Desarrollo de dispositivos microfluídicos para estudiar la capacidad de elongación de la punta de crecimiento de las células vegetales en espacios extremadamente pequeños

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular de las plantas, como la forma en que las células vegetales que crecen en punta penetran las barreras físicas celulares. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de adquirir imágenes de alta resolución que reconstruyen el proceso de deformación de una célula a escala micrométrica bajo un microscopio convencional. Para hacer un dispositivo para examinar los tubos de polen en crecimiento y los protonemas de musgo, primero haga aproximadamente 11 gramos de un PDMS y cárguelo en un molde de cuatro pulgadas.

A continuación, desgasifica el molde durante 20 minutos en una cámara de vacío. A continuación, cura el molde a 65 grados centígrados durante 90 minutos. Una vez curado, retire la capa de PDMS del molde y abra los orificios de acceso al canal dentro del PDMS con una herramienta de punzón de biopsia.

A continuación, exponga el PDMS y el plato de vidrio de cinco centímetros al plasma aéreo durante 50 segundos. Para sellar la red microfluídica, presione la capa de PDMS sobre la placa de vidrio y cúrela durante 30 minutos a 65 grados centígrados. Para hacer un microdispositivo diseñado para el examen del vello radicular, se cargan y curan dos moldes.

Al perforar los orificios del canal, use un punzón de dos milímetros. Después de exponer ambas capas al plasma de aire durante 50 segundos, únalas, incluyendo un cubreobjetos, bajo un microscopio estereoscópico. Utilice la herramienta de alineadores personalizada para lograr esto.

Cura el conjunto durante 30 minutos en el horno para sellar la red microfluídica. Después del curado, retire el cubreobjetos del dispositivo y transfiéralo a un plato de vidrio de cinco centímetros. Antes de utilizar el microdispositivo de tubo polínico, desgasifique en una cámara de vacío durante 20 minutos.

Añada medio de crecimiento a la entrada del pistilo con una micropipeta de punta fina. Cargue los otros pozos con el mismo medio. Espere unos minutos para que los canales se llenen.

Mientras tanto, coloque una toalla de papel húmeda en el plato para ayudar a mantener la humedad local. Ahora, recoja granos de polen de una flor azul y blanca de T.fournieri. Transfiera los granos al estigma con una aguja de disección.

A continuación, corte un estilo polinizado de un centímetro de largo a lo largo y luego inserte el estilo de corte en la entrada del dispositivo microfluídico. Cuando el estilo de corte se inserta en la entrada del dispositivo microfluídico con pinzas, es importante no sujetar el estilo muy apretado porque puede dañar el estilo. Luego, asegure una tapa en el plato con cinta adhesiva y transfiera el plato a una incubadora a 28 grados centígrados, donde debe permanecer en la oscuridad durante cinco o seis horas.

Trabajando bajo una campana de flujo laminar, comience esterilizando las semillas transgénicas de A. thaliana Columbia. Sumérjalos en solución limpiadora durante cinco minutos. Luego, enjuague bien las semillas en agua esterilizada en autoclave.

Una vez esterilizadas, almacene las semillas a cuatro grados centígrados en oscuridad durante 48 horas. Unos días después, desgasifique el microdispositivo durante 20 minutos antes de usarlo. A continuación, cargue el medio de crecimiento adecuado en los pocillos del dispositivo con una pipeta de punta fina y espere unos minutos a que la solución pase por todos los canales.

Además, cargue una toalla de papel húmeda en el plato para mantener la humedad. Ahora, transfiera una semilla preparada a la entrada del dispositivo. Luego, asegure la tapa con cinta adhesiva y transfiera el plato a una incubadora de 22 grados centígrados con luz continua.

Antes de su uso, esterilice el microdispositivo bajo rayos UV durante la noche. Al día siguiente, desgasifique el microdispositivo durante 20 minutos. Una vez desgasificados, cargue los micropocillos con el medio de crecimiento adecuado.

Mientras los canales se llenan gradualmente, rodee el microdispositivo con un poco de agua esterilizada en autoclave para mantener la humedad. Transfiera un pequeño trozo de tejido de musgo protonemata a la entrada del microdispositivo. Ahora, cultive el dispositivo a 25 grados centígrados bajo luz continua.

Después de dos o tres semanas de crecimiento, tome imágenes de campo claro de los resultados bajo un microscopio. Las células vegetales que crecen en punta encuentran una serie de barreras físicas a lo largo de sus vías de crecimiento in vivo, como en el tracto transmisor y en el micrópilo, por no mencionar la trayectoria de los pelos de las raíces en el suelo. Las plataformas de cultivo celular microfluídico in vitro presentadas permiten examinar el proceso de crecimiento de la punta en tres tipos de células vegetales, tubos polínicos, pelos radiculares y protonemas de musgo.

La visualización se realiza a través de espacios de una micra en los dispositivos. Debido a que los microespacios de este tamaño son frágiles, a veces se cierran, especialmente después de un uso repetido. Por lo tanto, es importante verificar que los espacios estén intactos antes de realizar los experimentos.

Para el estudio del tubo polínico, se utilizaron imágenes de células vivas para monitorear los cambios morfológicos en la región apical de los tubos polínicos, así como en el núcleo vegetativo y los espermatozoides en respuesta al encuentro con un espacio extremadamente pequeño. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular de las plantas exploraran la capacidad de elongación de las células vegetales que crecen en la punta, como los tubos de polen, los pelos de las raíces y los protonemas de musgo en un espacio extremadamente pequeño.