Name: Método cuantitativo y cualitativo de la esfingomielina por LC-MS con dos estable isotópicamente etiquetada especies de esfingomielina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprende a cuantificar y caracterizar especies de esfingomielina en muestras biológicas mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem. Este protocolo utiliza células HeLa y estándares isotópicos para análisis preciso de lípidos.

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Este trabajo fue financiado por una beca de investigación del Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología de Japón (KAKENHI) a K.H. (#15 K 01691), Dufr (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) y una beca para el estudio de la enfermedad del Ministerio de Salud, trabajo y bienestar (K.Y. 201510032A #). Agradecemos la Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) para la edición de una versión preliminar de este manuscrito.

Consultar todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) antes de su uso. Guantes para minimizar la contaminación de las muestras por SM derivados de la piel. El presente Protocolo se aplicó a las células HeLa cultivadas en medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 1.000 U/L penicilina y estreptomicina 100 mg/L.
1. preparación de las muestras de lípidos
Nota: Es importante que toda la cristalería incluyendo tubos de ensayo con tapones de rosca forrado de teflón libre de detergente.
<ol><li>Extracción de la fracción lipídica total de homogeneizado celular utilizando el método de Bligh & Dyer7<ol>
<li>Eliminar la cultura (o condicionado) medios de comunicación de la placa de cultivo de tejidos de 10 cm y enjuague dos veces con 6 mL de PBS helado.</li>
		<li>Agregar 1 mL de PBS helado P1000 pipeta en el recipiente de cultivo de tejidos de 10 cm. Las células de la cosecha con raspadores de células y recoger en tubos de plástico siliconados de 2,0 mL.</li>
		<li>Después de la centrifugación (1.000 x g, 5 min, 4 ° C), retire el sobrenadante con una pipeta P1000.</li>
		<li>Añadir 1 mL de metanol. Mezclar los tubos brevemente y someter a ultrasonidos en 200 W por 5 min en un sonicador de baño tipo. Nota: Ajuste el nivel del agua en un sonicador de baño tipo para que el precipitado de células eficientemente está homogeneizado.</li>
		<li>Transferir el homogeneizado celular en metanol con una pipeta en tubos de ensayo (13 x 100 mm) con tapones de rosca forrado de teflón.</li>
		<li>Añadir 1 mL de metanol, 1 mL de cloroformo, 0,8 mL de agua bidestilada y 50 μl de 10 μmol/L de d18:1 estándar interno /(D31)-16:0 SM en cada tubo de ensayo.</li>
		<li>Tubos de ensayo Vortex vigorosamente durante 5 min a temperatura ambiente. Nota: en este punto, una sola fase (Cloroformo/metanol/agua = 1/2/0.8 (v/v/v)) se forma.</li>
		<li>Añadir 1 mL de cloroformo y 1,0 mL de agua bidestilada.</li>
		<li>Tubos Vortex vigorosamente a 2,500 rpm durante 5 min a temperatura ambiente. Nota: en este punto, la acuosa (superior) fase y fase orgánica (la inferior) está separada.</li>
		<li>Después de la centrifugación (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), recoger y transferir la fase inferior en tubos de vidrio desechables (fase inferior). Nota: Recoge la fase más baja utilizando una pipeta Pasteur y un filtro de pipetas de seguridad. Inserte la punta de la pipeta en la fase inferior, apriete el bulbo pequeño al lado de la válvula 'E' para entregar la fase superior y la interfacial pelusa dentro de la punta de la pipeta y luego succionar la fase inferior en la pipeta.</li>
		<li>Añadir 2 mL de cloroformo en los tubos de ensayo y vórtice los tubos vigorosamente a 2,500 rpm durante 5 min a temperatura ambiente para mezclar con la fase superior y pelusa interfacial suficientemente.</li>
		<li>Después de la centrifugación (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), recoger y transferir la fase inferior modificada en los tubos de vidrio desechables con la fase inferior inicial como se describe en el paso 1.1.10.</li>
		<li>Colocar los tubos de vidrio con un chorro de nitrógeno y eliminar por completo los solventes orgánicos en la fase inferior recogida.</li>
		<li>Reconstituya las muestras con 500 μl de metanol o etanol, líquido filtrado con un filtro de 0,02 μm y almacenar en frascos de cristal a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de muestras para construir la curva de calibración y validación del método<ol>
<li>Añadir 50 μl de 0,1, 0,5, 1, 5, 10 o 50 μmol/L del compuesto estándar (d18:1 /(D9) 18:1 SM) en tubos de ensayo con tapones de rosca forrado de teflón.</li>
		<li>Homogeneizado de células en cada tubo de ensayo y añadir metanol a 1 mL. Nota: La cantidad de homogeneizado celular como matriz varía según cada experimento. Si habitualmente se analizan las especies SM en muestras procedentes de las células en una placa de cultivo de 10 cm, la cantidad de homogeneizado celular en cada tubo de ensayo debe ser cercano de las células en una placa de cultivo de 10 cm.</li>
		<li>Extracto de la fracción lipídica total como se describe en pasos 1.1.6-1.1.14.</li>
		<li>Preparar control de calidad (QC) muestras para validar el método ya descrito en pasos 1.2.1-1.2.3. Preparar tres muestras de control de calidad con diferentes concentraciones del compuesto estándar (d18:1 /(D9) 18:1 SM): en un plazo de 3 x el límite inferior de la curva estándar (control de calidad-baja, control de calidad-L), uno cerca del centro (centro de control de calidad, control de calidad-M) y uno cerca del límite superior de la curva estándar (control de calidad-alto, control de calidad-H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. SM análisis por LC-ESI-MS/MS
<ol><li>Preparación de la fase móvil<ol>
<li>Mezclar los disolventes (metanol/acetonitrilo/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) para la fase acuosa y el isopropanol para la fase orgánica) en botellas con tapones de rosca forrado de teflón de cristal y someter a ultrasonidos durante 5 minutos en un sonicador de baño tipo.</li>
		<li>Añadir ácido fórmico (concentración final 26,4 mmol/L) y NH4OH (14.9 mmol/L) en cada fase móvil.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis cualitativo de SM por LC-ESI-MS3<ol>
<li>Activar el sistema de cromatografía líquida (HPLC) de alto rendimiento, poner tubos de entrada en las botellas de vidrio que contienen fases móviles y purgar la linea HPLC. Enlazar una columna HPLC de18 C (1,5 mm diámetro interior x 100 mm de longitud, partícula tamaño 3.0 μm) con el sistema HPLC, mantener la temperatura en el horno de la columna a 50 ° C y la columna con la fase móvil acuosa en 100 μl/min poner las muestras en una gradilla de muestras en el autosampl de la condición ER.</li>
		<li>Configure los parámetros de la triple cuadrupolo quadrupole sistema de espectrometría de masas de trampa iónica lineal para MS3 análisis indicados en la tabla 1 y tabla 2 , así como el precursor de la primero y la segundo los iones de la especie SM de interés.<ol>
<li>Haga doble clic en el icono del software de adquisición de datos, haga doble clic en la configuración de' Hardware', seleccione 'LC + QTRAP4500 + válvula' y haga clic en 'Activar perfil'.</li>
			<li>Crear una nueva subcarpeta haciendo clic en 'Nuevo subproyecto' y 'OK'.</li>
			<li>Haga clic en la pestaña 'archivo', seleccione 'Nuevo' y seleccione 'Método de adquisición' y 'OK'. Haga clic en el icono de 'Masa espec' y 'MS' ficha seleccione escanear tipo como 'MS/MS/MS (MS3)', tasa de lectura como 10.000 Da/s polaridad como 'Negativos' y 'Duración' como todo tiempo para ser analizado (min). Establecer la m/z de la 'Parada (Da)' y 'Start (Da)' como la gama que se analizarán. Establecer la m/z de los iones precursores 1 º y 2 º del objetivo especies de SM de interés. Nota: Para analizar múltiples especies de SM, destacan la '-MS3' icono, click derecho, seleccione 'Copiar este experimento' y luego poner la m/z de los iones precursores 1 y 2 de otras especies de SM.</li>
			<li>Seleccione la ficha 'MS avanzado' y establecer cada parámetro como se indica a continuación: modo de escaneo como 'Perfil', el tamaño de paso como 0.12 (Da), resolución Q1 y Q3 'Unidad' y 'Iluminada', respectivamente, umbral de intensidad como 0, tiempo de fraguado como 50 (ms), pausa entre rangos de masa como 1,5 ms, seleccione ' dinámica completar ', barrera de entrada Q3 como 8 V y el tiempo de excitación como 25 ms.</li>
			<li>Haga clic en el botón 'Editar parámetros' en la pestaña de 'MS' y seleccione la 'fuente Gas' ficha configurar los parámetros de la cortina gas, colisión, ionspray voltaje, temperatura, iones fuente gas1 y gas2 como se indica en la tabla 1. Luego seleccione la ficha 'Compuesto' configure los parámetros del potencial desclusterización, potencial de entrada, energía de la colisión, energía de la excitación y energía de la colisión separado como se indica en la tabla 2.</li>
			<li>Destacar 'Integrado Valco Valve' y seleccionar 'Nombre de la posición de paso 0' como A y 'B' como posición total 5,0 min de tiempo. También establecer 'A' como posición total tiempo min 70,0.</li>
			<li>Destacar el 'Sistema de Shimadzu LC'. Seleccione la ficha 'Bomba' y programar el modo de bombeo como flujo binario, flujo total 0,28 mL/min, como máximo de límites de presión como 20,0 MPa. Seleccione la ficha 'Automático' y ajuste el volumen de enjuague como 200 μL, carrera 52 mm, enjuague velocidad 35 μl/s, velocidad de 5.0 μL/s de muestreo de la aguja, purga tiempo 25,0 min., enjuague inmersión tiempo como 5 s y el modo de enjuague como 'Antes y después de la aspiración'.<ol>
<li>Además, permite la unidad, la temperatura más fría 4 ° c y el movimiento de la aguja de control vial como 52 mm. Seleccione la ficha 'Horno', activar el horno fijar la temperatura del horno y temperatura máxima 50 ° C y 85 ° C, respectivamente.</li>
				<li>Seleccione la ficha 'Controlador' y marque la casilla 'Encendido'. Seleccione la ficha 'Programa' y establecer así los gradientes de solventes: solventes A / B en una proporción de 100/0 por 5 min, programa lineales alteraciones a 80/20 durante 4 min, 35/65 sobre 50 minutos, 25/75 y más 1 minuto luego , mantener durante 10 minutos, luego linealmente a 100/0 de 25/75 sobre 4 minutos. Guarde el método.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Crear el archivo por lotes<ol>
<li>Haga doble clic en el icono de 'Construir la adquisición lote', haga clic en 'Añadir Set', ' Añadir ', establecer el número de muestras nuevas y haga clic en 'Aceptar'.</li>
			<li>Haga clic en el botón ' método Editor' y seleccione el método que se utilizará. Si se utilizan múltiples métodos en un archivo por lotes, seleccione la casilla de 'Uso múltiples métodos' y seleccione el método de adquisición para cada muestra. Cambiar el nombre de 'Nombre' de la muestra, el número apropiado para' frasco', poner y la cantidad de volumen de inyección. Guarde el archivo por lotes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Obtener el producto de3 MS espectros de iones de las especies de SM de interés por el análisis por LC-ESI-MS3<ol>
<li>Seleccione la opción de 'Enviar' en el archivo por lotes, resaltar la línea de las muestras a analizar y haga clic en el botón 'Enviar'.</li>
			<li>Haga clic en la '' vista Quene', icono 'Equilibrado', seleccione el método de adquisición a utilizar, establecer tiempo como 1 min y haga clic en 'Aceptar'.</li>
			<li>Desactivar 'Instrumento de reserva para Tuning' haciendo clic en el icono correspondiente. Luego ejecutar secuencia de lote haciendo clic en el icono de 'Sample Start'.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Asignar a cada MS3 espectros de iones producto de la SM comparando la masa para cargar cociente (m/z) del producto espectros de iones y la masa exacta del esfingoide LCB y N-molécula de acil de interés. Determinar el número de carbonos y dobles enlaces en el esfingoide LCB y N-molécula de acil según los iones del producto correspondiente.<ol>
<li>Confirme que está seleccionada la carpeta correspondiente sub-proyecto, haga doble clic en el icono 'Abrir el archivo de datos' y seleccionar las muestras a analizar. Arrastrar el pico en el cromatograma de cada destino especies de SM y haz luego doble clic. Se presentarán los obtenidos MS3 producto ion espectros dentro de la zona arrastrada.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis cuantitativo de la SM por LC-ESI-MS/MS<ol>
<li>Establecer las fases móvil y columna HPLC como se describe en el paso 2.1 y 2.2.1.</li>
		<li>Configure los parámetros de la triple cuadrupolo quadrupole sistema de espectrometría de masas de trampa iónica lineal de reacción múltiple monitoreo análisis (MRM) que se enumeran en la tabla 1 y tabla 2.<ol>
<li>Realizar los procedimientos como se describe en paso 2.2.2.1 2.2.2.2.</li>
			<li>Haga clic en la pestaña 'archivo', seleccione 'Nuevo' y seleccione 'Método de adquisición' y 'OK'. Haga clic en el icono de 'Masa espec' y 'MS' ficha seleccione escanear tipo como 'MRM', polaridad como 'Positivo'. Establecer 'Duración' como todo el tiempo a analizar. Configurar el m/z de [M + H]+ y 184 'Q1 masa (Da)' como 'Q3 masa (Da)' del objetivo especies de SM de interés, respectivamente. Establecer 'Time' como 'ID' como el nombre del destino especies SM 10 ms.</li>
			<li>Seleccione la ficha 'MS avanzado' y ajustar cada parámetro como sigue: de la resolución Q1 y Q3 como 'Unidad', el umbral de intensidad 0, tiempo de fraguado como 0 (ms) y pausa entre rangos de masa como ms 5.</li>
			<li>Haga clic en el botón 'Editar parámetros' en la pestaña de 'MS' y seleccione la ficha 'Fuente Gas' poner el parámetro de cortina gas, colisión, ionspray voltaje, temperatura, iones fuente gas1 y gas2 como se indica en la tabla 1. Continuación, seleccione la ficha 'Compuesto' poner los parámetros de desclusterización potencial, potencial de entrada, energía de la colisión y colisión célula salida potencial como se indica en la tabla 2.</li>
			<li>Coloque la válvula como se describe en el paso 2.2.2.6.</li>
			<li>Establezca la condición de la LC como se describe en el paso 2.2.2.7. Guarde el método.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Crear el archivo por lotes como se describe en el paso 2.2.3.</li>
		<li>Obtener los datos MRM de cada especie SM LC-ESI-MS/MS de análisis como se describe en el paso 2.2.4.</li>
		<li>Los datos de MRM usando el software para integración de datos y obtener los datos de área de pico para el cromatograma de iones extraídos de cada especie de SM.<ol>
<li>Haga doble clic en el icono del software para integración de datos en análisis cuantitativo, haga clic en la pestaña de 'Edición' y selecciona usuario integración por defecto. Establecer ancho liso Gaussiano como 1,0 punto y haga clic en 'Aceptar'. Haga clic en la pestaña de 'Edición' y seleccione 'Nueva tabla de resultados'. Seleccionar la muestra a ser integrado, haga clic en un botón de la flecha y haga clic en 'Siguiente'. Seleccione 'Crear nuevo método' establecer el nombre del método y haga clic en 'Siguiente'. Haga clic en 'Siguiente' y marque la casilla de d18:1 /(D31) 16:0 SM tal como está, haga clic en 'Siguiente' y haga clic en 'Finalizar'.</li>
			<li>Haga clic en 'Muestra la revisión de pico' y confirmar que los picos del cromatograma se reconocen apropiadamente. Cabe señalar que el tiempo de retención de d18:1 /(D31)-16:0 SM es generalmente menor en ~ 0,3 min en comparación con el de la SM de 34-1 (generalmente se compone de d18:1 / 16:0 SM).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cuantificar cada especie SM según la relación del pico de cada especie de SM a la d18:1 /(D31) 16:0 estándar interno de SM.<ol>
<li>Haga clic en la pestaña 'Archivo', seleccione 'Exportar', seleccione 'Tabla de resultados', confirmar el formato como 'MultiQuant', columnas como exportación de todas las columnas, filas como 'Exportar todos los registros excepto los explícitamente ocultos' y haga clic en 'OK'.</li>
			<li>Abra el archivo exportado en el software Excel. Normalizar la zona del objetivo especies de SM por la zona de es (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Luego multiplique por la cantidad teórica del es de la muestra inyectada para calcular la cantidad de objetivo especies de SM en la muestra inyectada.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Construir la curva estándar<ol>
<li>Obtener los datos MRM de d18:1 /(D9)-18:1 SM y d18:1 /(D31) 16:0 SM en las muestras para la construcción de la curva estándar por LC-ESI-MS/MS de análisis como se describe en el paso 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Obtener los datos de la zona del pico de d18:1 /(D9)-18:1 SM y d18:1 /(D31) 16:0 SM como se describe en el paso 2.3.5.</li>
		<li>Calcular la cantidad de d18:1 /(D9)-18:1 SM en la muestra inyectada como se describe en paso 2.3.6.</li>
		<li>Construir la línea de tendencia estableciendo el eje x y eje y como la cantidad nominal y la cantidad calculada de d18:1 /(D9)-18:1 SM y obtener la fórmula de la línea de tendencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Validar el método cuantitativo utilizando el software Excel<ol>
<li>Para la validación del método, cuantificar la cantidad de d18:1 /(D9)-18:1 SM y d18:1 /(D31) 16:0 SM en el control de calidad de muestras mediante el análisis de cada control de calidad de la muestra por lo menos tres veces en un día y repetir al menos 3 días, como se describe en paso 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Obtener los datos de área de pico y calcular la cantidad de d18:1 /(D9)-18:1 SM en la muestra inyectada como se describe en paso 2.3.5 y 2.3.6.</li>
		<li>Según la curva de calibración obtenida, calcule la cantidad de d18:1 /(D9)-18:1 SM en la muestra inyectada.</li>
		<li>Evaluación de la precisión<ol>
<li>Calcular la media y la desviación estándar de la cantidad de d18:1 /(D9)-18:1 SM obtenida en el paso 2.5.3 en el dataset del intra-día y el día utilizando el software de Excel.</li>
			<li>La media obtenida en el paso 2.5.4.1 es dividida por la desviación estándar y expresada en %.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Evaluación de la exactitud<ol>
<li>Calcular la exactitud de cada datos como sigue: [(Calculado importe obtenido en el paso 2.5.3.) / (Cantidad nominal) - 1] × 100(%)</li>
			<li>Calcule el promedio del valor absoluto de la precisión en el conjunto de datos del intra-día y entre días.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.

En el presente método cualitativo, hemos obtenido MS3 iones del producto de un proceso estadístico y un N-molécula de acil. Es fundamental para asignar correctamente un SPC y una N-molécula de acil. Para ello, debe señalarse que también se pueden detectar otras moléculas de Fosforilcolina que contiene como MS3 iones del producto. Diacil-fosfatidilcolina (PC) y del plasmalógeno del PC están abundantemente presentes en células de mamífero y su hidrofobicidad es similar a la de SM. Po...

Esfingomielina (SM) es un sphingolipid comun en células de mamíferos. SM es sintetizada intracelularmente1 y presente como un precursor para otros esfingolípidos como un esfingosina-1-fosfato y una ceramida, que tienen papeles cruciales en inmune celular trata y homeostasis de la barrera, respectivamente2, de la piel 3. Así, el análisis preciso del metabolismo del SM es importante dilucidar las funciones fisiológicas y patológicas de los ESFINGOLIPIDOS.
SM se compone de una ceramida y una Fosforilcolina vinculado con el grupo 1-hidroxilo de la ceramida, que se compone además de una esfingosina y un N-molécula de acil. Una variedad en los números de carbono y doble enlace en la esfingosina y la N-molécula de acil da lugar a la especie número de ceramida (y SM). Los avances recientes en LC-ESI-MS/MS ha permitido análisis cuantitativo y cualitativo de la SM4,5. En el análisis cualitativo, el número de carbono y de dobles enlaces de un esfingoide LCB de SM fue identificadas mediante la asignación de espectros de iones producto de LCB. Sin embargo, la información estructural de la N-molécula de acil directamente no se obtuvo porque no se han divulgado sus correspondientes iones producto y por lo tanto N-grupos acilo se dedujeron por análisis diferencial entre los iones precursores y iones del producto correspondiente a LCB en ambos iones positivos y negativos modos4,5. En este informe, presentamos un método para detectar los iones producto de LCB y N-molécula de acil simultáneamente en MS3 modo de triple cuadrupolo y espectrometría de masas de trampa iónica lineal cuadrupolo, que facilita la precisión estructural especulación de cada especie de SM6.
Los efectos de la supresión (o mejora) de ion causados por la matriz en muestras biológicas dificultan la exacta cuantificación en el análisis por LC-ESI-MS, y por lo tanto, es deseable para construir curvas de calibración para todos los analitos de interés en la matriz idéntica de la muestra biológica. Sin embargo, esta estrategia no es factible porque es casi imposible preparar todas las especies de SM en muestras biológicas, especialmente en análisis completo. Por lo tanto, es práctico construir una curva de calibración y determinar el rango cuantitativo mediante una especie de SM representante de tacon en las muestras biológicas. Utilizamos dos especies de SM isotópicamente etiquetados para la construcción de una curva de calibración; uno fue utilizado para el estándar interno y el otro de un compuesto estándar. Se detectó una pequeña cantidad de especie SM isotópicamente etiquetada como un compuesto estándar tacon en muestras biológicas y obtuvo con éxito una curva de calibración y la gama cuantitativa6.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>plato de cultivo de tejidos de 100 mm</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>Rascador de células</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>Tubo siliconado de 2,0 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensayo</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de rosca revestido de teflón</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidrio desechable</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 &micro; m 1,5 mm D.I. x 100 mm</td><td>Shiseido</td><td>92223</td><td>El cartucho Guard se inserta en el soporte del cartucho y se conecta a la columna C18</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 mm x 10 mm CARTUCHO DE PROTECCIÓN</td><td>Shiseido</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de cartucho</td><td>Shiseido</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Alcohol Isopropílico)</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28% Agua de amoníaco</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador (tipo baño)</td><td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice para tubo de ensayo de vidrio</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1,4 mL vial de vidrio</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>Las muestras se almacenan en un vial de vidrio de 1,4 ml sellado con tapón de rosca y tabique de 8 mm a -20 °C; C</td></tr><tr><td>Tabique de 8 mm</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>Cuando se analizan las muestras, los tapones de rosca se sustituyen por tapones de rosca con tabique ranurado</td></tr><tr><td>Tapón de rosca para vial de vidrio de 1,4 mm</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de rosca con tabique ranurado</td><td>Shimadzu GLC</td><td>GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0.22 &micro; filtro</td><td>m Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Espectrometría de masas de trampa de iones lineal triple cuadrupolar y cuadrupolar</td><td>SCIEX QTRAP4500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>El software para la adquisición de datos y el análisis de espectros de iones de productos</td><td>SCIEX</td><td>Analyst</td><td></td></tr><tr><td>El software para la integración de datos en el análisis cuantitativo</td><td>Sistema de HPLC SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidrio</td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 esfingomielina</td><td>Avanti Lípidos polares</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>esfingosilfosforilcolina</td><td>Merck</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>26140079</tr><tr><td>L-glutamina</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' s medio esencial mínimo</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

método cuantitativo y cualitativo de la esfingomielina por lc-ms con dos estable isotópicamente etiquetada especies de esfingomielina

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Se presenta un método de analizar la esfingomielina (SM) cualitativamente y cuantitativamente por cromatografía líquido-electrospray ionización-tandem espectrometría de masas (LC-ESI-MS/MS). SM es un sphingolipid común compuesto por una Fosforilcolina y una ceramida como la componente hidrofílico e hidrofóbico, respectivamente. Un número de especies de SM está presente en células de mamífero debido a una variedad en el esfingoide larga cadena base (LCB) y un N-molécula de acil en la ceramida. En este informe, se muestra un método para estimar la cantidad de carbono y de dobles enlaces en un LCB y un N-molécula de acil basado en sus correspondientes iones producto de experimentos de MS/MS/MS (MS3). Además, se presenta un método de análisis cuantitativo de SM utilizando dos estable isotópicamente etiquetada SM especies, lo que facilita determinar el rango utilizado en la cuantificación de SM. El presente método será útil en la caracterización de una variedad de especies de SM en muestras biológicas y productos industriales tales como cosméticos.

Químicamente sintetizados d18:1 / SM (figura 1A) y d18:1 24:0 / 24:0 SM en las muestras de lípidos extraídas de las células HeLa (figura 1B) se analizaron por LC-ESI-MS empleando a3 [M + HCOO]– y [M-CH3]- como iones del precursor de la primera y segunda, respectivamente. Tenga en cuenta que la intensidad del espectro de desmetilado-sphingosylphosphorylc...

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar y calificar cada especie de esfingomielina mediante monitoreo de reacción múltiple y modo MS/MS/MS, respectivamente.

Método cuantitativo y cualitativo de la esfingomielina por LC-MS con dos estable isotópicamente etiquetada especies de esfingomielina

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar con precisión la cantidad y la estructura de cada especie de Sphingomyelin en muestras biológicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los lípidos relacionados con la biología de los lípidos y los lípidos La principal ventaja de esta técnica es que podemos caracterizar una variedad de especies de esfingomielinas en muestras biológicas mediante el sistema de espectrometría de masas por cromatografía. Para comenzar, retire el medio de cultivo de una placa de cultivo de tejido de 10 centímetros que contenga células HeLa y enjuague las células dos veces con seis mililitros de PBS helado.Luego agregue un mililitro de PBS helado en la placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros y use un raspador de células para recolectar las células. Una vez retirados de la superficie del plato, transfiera las células a dos tubos de plástico siliconado de mililitros. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y agregue un mililitro de metanol a cada gránulo de celda.A continuación, vórtice brevemente los tubos. A continuación, coloque las muestras en un sonicador tipo baño y sonique a 200 vatios durante cinco minutos. Cuando termine, transfiera todo el homogeneizado de la célula a tubos de ensayo equipados con tapones de rosca revestidos de teflón.Ahora agregue un mililitro de metanol, un mililitro de cloroformo, 0,8 mililitros de agua destilada doble en 50 microlitros de 10 micromolares de un patrón interno en cada tubo de ensayo. Tape los tubos y pórtexlos vigorosamente a 2.500 rpm durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego agregue un mililitro adicional de cloroformo y un mililitro de agua destilada doble a cada tubo.De nuevo, agite los tubos vigorosamente a 2.500 rpm durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, centrifugar las muestras para separar completamente las fases acuosa y orgánica. Transfiera la fase inferior a tubos de vidrio desechables.Agregue dos mililitros de cloroformo en los tubos de ensayo. A continuación, agite los tubos vigorosamente a 2.500 rpm durante cinco minutos a temperatura ambiente para que se mezclen lo suficiente con la fase superior y la pelusa interfásica. Después de una segunda centrifugación, transfiera la fase inferior modificada a los tubos de vidrio desechables junto con la fase inferior inicial.Ahora coloque los tubos de vidrio bajo un chorro de nitrógeno durante aproximadamente 60 minutos y elimine por completo los disolventes orgánicos en la fase inferior recolectada. Finalmente, reconstituir las muestras con 500 microlitros de metanol o etanol. Filtre la mezcla resultante con un filtro de 0,02 micras en viales de vidrio.A continuación, almacene la muestra a menos 20 grados centígrados. Realice diluciones en serie del compuesto estándar y agregue 50 microlitros de cada concentración en tubos de ensayo separados. A continuación, prepare tres muestras de control de calidad añadiendo una cantidad dentro de tres veces el límite inferior de la curva estándar a la primera muestra, una cantidad cerca del centro de la curva para la segunda muestra y una cantidad cerca del límite superior de la curva estándar para la tercera muestra.A continuación, añada el homogeneizado celular en un mililitro de metanol en cada tubo de ensayo y extraiga la fracción lipídica total de cada muestra utilizando el método que se acaba de mostrar. Para empezar, prepara la fase móvil. Mezcle acetonitrilo, metanol y agua destilada doble en una proporción de dos a dos a uno para la fase acuosa.Use isopropanol para la fase orgánica en botellas de vidrio con tapones de rosca revestidos de teflón. A continuación, sonique ambas fases móviles durante cinco minutos en un sonicador de tipo baño. A continuación, añada ácido fórmico a una concentración final de 26,4 milimolares e hidróxido de amonio a 14,9 milimolares en cada fase móvil.Para el análisis cualitativo, active el sistema de cromatografía líquida de alta resolución. Coloque los tubos de entrada en las botellas de vidrio que contienen las fases móviles y purgue las líneas de HPLC. A continuación, conecte una columna de HPLC C18 al sistema de HPLC.Mantenga la temperatura en el horno de columna a 50 grados centígrados y acondiciona la columna con la fase móvil acuosa a 100 microlitros por minuto. Durante la ejecución, coloque las muestras en un estante de muestras del muestreador automático. Establezca los parámetros del sistema de espectrometría de masas de trampa de iones lineales triple, cuádruple y cuádruple para el análisis de espectrometría de masas en tres etapas, tal como se enumeran en la tabla uno y la tabla dos del protocolo de texto adjunto.Además, establezca los parámetros para el primer y segundo ion precursor de las especies SM de interés, como se describe con más detalle en el protocolo de texto adjunto. Cree un archivo por lotes y envíe el archivo por lotes para obtener los datos de los espectros de iones de tres productos MS de cada especie de esfingomielina mediante cromatografía líquida, electrospray, ionización, análisis de espectrometría de masas en tándem. Obtención de los espectros iónicos trifásicos del producto MS de las especies de esfingomielina de interés mediante cromatografía líquida, electrospray, ionización, análisis de espectrometría de masas en tándem.A continuación, asigne a cada MS tres espectros de iones producto de la esfingomielina comparando la relación masa-carga de los espectros de iones producto en la masa exacta de la base de cadena larga esfingoide y la fracción n-acilo de interés. Analice cuantitativamente la esfingomielina mediante cromatografía líquida, electrospray, ionización, análisis de espectrometría de masas en tándem, como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, procese los datos de monitorización de múltiples reacciones utilizando el software para la integración de datos para obtener los datos del área máxima para el cromatograma iónico extraído de cada especie de esfingomielina.Cuantifique cada especie de esfingomielina y construya las curvas estándar como se describe en el protocolo de texto adjunto. Aquí se muestra el espectro de esfingomielina sintetizada químicamente y esfingomielina en muestras de lípidos extraídas de células HeLa. Cabe destacar que la intensidad del espectro de la esfingosilfosforilcolina desmetilada es mayor que la de la fracción n-acilo SM en ambas muestras.También de interés, el espectro correspondiente a la esfingosina-1-fosfato es útil para especular sobre el número de carbono y dobles enlaces de la base esfingoide de cadena larga de la esfingomielina. En el método cuantitativo actual, es fundamental preparar con precisión las muestras para construir la curva de calibración en la validación de este método. La curva de ajuste de baja concentración mejoró claramente utilizando el factor de ponderación igual a uno sobre x al cuadrado en comparación con la que utiliza el factor de ponderación de uno o uno sobre x.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología y la industria caracterizaran una variedad de especies de esfingomielina en muestras biológicas y productos de la industria como los cosméticos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo analizar con precisión la cantidad y la estructura de cada especie de Sphingomyelin en muestras biológicas. No olvide que trabajar con absorbentes puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de vidrios adecuados, al realizar este procedimiento.Además, es importante usar guantes para evitar la contaminación de los lípidos derivados de las manos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Para probar la interacción de una proteína con su objetivo de lípidos se utilizó MACS y anexina V conjugada con partículas magnéticas y de las vesículas de lípidos sintetizados a partir de los lípidos de destino y fosfatidilserina anexina V vinculante. Proteínas unidas a los lípidos de destino se co-purificados y analizados después de la elución de las cuentas.

Lípidos vesículas mediada por cromatografía de afinidad utilizando magnética clasificación de células activadas (LIMACS): un nuevo método para analizar la interacción de proteínas y lípidos

Este protocolo demostrará la extracción y el análisis de ácidos grasos bioactivos libres y esterificados de las células. Los ácidos grasos se cuantifican con precisión mediante dilución de isótopos estables, cromatografía líquida quiral, captura de electrones, ionización química atmosférica, espectrometría de masas de monitoreo de reacciones múltiples (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

Se presenta un método para el uso de espectrometría de masas MALDI y la química de la metilación reductiva para cuantificar los cambios en la metilación de la lisina.

Aplicación de MassSQUIRM para mediciones cuantitativas de la actividad desmetilasa Lisina

Un método específico y sensible para profundizar en el perfil de expresión de los antígenos de glucoesfingolípidos en órganos y células inmunes se describe. El método se aprovecha de la espectrometría de masas de iones trampa permitiendo paso a paso fragmentación de las moléculas de glucoesfingolípidos para el análisis estructural, en comparación con los estándares de síntesis química.

Análisis espectrométrico de masas de Antígenos glicoesfingolípido

Aquí mostramos plaquetas humanas aisladas se pueden utilizar como un accesible ex vivo modelo para estudiar adaptaciones metabólicas en respuesta al complejo I inhibidor de la rotenona. Este enfoque emplea trazado isotópico y la cuantificación relativa mediante espectrometría de cromatografía de masa líquida y se puede aplicar a una variedad de diseños de estudio.

LC-MS El análisis de las plaquetas humanas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial

Muchas de las (fosfo)lipasas predichas están mal caracterizadas con respecto a sus especificidades de sustrato y funciones fisiológicas. Aquí proporcionamos un protocolo para optimizar las actividades enzimáticas, buscar sustratos naturales y proponer funciones fisiológicas para estas enzimas.

La definición de Sustrato especificidades para la lipasa y la fosfolipasa candidatos

gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.

Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem para identificar y cuantificar los principales lípidos celulares en Saccharomyces cerevisiae. El método descrito para una evaluación cuantitativa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es versátil, robusto y sensible.

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

Aquí, se presenta un protocolo para el etiquetado metabólico de levaduras con ácido 14C-acético, que se combina con cromatografía de capa delgada para la separación de lípidos neutros.

Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada

Los esfingolípidos son metabolitos bioactivos con funciones bien establecidas en la enfermedad humana. La caracterización de alteraciones en tejidos con espectrometría de masas puede revelar roles en la etiología de la enfermedad o identificar objetivos terapéuticos. Sin embargo, el compuesto OCT utilizado para la criopreservación en biorepositorios interfiere con la espectrometría de masas. Describimos métodos para analizar esfingolípidos en tejidos humanos incrustados en OCT con LC-ESI-MS /...

Preparación de tejidos humanos incrustados en un compuesto de temperatura de corte óptima para el análisis de espectrometría de masas

Aquí se presenta un método para el cribado de estructuras lipídicas mediante el marcaje de isótopos estables mediante el uso de su tiempo de retención, movilidad y fragmentación.

Trazabilidad de lípidos de novo mediante el marcaje de isótopos estables LC-TIMS-TOF MS/MS

Aprende a cuantificar y caracterizar especies de esfingomielina en muestras biológicas mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem. Este protocolo utiliza células HeLa y estándares isotópicos para análisis preciso de lípidos.

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Método cuantitativo y cualitativo de la esfingomielina por LC-MS con dos estable isotópicamente etiquetada especies de esfingomielina

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