Método cuantitativo y cualitativo de la esfingomielina por LC-MS con dos estable isotópicamente etiquetada especies de esfingomielina

El objetivo general de este procedimiento es analizar con precisión la cantidad y la estructura de cada especie de Sphingomyelin en muestras biológicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los lípidos relacionados con la biología de los lípidos y los lípidos La principal ventaja de esta técnica es que podemos caracterizar una variedad de especies de esfingomielinas en muestras biológicas mediante el sistema de espectrometría de masas por cromatografía. Para comenzar, retire el medio de cultivo de una placa de cultivo de tejido de 10 centímetros que contenga células HeLa y enjuague las células dos veces con seis mililitros de PBS helado.

Luego agregue un mililitro de PBS helado en la placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros y use un raspador de células para recolectar las células. Una vez retirados de la superficie del plato, transfiera las células a dos tubos de plástico siliconado de mililitros. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y agregue un mililitro de metanol a cada gránulo de celda.

A continuación, vórtice brevemente los tubos. A continuación, coloque las muestras en un sonicador tipo baño y sonique a 200 vatios durante cinco minutos. Cuando termine, transfiera todo el homogeneizado de la célula a tubos de ensayo equipados con tapones de rosca revestidos de teflón.

Ahora agregue un mililitro de metanol, un mililitro de cloroformo, 0,8 mililitros de agua destilada doble en 50 microlitros de 10 micromolares de un patrón interno en cada tubo de ensayo. Tape los tubos y pórtexlos vigorosamente a 2.500 rpm durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego agregue un mililitro adicional de cloroformo y un mililitro de agua destilada doble a cada tubo.

De nuevo, agite los tubos vigorosamente a 2.500 rpm durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, centrifugar las muestras para separar completamente las fases acuosa y orgánica. Transfiera la fase inferior a tubos de vidrio desechables.

Agregue dos mililitros de cloroformo en los tubos de ensayo. A continuación, agite los tubos vigorosamente a 2.500 rpm durante cinco minutos a temperatura ambiente para que se mezclen lo suficiente con la fase superior y la pelusa interfásica. Después de una segunda centrifugación, transfiera la fase inferior modificada a los tubos de vidrio desechables junto con la fase inferior inicial.

Ahora coloque los tubos de vidrio bajo un chorro de nitrógeno durante aproximadamente 60 minutos y elimine por completo los disolventes orgánicos en la fase inferior recolectada. Finalmente, reconstituir las muestras con 500 microlitros de metanol o etanol. Filtre la mezcla resultante con un filtro de 0,02 micras en viales de vidrio.

A continuación, almacene la muestra a menos 20 grados centígrados. Realice diluciones en serie del compuesto estándar y agregue 50 microlitros de cada concentración en tubos de ensayo separados. A continuación, prepare tres muestras de control de calidad añadiendo una cantidad dentro de tres veces el límite inferior de la curva estándar a la primera muestra, una cantidad cerca del centro de la curva para la segunda muestra y una cantidad cerca del límite superior de la curva estándar para la tercera muestra.

A continuación, añada el homogeneizado celular en un mililitro de metanol en cada tubo de ensayo y extraiga la fracción lipídica total de cada muestra utilizando el método que se acaba de mostrar. Para empezar, prepara la fase móvil. Mezcle acetonitrilo, metanol y agua destilada doble en una proporción de dos a dos a uno para la fase acuosa.

Use isopropanol para la fase orgánica en botellas de vidrio con tapones de rosca revestidos de teflón. A continuación, sonique ambas fases móviles durante cinco minutos en un sonicador de tipo baño. A continuación, añada ácido fórmico a una concentración final de 26,4 milimolares e hidróxido de amonio a 14,9 milimolares en cada fase móvil.

Para el análisis cualitativo, active el sistema de cromatografía líquida de alta resolución. Coloque los tubos de entrada en las botellas de vidrio que contienen las fases móviles y purgue las líneas de HPLC. A continuación, conecte una columna de HPLC C18 al sistema de HPLC.

Mantenga la temperatura en el horno de columna a 50 grados centígrados y acondiciona la columna con la fase móvil acuosa a 100 microlitros por minuto. Durante la ejecución, coloque las muestras en un estante de muestras del muestreador automático. Establezca los parámetros del sistema de espectrometría de masas de trampa de iones lineales triple, cuádruple y cuádruple para el análisis de espectrometría de masas en tres etapas, tal como se enumeran en la tabla uno y la tabla dos del protocolo de texto adjunto.

Además, establezca los parámetros para el primer y segundo ion precursor de las especies SM de interés, como se describe con más detalle en el protocolo de texto adjunto. Cree un archivo por lotes y envíe el archivo por lotes para obtener los datos de los espectros de iones de tres productos MS de cada especie de esfingomielina mediante cromatografía líquida, electrospray, ionización, análisis de espectrometría de masas en tándem. Obtención de los espectros iónicos trifásicos del producto MS de las especies de esfingomielina de interés mediante cromatografía líquida, electrospray, ionización, análisis de espectrometría de masas en tándem.

A continuación, asigne a cada MS tres espectros de iones producto de la esfingomielina comparando la relación masa-carga de los espectros de iones producto en la masa exacta de la base de cadena larga esfingoide y la fracción n-acilo de interés. Analice cuantitativamente la esfingomielina mediante cromatografía líquida, electrospray, ionización, análisis de espectrometría de masas en tándem, como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, procese los datos de monitorización de múltiples reacciones utilizando el software para la integración de datos para obtener los datos del área máxima para el cromatograma iónico extraído de cada especie de esfingomielina.

Cuantifique cada especie de esfingomielina y construya las curvas estándar como se describe en el protocolo de texto adjunto. Aquí se muestra el espectro de esfingomielina sintetizada químicamente y esfingomielina en muestras de lípidos extraídas de células HeLa. Cabe destacar que la intensidad del espectro de la esfingosilfosforilcolina desmetilada es mayor que la de la fracción n-acilo SM en ambas muestras.

También de interés, el espectro correspondiente a la esfingosina-1-fosfato es útil para especular sobre el número de carbono y dobles enlaces de la base esfingoide de cadena larga de la esfingomielina. En el método cuantitativo actual, es fundamental preparar con precisión las muestras para construir la curva de calibración en la validación de este método. La curva de ajuste de baja concentración mejoró claramente utilizando el factor de ponderación igual a uno sobre x al cuadrado en comparación con la que utiliza el factor de ponderación de uno o uno sobre x.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología y la industria caracterizaran una variedad de especies de esfingomielina en muestras biológicas y productos de la industria como los cosméticos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo analizar con precisión la cantidad y la estructura de cada especie de Sphingomyelin en muestras biológicas. No olvide que trabajar con absorbentes puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de vidrios adecuados, al realizar este procedimiento.

Además, es importante usar guantes para evitar la contaminación de los lípidos derivados de las manos.