Ciencias de la electromicroscopía)</td><td>72882-D</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5</td></tr><tr><td>Milli-Q Advantage A10 Sistema de purificación de agua ultrapura</td><td>EMD Millipore</td><td>Milli-Q Advantage A10</td><td></td></tr><tr><td>http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117 Papel de filtro: Círculos de grado 1</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx</td></tr><tr><td>Papel</td><td></td><td></td> de aluminio <td>Cualquier tipo</td></tr><tr><td>de puntas de filtro: Puntas de filtro de aerosol de baja retención para 10&micro; L Pipettors</td><td>VWR</td><td>89174-520</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Unidad de descarga incandescente</td><td>Ted Pella</td><td>91000</td><td>http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm</td></tr><tr><td>Puntas de filtro: Puntas de filtro de aerosol de baja retención para 40&micro; L Pipetas VWR</td><td></td><td>89174-524</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524</td></tr><tr><td>Puntas de filtro: VWR Signature 200 y micro; L Puntas de pipeta</td><td>VWR</td><td>37001-528</td><td></td></tr><tr><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528 Pipeta</td><td>Pipetman</td><td>F161201 y F167300</td><td>http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx</td></tr></tbody></table>

optimizado tinción negativa: un protocolo de alto rendimiento para el examen de estructura pequeña y asimétrica de proteínas por microscopía electrónica

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

La determinación estructural de proteínas es un gran reto para las proteínas con masas moleculares entre 40 a 200 kDa. Teniendo en cuenta que más de la mitad de las proteínas naturales tienen una masa molecular entre 40 a 200 kDa 1,2, se necesita un método robusto y de alto rendimiento con una capacidad de resolución nanométrica. Tinción negativa (NS) microscopía electrónica (EM) es un enfoque fácil, rápida y cualitativa que con frecuencia se ha utilizado en los laboratorios de investigación para examinar la estructura de la proteína y proteína-proteína interacciones. Por desgracia, los protocolos NS convencionales a menudo generan artefactos estructurales en las proteínas, sobre todo a las lipoproteínas que normalmente se forman presentando artefactos rouleaux. Mediante el uso de imágenes de las lipoproteínas de crio-microscopía electrónica (crio-ME) como estándar, los parámetros clave en NS condiciones de preparación de la muestra fueron seleccionados recientemente y se presenta como el protocolo optimizado NS (NPA), un protocolo de NS convencional modificado 3. Artefactos como rouleaux puede ser limitada en gran medida por NPA, proporcionando, además, un alto contraste junto con razonablemente alta resolución (cerca de 1 nm) imágenes de proteínas pequeñas y asimétricos. Estas imágenes de alta resolución y alto contraste son incluso favorables para una proteína individual (un solo objeto, sin promedio) reconstrucción en 3D, tal como un anticuerpo 160 kDa, a través del método de la tomografía de electrones 4,5. Además, NPA pueden ser una herramienta de alto rendimiento para examinar cientos de muestras de pequeñas proteínas. Por ejemplo, el mecanismo previamente publicado 53 de la proteína de transferencia de ésteres de colesterol kDa (CETP) implicó la selección y obtención de imágenes de cientos de muestras 6. Teniendo en cuenta la crio-EM rara vez con éxito proteínas imágenes menos de 200 kDa aún no ha publicado ningún estudio que implica la detección de más de un centenar de condiciones de la muestra, es justo llamar opns un método de alto rendimiento para el estudio de las proteínas pequeñas. Esperemos que el protocolo NPA que aquí se presenta puede ser una herramienta útil para ampliar los límites de EM y acelerar los estudios de EM en pequeña estructura de proteínas, la dinámica y mecanismos.

Más de la mitad de las proteínas son proteínas pequeñas (masa molecular &lt;200 kDa) que son difíciles tanto para formación de imágenes de microscopio electrónico y reconstrucciones tridimensionales. Tinción negativa optimizado es un protocolo robusto y de alto rendimiento para obtener imágenes de alto contraste y de pequeñas proteínas o complejos asimétricos en diferentes condiciones fisiológicas relativamente alta resolución (~ 1 nm).

Optimizado tinción negativa: un protocolo de alto rendimiento para el examen de Estructura Pequeña y asimétrica de proteínas por Microscopía Electrónica

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de proteínas pequeñas y asimétricas mediante un protocolo optimizado de alto rendimiento de microscopía electrónica con tinción negativa. Esto se logra primero incubando la proteína en una estación de incubación preparada mientras se prepara una estación de trabajo para tinción negativa. El segundo paso del procedimiento consiste en lavar rápidamente la muestra en tres gotas de agua de forma secuencial.El tercer paso consiste en teñir cuidadosamente la muestra en tres gotas de tinte de forma secuencial. El paso final es eliminar la solución en exceso mediante absorción desde la parte posterior de la rejilla de ME y luego secarla suavemente con gas nitrógeno. En última instancia, los resultados pueden mostrar imágenes de alta resolución de proteínas pequeñas mediante imágenes de ME bajo una condición de defoco bajo.La principal ventaja de esta técnica frente a la microscopía electrónica criogénica es que permite el examen de alto rendimiento y la obtención de imágenes con alto contraste de estructuras proteicas pequeñas y asimétricas, al tiempo que reduce los artefactos estructurales derivados de la tinción negativa convencional. Aunque este método puede proporcionar información sobre la base estructural de mecanismos proteicos pequeños, como la proteína transferasa de ésteres de colesterol.También puede aplicarse a otras proteínas, como la IgG, un anticuerpo, la lipoproteína de alta densidad y el proteasoma, que varían ampliamente en tamaño. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de lavado y tinción son difíciles de aprender debido a las variaciones en el tiempo, e incluso el secado de la muestra puede provocar efectos drásticos en la proteína teñida final. La demostración del procedimiento estará a cargo de Z.A., becario de investigación de mi laboratorio. Al prepararse para este protocolo, es necesario preparar una solución de formamida al 1 % prestando la máxima atención para minimizar su exposición a la luz.Esto incluye envolver las partes del filtro de 0,2 micrones para jeringa en papel de aluminio cuando es el momento de filtrar la solución por primera vez. Después de filtrar, almacene alícuotas de dos mililitros en viales envueltos en papel de aluminio a menos 80 grados Celsius el día del experimento. Derrita una alícuota en un baño de agua a temperatura ambiente una vez que se haya descongelado completamente.Vuelva a filtrarlo a través de un filtro de 0,02 micrones con las piezas envueltas en papel de aluminio. El frasco de recolección también debe estar envuelto en papel de aluminio. Transfiera la tinción negativa a una caja de hielo hasta que se utilice.Prepare una lámina para gotas presionando un trozo de param de ocho pulgadas de longitud sobre un soporte para puntas de pipeta. Esto crea indentaciones en forma de surcos que sirven como pozos de cinco milímetros de diámetro. Después de hacer seis filas de pozos, alise el hielo sobre la superficie de una bandeja de poliestireno y luego coloque la lámina sobre el hielo.A continuación, agregue 35 microlitros de agua DI en los tres primeros pocillos de la hoja del lado izquierdo. Luego, cargue los tres pocillos de la derecha en la hoja con 35 microlitros de la solución preparada de tinción negativa. Cubra la bandeja para minimizar la exposición de la solución a la luz.Esto servirá como estación de tinción. Ahora prepare una estación de incubación para rejillas de microscopía electrónica a partir de una caja vacía de puntas de pipeta con un soporte al que se puedan fijar pinzas. Llene la caja hasta la mitad con hielo, de modo que la superficie del hielo quede cerca de la punta de las pinzas cuando estén colocadas.Primero, realice una descarga eléctrica en las rejillas de cobre EM de malla 300 recubiertas con carbono delgado durante aproximadamente 10 segundos. A continuación, tome una rejilla con pinzas que se enganchen a la estación de incubación de rejillas EM. Cuelgue las pinzas con la rejilla, de modo que la rejilla quede inclinada a 45 grados y a media pulgada por encima del hielo.Ahora diluya la muestra de proteína en DPBS a 50-100 microgramos de proteína por mililitro de solución. Aplique inmediatamente alrededor de cuatro microlitros de la dilución sobre la rejilla de microscopía electrónica. Deje que la muestra incube durante aproximadamente un minuto.Después de un minuto, toque rápidamente la malla con papel de filtro para eliminar la solución excesiva. Luego, en la estación de tinción, coloque la malla sobre la primera gota de agua en la película para parafina. Repita rápidamente el proceso de secado del filtro y humedecido con la siguiente gota.Utilice un total de tres gotas de agua y hágalo lo más rápidamente posible. El lavado de la rejilla con agua debe realizarse rápidamente para evitar el efecto adverso del cambio de tampón sobre la proteína. Tras secar la última lavada en tres segundos, comience a flotar la rejilla sobre la primera gota de la solución de tinción negativa.Déjelo flotar durante 10 segundos. Mientras tanto, limpie las pinzas presionando las puntas sobre papel de filtro. Varias veces después del flotado de diez segundos, retire la solución con papel de filtro y comience otro flotado en la siguiente gota de tinción durante dos segundos.Limpie las pinzas durante dos segundos. A continuación, seque la rejilla con papel absorbente y colóquela sobre la tercera gota. Cubra la estación de tinción durante un minuto completo en este paso.La eliminación del colorante debe realizarse tocando el reverso de la rejilla de microscopía electrónica durante un tiempo preciso para asegurar que la rejilla se seque de manera uniforme. Si el papel filtro toca el colorante durante demasiado tiempo, podría eliminarse demasiado colorante, lo que resultaría en un mal rendimiento de la imagen. A continuación, continúe con el secado de la rejilla.Primero, toque todo el lado no carbonado con el papel filtro hasta que la solución se transfiera. Segundo, aplique un flujo suave de gas nitrógeno. Ahora transfiera la rejilla a un recipiente forrado con papel filtro y cúbralo parcialmente.Deje secar la rejilla en el recipiente durante 30 minutos a temperatura ambiente. Alternativamente, las muestras que contienen lípidos pueden incubarse a 40 grados Celsius durante una hora. Una vez completamente secas, transfiera la rejilla de microscopía electrónica (EM) a un estuche de almacenamiento para rejillas de EM antes de comenzar, alinee primero el microscopio electrónico de transmisión (TEM).Verifique la resolución del anillo de descongelación más alto visible con el espectro de potencia de un área de película de carbono de la rejilla teñida negativamente, que debe ser mejor que la resolución objetivo. Luego, para ajustar la alineación, revise cuidadosamente el espectro de potencia en el área de la película de carbono del espécimen. En condiciones adecuadamente alineadas, se pueden visualizar más de 20 anillos T tho, lo que corresponde a una visualización mejor que cinco angstroms.Los anillos se fabricaron mediante transferencia de peletería de una imagen de carbono amorfo bajo un desenfoque de 1,6 micrones y una dosis de 20,4 electrones por angstrom cuadrado. Ahora, restablezca el enfoque a una condición cercana al enfoque de Scherzer, aproximadamente 0,1 micrómetros, para la visualización de proteínas pequeñas durante el examen de la rejilla de microscopía electrónica. Idealmente, las áreas teñidas suelen estar cerca del borde de las áreas nubladas más gruesas y teñidas, a baja magnificación.La estructura de las muestras de lipoproteínas se observó con OPNS. Ejemplos incluyen HDL recombinante, plasma humano, LDL, IDL de plasma humano y VLDL de plasma humano. También se observaron estructuras más pequeñas como CETP de 53 kilodalton.Esta es una de las proteínas más pequeñas que se han logrado visualizar mediante eem. La superposición de la estructura cristalina de CETP coincide muy bien con la imagen, siendo muy dinámica. También se observaron proteínas heterogéneas en anticuerpos de inmunoglobulina G de 160 kilodalton.Tres subdominios eran claramente visibles. Un examen más detallado del anticuerpo IgG uno se utilizó para realizar una comparación con su estructura cristalina. La estructura cristalina del anticuerpo IgG uno coincide con la vista de microscopía electrónica de estos anticuerpos en muchos aspectos, como en las posiciones de los dominios y sus formas.Las demás moléculas observadas incluyen la apolipoproteína A-1 libre de lípidos de 28 kilodalton, EL crecimiento y los proteasomas. Esencialmente, el método OPNS mejora significativamente los límites de la imagenología por ME para estructuras asimétricas pequeñas, así como para estudios mecanicistas asociados durante el intento del procedimiento. Es importante reducir al máximo la exposición a la luz del reactivo de tinción, lavar rápidamente el espécimen y utilizar enfoque cercano al punto de congelación para la imagenología tras seguir este procedimiento.Otros métodos como la tomografía electrónica pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como las estructuras de resolución a nivel nanométrico de moléculas individuales y los cambios conformacionales entre ellas. Tras este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural exploraran los intercambios de ésteres del grupo entre las lipoproteínas plasmáticas humanas.

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Optimizado tinción negativa: un protocolo de alto rendimiento para el examen de Estructura Pequeña y asimétrica de proteínas por Microscopía Electrónica (Video) | JoVE Journal

Optimizado tinción negativa: un protocolo de alto rendimiento para el examen de Estructura Pequeña y asimétrica de proteínas por Microscopía Electrónica

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