Flujo de trabajo completo para el análisis de las histonas modificaciones post-traduccionales El uso de espectrometría de masas de abajo hacia arriba: A partir de la histona Extracción de Análisis de Datos

El objetivo general de este protocolo es proporcionar un procedimiento simple para evaluar la abundancia relativa de modificaciones postraduccionales de histonas, que desempeñan funciones esenciales en la biología de la cromatina, como la regulación de la expresión génica y la condensación cromosómica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de la cromatina. Por ejemplo, qué modificaciones de histonas cambian su abundancia relativa con la estimulación o el tratamiento de células o tejidos dados.

La principal ventaja de esta técnica es que, mediante el uso de la proteómica basada en espectrometría de masas, podemos cuantificar simultáneamente la mayoría de los PTMs conocidos sobre proteínas conocidas en un solo análisis. El análisis de modificación de histonas tiene numerosas aplicaciones, incluida la estimación de cambios epigenéticos y la operación de la cromatina de individuos o sistemas modelo durante el tratamiento con medicamentos o el estrés. Además de Simone, otros dos miembros de mi laboratorio demostrarán los procedimientos de este protocolo.

Natarajan Bhanu, especialista en investigación, y Kelly Karch, estudiante de posgrado. Como se muestra en este flujo de trabajo, se trata de un protocolo de 10 pasos que incluye la purificación de histonas a partir de cultivos celulares o tejidos, la derivatización, digestión y desalinización de histonas, y el análisis de espectrometría de masas mediante cromatografía líquida de nanoflujo. En este video solo se demostrarán los procedimientos seleccionados.

Para comenzar el procedimiento de aislamiento de núcleos de células intactas, descongele en hielo, las células que previamente se recolectaron y almacenaron a menos 80 grados centígrados. Y preparar el tampón de aislamiento nuclear, o NIB, como se describe en el texto del protocolo. Retire un quinto volumen de NIB y agregue NP-40 Alternative a una concentración final de 0.2%El volumen restante de cuatro quintas partes se utilizará para lavados.

Lave el pellet de celda con NIB sin NP-40 Alternative, utilizando una proporción de 1:10 entre el volumen de pellets de celda y el volumen tampón. Centrifugar a 700 RCF durante cinco minutos y eliminar el sobrenadante. Lise el pellet de celda colocándolo en hielo y agregando NIB con la alternativa de NP-40 al 0.2% en una proporción de 1:10 entre el volumen del pellet de celda y el volumen del tampón.

Homogeneizar las células mediante un pipeteo suave. Incubar las células homogeneizadas en hielo durante cinco a 10 minutos para que las células se lisen y liberen los núcleos. Centrifugar a 1000 RCF durante cinco a 10 minutos a cuatro grados Celsius.

El pellet contendrá principalmente núcleos celulares, mientras que el sobrenadante contendrá principalmente componentes citoplasmáticos. Guarde la fracción citoplasmática si lo desea. Lave el pellet de los núcleos volviendo a suspenderlo suavemente sin NP-40 Alternative, utilizando una proporción de 1:10 entre el volumen del pellet y el volumen tampón.

Centrifugar a 1000 RCF durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y retirar el supernatent. Después de que NP-40 Alternative se haya eliminado por completo de la pelletización de núcleos, agregue ácido sulfúrico 0.2 molar helado en una proporción de 1:5 entre el volumen de los núcleos y el volumen de ácido sulfúrico. Vuelva a suspender los núcleos en el ácido sulfúrico mediante un pipeteo suave.

Incubar la muestra con rotación constante o agitándola suavemente durante dos a cuatro horas a cuatro grados centígrados. A continuación, centrifugar la muestra a 3400 RCF a cuatro grados centígrados durante cinco minutos y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Vuelva a centrifugar y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo para eliminar cualquier material insoluble.

Para precipitar las histonas, agregue ácido tricloroacético 100% o TCA enfriado al sobrenadante recolectado en una proporción de volumen de 1:3. La presencia de histonas se indica porque la muestra se vuelve turbia. Mezcle invirtiendo el tubo unas cuantas veces.

Incuba la mezcla en hielo durante al menos una hora. Centrífuga a 3400 RCF durante cinco minutos. Después de la centrifugación, las histonas cubrirán los lados del tubo y también se depositarán en el fondo.

También se formará una bolita blanca e insoluble en el fondo del tubo, que contiene principalmente proteínas no histonas y otras biomoléculas. Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración, sin raspar los lados del tubo, ni el pellet en el fondo del tubo. Con una pipeta Pasteur de vidrio, enjuague el tubo con acetona 100% helada más ácido clorhídrico al 0,1%, para cubrir las proteínas precipitadas que recubren los lados y el fondo.

Centrífuga a 3400 RCF durante dos minutos. Aspirar el sobrenadante con cuidado, sin raspar los laterales ni el pellet. Enjuague el tubo con acetona 100% helada, vuelva a centrifugar y retire el sobrenadante sin raspar los lados ni el pellet.

Posteriormente, se realiza la cuantificación de histonas y el análisis de pureza como se describe en el texto del protocolo. También se puede realizar un fraccionamiento opcional de las variantes de histonas mediante HPLC de fase reversa antes de la derivatización de histonas. Comience este procedimiento disolviendo las muestras de histonas en 40 microlitros de bicarbonato de amonio 50 milimolares, pH 8.0.

Compruebe el pH insertando una punta de pipeta P10 en la muestra sin aspiración y tocando la punta de la pipeta con una tira indicadora de pH. Use hidróxido de amonio y ácido fórmico para ajustar el pH a 8.0. A partir de aquí, todos los pasos que impliquen el uso de anhídrido propiónico deben realizarse en una campana extractora.

Procese un máximo de tres a cuatro muestras a la vez, con el fin de mantener el anhídrido propiónico reactivo. Prepare el reactivo de propionilación fresco mezclando anhídrido propiónico con acetonitrilo en una ración de volumen de 1:3. Añada el reactivo de propionilación a cada muestra en una proporción de volumen de 1:4.

Agregue rápidamente hidróxido de amonio para restablecer el pH 8.0 a la solución. Por lo general, la adición de hidróxido de amonio a la muestra con una relación de volumen de 1:5 es apropiada para restablecer el pH 8.0. Mezclar inmediatamente por vórtice.

Revisa el pH. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de que todas las muestras se hayan sometido a propionilización, seque las muestras hasta 10 a 20 microlitros en un concentrador de vacío.

Volver a suspender o diluir las muestras con ddH20 hasta alcanzar 40 microlitros de volumen final. Dado que las sales impiden la cromatografía líquida y la espectrometría de masas, las muestras deben desalinizarse antes del análisis. A los efectos de este video, solo se demostrará la construcción de las puntas de los escenarios.

Utilice una punta de pipeta P1000 para perforar un disco de material C18 a partir de un disco de extracción en fase sólida. Utilice un capilar de sílice fundida para empujar el minidisco fuera de la punta P1000 y hacia la parte inferior de una punta de pipeta P100 o P200. Asegúrese de que el disco esté bien encajado en la parte inferior de la punta.

Si desala más de 25 microgramos de muestra, utilice dos minidiscos C18 en la misma punta P100 o P200. Utilice un adaptador de centrífuga para mantener las puntas de las etapas en su lugar en tubos de microcentrífuga de 1,5 o dos mililitros. Enjuague la resina centrifugando con 50 microlitros de acetonitrilo al 100% para activar el material C18 y eliminar los posibles contaminantes.

Posteriormente, se realiza la desalinización de la muestra como se describe en el texto del protocolo. Los péptidos de histonas están presentes en una variedad de formas isobáricas. Se muestran dos ejemplos comúnmente abundantes en el análisis de histonas.

El cromatograma iónico extraído de su masa precursora y sus isótopos relativos, que se muestra arriba, es idéntico. Sin embargo, el cromatograma iónico extraído de los iones producto, que se muestra a continuación, permite la discriminación de las dos formas isobáricas. Solo se deben usar iones de fragmentos únicos, resaltados en rojo, para estimar la abundancia relativa de las dos especies.

Se analizaron histonas extraídas de células madre embrionarias humanas, con y sin estimulación con ácido retinoico. La cuantificación relativa de dos péptidos H3 de histonas reveló una clara reducción de la acetilación en las células madre embrionarias humanas, estimuladas para la diferenciación. Esto es consistente con informes previos de una mayor acetilación en las células madre embrionarias, en comparación con las células en diferenciación.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días si se realiza correctamente. Un día para la extracción de histonas, el segundo día para la derivatización y digestión de proteínas y el tercer día para la derivatización de péptidos, la inclinación de etapas y el análisis de LC-MS. La purificación de histonas se puede explotar para otros fines además del análisis de péptidos, incluida la proteómica de mitad hacia abajo y de arriba hacia abajo, donde es posible caracterizar modificaciones combinatorias de histonas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar y cuantificar la modificación postraduccional de histonas utilizando proteómica basada en espectrometría de masas.