LC-MS El análisis de las plaquetas humanas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial

El objetivo general de este procedimiento es determinar cómo un tratamiento con xenobióticos o un estado de enfermedad altera el metabolismo celular. Este método tiene el potencial de revelar cómo un estado de enfermedad o una toxina aplicada afecta el metabolismo celular. Y una vez conocido esto, nuestro método tiene la capacidad de revelar si algún tipo de intervención puede corregir el defecto.

La principal ventaja de esta técnica es que no se basa en líneas celulares transformadas, por lo que es más probable que proporcione respuestas directamente relevantes para la salud humana. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución madre de 10 milimolares de rotenona en dimetilsulfóxido. Realice una dilución en serie de la solución madre de rotenona de 10 milimolares para obtener soluciones con concentraciones de rotenona que van desde un nanomolar hasta 100 micromolares.

A continuación, agregue 50 microlitros de cada solución madre a cinco mililitros de una solución tampón de Tyrode enriquecida previamente preparada para preparar soluciones con concentraciones de rotenona que oscilan entre 10 picomolar y un micromolar. Agregue 50 microlitros de DMSO a una de las muestras de solución tampón para que sirva como control del vehículo. Para aislar las plaquetas de la sangre total, centrifugar las muestras de sangre total a 175 x g durante 15 minutos sin interrupciones.

Cuando termine, transfiera un mililitro de la capa superior de plasma rico en plaquetas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Al transferir el plasma rico en plaquetas, tenga cuidado de no alterar la capa leucocitaria para que la pelusa de plaquetas no se contamine con linfocitos. Centrifugar la capa de plasma rico en plaquetas a 400 x g durante cinco minutos.

A continuación, aspira el supernatent. Usando no menos de tres réplicas biológicas para cada condición, vuelva a suspender la pastilla de plaquetas en un mililitro de cada solución de rotenona previamente preparada. A continuación, incube las plaquetas resuspendidas en una incubadora de dióxido de carbono con camisa de agua ajustada a 95% de humedad y 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante una hora.

En este punto, granule las plaquetas centrifugando las muestras a 3000 x g durante tres minutos. Después de aspirar el supernatent, agregue el patrón interno marcado con isótopos estables apropiado. A continuación, resuspenda las plaquetas en 750 microlitros de ácido tricloroacético al 10% helado.

Pulsa sonicar cada muestra 30 veces con pulsos de 0,5 segundos. Después de la centrifugación, fije las columnas de extracción en fase sólida C18 a un colector de vacío. Acondicionar las columnas con un mililitro de metanol.

Luego, equilibra las columnas con un mililitro de agua destilada doble. Pase el sobrenadante derivado de la muestra a través de las columnas. Al terminar, lavar las columnas con un mililitro de agua.

A continuación, cargue tubos de centrífuga de vidrio de 10 mililitros en el colector de vacío para recoger las fracciones de elución. Eluir las columnas con un mililitro de acetato de amonio de 25 milimolares y metanol. Después de secar el eluido bajo gas nitrógeno, vuelva a suspender los residuos secos en 50 microlitros de ácido 5%5-sulfosalicílico y transfiera las muestras a archivos de HPLC para su análisis.

Como se informó previamente en las células SH-SY5Y, se hipotetiza que los cambios en los niveles relativos de tioésteres de aceil CoA en respuesta a la rotenona son el resultado de la inhibición del complejo uno. En concreto, se produce una disminución dependiente de la dosis de succinil CoA con un aumento simultáneo de beta-hidroxibutiril-CoA, mientras que los niveles de acetil CoA se mantuvieron sin cambios. El análisis de las plaquetas humanas tratadas con rotenona revela resultados altamente consistentes y proporciona un conjunto único de datos experimentales.

Es importante tener en cuenta que esta observación subraya la dependencia mitocondrial de la respuesta a la rotenona porque las plaquetas carecen de núcleo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el rastreo metabólico, para responder a preguntas adicionales, como por ejemplo:¿Cómo afecta este tratamiento o estado de enfermedad a la utilización del sustrato? Si identificamos cambios en los niveles de algún metabolito, ¿por qué está cambiando?

¿Qué pasos del camino se ven afectados y de qué manera? Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar las plaquetas de la sangre completa, realizar el desafío ex-vivo controlado y extraer los tioésteres de aceil CoA para el análisis de LCMS.