Fluorescencia de Complementación bimolecular

Este experimento tiene como objetivo definir si dos proteínas interactúan en las células y delinear aspectos de los sitios de esa interacción. Las primeras células se transfectan con construcciones de expresión que codifican las dos proteínas de interés, una de las cuales se fusiona con el extremo final de una proteína fluorescente fragmentada y la otra se fusiona con el extremo C complementario de la proteína fluorescente fragmentada. Después de permitir que las células transfectadas desarrollen una señal fluorescente en cultivo, los complejos de proteínas se visualizan por imágenes e inmunotransferencia.

A continuación, las imágenes recopiladas se exportan a un software de imágenes como Image J Para cuantificar la intensidad de fluorescencia promedio por célula en un experimento controlado, los resultados de BIFC pueden demostrar las interacciones proteína-proteínas y la localización de estos complejos, como los tres dominios SH de la proteína del andamio que se cruzan y el dominio pro rico de PI tres KC dos beta. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la colocalización, la inmunoprecipitación y el fret, es que BFC permite la localización espacializada de interacciones transitorias más débiles en la célula. Y este método no requiere extensos imágenes de posprocesamiento como se ve con el traste.

Este método puede abordar preguntas clave en el área de la transducción de señales, como la interacción de las proteínas DO X e Y y, de ser así, ¿cuáles son los compartimentos específicos en los que se localizan estos complejos en la célula? Por lo general, los recién llegados a este método tendrán dificultades porque no han elegido la configuración adecuada para extraer su biopsia. Proteínas etiquetadas de interés Comience seleccionando uno de los múltiples fluoróforos para las proteínas de fusión BIFC.

Consideremos que los extremos terminales amino y carboxilo de Venus son capaces de formar un complejo a 37 grados Celsius, mientras que los fragmentos Y-F-P-B-I-F-C requieren una preincubación a 30 grados Celsius. Diseñar vectores de expresión para la adición de etiquetas a las proteínas de interés considerando cómo la unión de los fragmentos de BIFC puede afectar la función de las proteínas de interés. Por ejemplo, la familia de RAs, los GTP a están modificados con lípidos en el extremo carboxilado y no se pueden marcar en este extremo sin interrumpir esta modificación.

Realice siempre experimentos piloto para determinar las condiciones de transfección. También monitoree las células mediante microscopía de fluorescencia para identificar un momento óptimo para el desarrollo de la señal. A continuación, realice un análisis de la flor occidental para confirmar la expresión equitativa de los constructos.

Es importante destacar la tinción inmunológica para la etiqueta HA o bandera para verificar que la adición de los fragmentos BIFC no altere la localización celular de las proteínas de interés para cada placa de muestra. 1,3 veces 10 de las cinco células de causa cada una en una placa de materia con fondo de vidrio y dos pocillos de una placa de seis pocillos y permitir que las células se asienten durante la noche en una incubadora a 37 grados centígrados al día siguiente. Preparar el ADN para la transfección mediante lipectomía u otro método preferido.

Primero, diluya el ADN en 250 microlitros de DMEM libre de suero como control de transfección. Agregue CFP a un 50, la cantidad de su total de ADN BIFC. Ahora diluya el labio en 250 microlitros de DMEM libre de suero usando 10 microlitros de labio por un microgramo de ADN.

Mezclar el ADN y las diluciones labiales incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Enjuague las células dos veces con DMEM tibio sin suero. Agregue dos mililitros de DMEM sin suero a cada plato con fondo de vidrio o a un plato de seis pocillos.

Luego, divida cada mezcla de transfección en partes iguales entre un plato con fondo de vidrio y dos pozos de seis. Incubar las células a 37 grados centígrados durante cinco horas. Finalmente, retire el medio de transfección y reemplácelo con un medio DMEM completo más 10% FBS.

Incubar las células durante el tiempo determinado en experimentos piloto para obtener los niveles de expresión necesarios de las proteínas de interés. Examinar las células transfectadas bajo un microscopio epifluorescente para asegurarse de que el control positivo es fluorescente. Enjuague las células tres veces con PBS para obtener imágenes de células vivas.

Coloque las celdas en los medios que carecen de troqueles indicadores. Para la obtención de imágenes de células fijas. Agregue un 2% de formaldehído y colóquelo en hielo durante 10 minutos.

Luego enjuague las células tres veces con PBS ahora cubierto con un mililitro de PBS y almacene en la oscuridad a cuatro grados centígrados, lime inmediatamente las células en el plato de seis pocillos. Para los análisis de Western blot, es importante que todas las células estén preparadas al mismo tiempo para que las células de lisis sean representativas de las células de la imagen. Realice una Western blot para asegurarse de que las proteínas de la etiqueta se expresan en niveles equivalentes.

Al obtener imágenes de células con un microscopio confocal, es importante mantener los ajustes constantes durante todo el experimento para que la fluorescencia sea comparable entre las muestras. Asegúrese de obtener imágenes de celdas individuales en las que los píxeles no estén saturados. Dado que se incluyó CFP como control de transfección, seleccione solo celdas positivas de CFP para el análisis de señales BIFC.

Cuantifique la fluorescencia utilizando un software de procesamiento de imágenes como image J.Abra archivos de imagen en Image J.Go para analizar las mediciones establecidas. Marque las casillas de área y valor medio de gris en el cuadro de mediciones. Tenga en cuenta que en este ejemplo, las imágenes venosas tienen un pseudo color verde y las imágenes CFP, un pseudo color rojo.

Con la herramienta de selección a mano alzada, dibuje un contorno alrededor del borde de toda la celda en el canal CFP dejando este contorno en su lugar. Cambie al canal YFP. Ir a analizar, medir el valor medio de gris refleja la intensidad de fluorescencia media por célula para cada imagen.

Dibuje un círculo en el canal YFP en un área que no contenga una celda. Tome una medida para esta área como fondo. Resta el fondo de cada imagen.

Por último, para calcular la intensidad de fluorescencia media de una población de células, promedie el valor medio del grado menos el fondo de todas las células de las que se obtienen imágenes en una muestra. Lo ideal es cuantificar 60 células en tres experimentos. La intersección de proteínas de andamiaje multidominio regula la supervivencia neuronal a través de la regulación de una nueva clase de clase dos, PI, tres quinasas, PI, tres KC, dos beta, tres dominios SH que interactúan con la región amino terminal rica en prolina de PI, tres KC, dos transfección beta de VN marcados que se cruzan con PI marcados con VC, tres KC, dos KC, dos beta dan como resultado una señal fluorescente en el canal YFP, que es pseudo coloreado verde que indica formación compleja.

El pseudo CFP coloreado aquí en rojo se utiliza como control para marcar las mutaciones de las células transfectadas en el dominio rico en prolina de PI tres KC dos beta, que interrumpen la coprecipitación de la intersección y PI tres KC dos beta disminuyen la señal BIFC. Esta diferencia en la señal de BIFC no se debe a diferencias en la expresión de las proteínas K de tipo salvaje y PA PI tres Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días si se hace correctamente. Al realizar este procedimiento, debe recordar ejecutar los controles adecuados y verificar la expresión de proteínas para asegurarse de que las diferencias en la señal BC se deban a diferencias en la formación de complejos y no a la expresión después de este procedimiento.

Se pueden realizar otras técnicas, como el plasma de superficie en residentes, para responder a preguntas como ¿cuáles son las diferentes afinidades de estos complejos entre sí?