LC-MS El análisis de las plaquetas humanas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial
4 de abril de 2016
Aquí mostramos plaquetas humanas aisladas se pueden utilizar como un accesible ex vivo modelo para estudiar adaptaciones metabólicas en respuesta al complejo I inhibidor de la rotenona. Este enfoque emplea trazado isotópico y la cuantificación relativa mediante espectrometría de cromatografía de masa líquida y se puede aplicar a una variedad de diseños de estudio.
El objetivo general de este procedimiento es determinar cómo un tratamiento con xenobióticos o un estado de enfermedad altera el metabolismo celular. Este método tiene el potencial de revelar cómo un estado de enfermedad o una toxina aplicada afecta el metabolismo celular. Y una vez conocido esto, nuestro método tiene la capacidad de revelar si algún tipo de intervención puede corregir el defecto.
La principal ventaja de esta técnica es que no se basa en líneas celulares transformadas, por lo que es más probable que proporcione respuestas directamente relevantes para la salud humana. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución madre de 10 milimolares de rotenona en dimetilsulfóxido. Realice una dilución en serie de la solución madre de rotenona de 10 milimolares para obtener soluciones con concentraciones de rotenona que van desde un nanomolar hasta 100 micromolares.
A continuación, agregue 50 microlitros de cada solución madre a cinco mililitros de una solución tampón de Tyrode enriquecida previamente preparada para preparar soluciones con concentraciones de rotenona que oscilan entre 10 picomolar y un micromolar. Agregue 50 microlitros de DMSO a una de las muestras de solución tampón para que sirva como control del vehículo. Para aislar las plaquetas de la sangre total, centrifugar las muestras de sangre total a 175 x g durante 15 minutos sin interrupciones.
Cuando termine, transfiera un mililitro de la capa superior de plasma rico en plaquetas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Al transferir el plasma rico en plaquetas, tenga cuidado de no alterar la capa leucocitaria para que la pelusa de plaquetas no se contamine con linfocitos. Centrifugar la capa de plasma rico en plaquetas a 400 x g durante cinco minutos.
A continuación, aspira el supernatent. Usando no menos de tres réplicas biológicas para cada condición, vuelva a suspender la pastilla de plaquetas en un mililitro de cada solución de rotenona previamente preparada. A continuación, incube las plaquetas resuspendidas en una incubadora de dióxido de carbono con camisa de agua ajustada a 95% de humedad y 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante una hora.
En este punto, granule las plaquetas centrifugando las muestras a 3000 x g durante tres minutos. Después de aspirar el supernatent, agregue el patrón interno marcado con isótopos estables apropiado. A continuación, resuspenda las plaquetas en 750 microlitros de ácido tricloroacético al 10% helado.
Pulsa sonicar cada muestra 30 veces con pulsos de 0,5 segundos. Después de la centrifugación, fije las columnas de extracción en fase sólida C18 a un colector de vacío. Acondicionar las columnas con un mililitro de metanol.
Luego, equilibra las columnas con un mililitro de agua destilada doble. Pase el sobrenadante derivado de la muestra a través de las columnas. Al terminar, lavar las columnas con un mililitro de agua.
A continuación, cargue tubos de centrífuga de vidrio de 10 mililitros en el colector de vacío para recoger las fracciones de elución. Eluir las columnas con un mililitro de acetato de amonio de 25 milimolares y metanol. Después de secar el eluido bajo gas nitrógeno, vuelva a suspender los residuos secos en 50 microlitros de ácido 5%5-sulfosalicílico y transfiera las muestras a archivos de HPLC para su análisis.
Como se informó previamente en las células SH-SY5Y, se hipotetiza que los cambios en los niveles relativos de tioésteres de aceil CoA en respuesta a la rotenona son el resultado de la inhibición del complejo uno. En concreto, se produce una disminución dependiente de la dosis de succinil CoA con un aumento simultáneo de beta-hidroxibutiril-CoA, mientras que los niveles de acetil CoA se mantuvieron sin cambios. El análisis de las plaquetas humanas tratadas con rotenona revela resultados altamente consistentes y proporciona un conjunto único de datos experimentales.
Es importante tener en cuenta que esta observación subraya la dependencia mitocondrial de la respuesta a la rotenona porque las plaquetas carecen de núcleo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el rastreo metabólico, para responder a preguntas adicionales, como por ejemplo:¿Cómo afecta este tratamiento o estado de enfermedad a la utilización del sustrato? Si identificamos cambios en los niveles de algún metabolito, ¿por qué está cambiando?
¿Qué pasos del camino se ven afectados y de qué manera? Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar las plaquetas de la sangre completa, realizar el desafío ex-vivo controlado y extraer los tioésteres de aceil CoA para el análisis de LCMS.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este estudio demuestra el uso de plaquetas humanas aisladas como un modelo ex vivo para investigar adaptaciones metabólicas en respuesta al inhibidor del complejo I rotenona. El método emplea trazado isotópico y cromatografía líquida-espectrometría de masas para la cuantificación relativa, lo que lo hace aplicable a diversos diseños de estudio.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Metabolismo celular
- Farmacología
- Relevancia para la salud humana
Antecedentes
- Comprender cómo los xenobióticos afectan el metabolismo celular es fundamental.
- Las plaquetas humanas aisladas proporcionan un modelo más relevante en comparación con líneas celulares transformadas.
- Este enfoque puede ayudar a identificar posibles intervenciones para defectos metabólicos.
- La rotenona se utiliza como inhibidor del complejo I para estudiar cambios metabólicos.
Objetivo del estudio
- Determinar los efectos del tratamiento con xenobióticos en el metabolismo celular.
- Explorar cómo los estados patológicos alteran los procesos metabólicos.
- Evaluar el potencial de intervenciones para corregir defectos metabólicos.
Métodos Utilizados
- Preparación de una solución stock de 10 milimolar de rotenona en dimetilsulfóxido.
- Dilución seriada del stock de rotenona para obtener concentraciones variables.
- Tras marcación isotópica para análisis metabólico.
- Cromatografía líquida-espectrometría de masas para cuantificación.
Resultados principales
- Las plaquetas aisladas modelan eficazmente las respuestas metabólicas a la rotenona.
- El rastreo isotópico revela adaptaciones metabólicas significativas.
- La cromatografía líquida-espectrometría de masas proporciona una cuantificación precisa.
- El método es aplicable a diversos diseños experimentales.
Conclusiones
- Las plaquetas humanas aisladas son un modelo valioso para estudiar el metabolismo.
- Este enfoque puede conducir a descubrimientos sobre los mecanismos de las enfermedades y posibles terapias.
- Estudios futuros pueden ampliar este método para explorar otras vías metabólicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Las plaquetas humanas ofrecen un modelo clínicamente relevante y no transformado para estudiar el metabolismo mitocondrial y los efectos de xenobióticos, abordando las limitaciones de las líneas celulares cancerosas en la investigación metabólica. Esta plataforma permite un análisis reproducible y específico del donante de alteraciones en las vías metabólicas, apoyando la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. La escalabilidad mediante el abastecimiento de bancos de sangre facilita la continuidad traslacional desde el descubrimiento básico hasta estudios preclínicos y clínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas mediante el análisis de las respuestas mitocondriales a inhibidores del complejo I como la rotenona.
- Valor operativo: Proporciona un sistema relevante para humanos que reduce variables de confusión derivadas de la reprogramación metabólica en líneas celulares transformadas.
- Valor predictivo: Apoya la reducción del riesgo biológico mediante la detección consistente de cambios metabólicos compensatorios, como el aumento de la oxidación de ácidos grasos tras la inhibición de la glucólisis.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas mediante LC-MS de tioésteres de acil-CoA, permitiendo la cuantificación relativa y el marcado isotópico para la evaluación de la actividad específica de rutas metabólicas.
- Valor operativo: Proporciona perfiles reproducibles de metabolitos entre réplicas biológicas, facilitando la estandarización de ensayos para campañas de cribado de xenobióticos.
- Escalabilidad: El aislamiento de plaquetas a partir de donantes individuales o bancos de sangre permite la producción escalable de muestras metabólicamente activas para cribado de alto contenido.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta las respuestas plaquetarias ex vivo con las adaptaciones metabólicas in vivo, apoyando la validación preclínica alineada con biomarcadores.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Aclara si los cambios metabólicos observados dependen de las mitocondrias, como lo demuestran las respuestas en plaquetas anucleadas.
- Avance Ajustado al Riesgo: Permite evaluar la eficacia de intervenciones para revertir defectos metabólicos, informando decisiones de avance o interrupción en la optimización de fármacos líderes.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales y la evaluación preclínica, especialmente para compuestos dirigidos a las mitocondrias y moduladores metabólicos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre los efectos de xenobióticos en el metabolismo celular mediante el aislamiento de las respuestas plaquetarias al tratamiento con rotenona dependiente de la dosis.
- Selección: Permite la preparación de plaquetas listas para ensayos destinadas al análisis por LC-MS, obteniendo resultados cuantitativos reproducibles para la selección de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Proporciona la cuantificación relativa de tioésteres de acetil-CoA, succinil-CoA y beta-hidroxibutiril-CoA, lo que permite comparar el flujo metabólico entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se alinea con la continuidad preclínica al modelar adaptaciones metabólicas relevantes para estados patológicos e intervenciones terapéuticas.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo estandarizado de aislamiento de plaquetas y extracción de metabolitos aplicable en múltiples proyectos y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos mediante el uso de un modelo humano fisiológicamente relevante que evita los artefactos de líneas celulares cancerosas.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de aislamiento de plaquetas, estimulación ex vivo y extracción de metabolitos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la detección temprana de deficiencias metabólicas, reduciendo la eliminación en fases tardías debido a toxicidad mitocondrial imprevista.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de compuestos según sus efectos sobre las vías metabólicas fundamentales en un sistema relevante para el ser humano.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de plaquetas, manipulación estéril de células y metabolómica mediante LC-MS/MS.
- Depende del acceso a equipos de centrifugación, manifolds de vacío para extracción en fase sólida y sistemas de HPLC-MS.
- Necesita la estandarización de la preparación de plasma rico en plaquetas y de la administración de rotenona entre laboratorios y donantes.
- Implica consideraciones de adaptación para distintos xenobióticos y esquemas de marcado isotópico.
- Está limitado por la viabilidad plaquetaria ex vivo y la necesidad de procesar inmediatamente tras el aislamiento para mantener la integridad metabólica.
