Name: Fluorescencia de Complementación bimolecular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprende a utilizar BiFC para visualizar interacciones proteína-proteína y su localización subcelular en células vivas. Esta técnica permite detectar complejos débiles o transitorios con resolución espacial.

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El ITSN, PI3K C2β-, y el control de vectores utilizados en este protocolo están disponibles a partir de los autores que lo soliciten para fines no comerciales solamente. Los autores desean agradecer al Dr. Chang-Deng, Hu por la amabilidad de prestar asesoramiento y los reactivos utilizados en el establecimiento del protocolo BiFC en el laboratorio O&#39;Bryan. KAW fue apoyado por fondos de la Fundación Jerome Lejeune. Trabajo en el laboratorio O&#39;Bryan es apoyado por subvenciones del NIH (HL090651), DOD (PR080428), la Fundación San Baldrick, y la Fundación Jerome Lejeune.

A. BiFC calibración <ol><li> Elegir un fluoróforo. Hay varios fluoróforos, como YFP y Venus, que funcionan bien como BiFC socios de la fusión (Tabla 1). Extremos amino y carboxi-terminal de Venus son capaces de formar un complejo a 37 ° C, mientras que los fragmentos YFP BiFC requieren un pre-incubación a 30 ° C con el fin de facilitar la formación del fluoróforo 2. Esta incubación a una temperatura baja puede alterar algunos procesos celulares y se debe tomar en cuenta al elegir los fragmentos. Los vectores de la fusión de Venus con el extremo carboxilo de las proteínas están disponibles en Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a> ; seepBiFC-VN173 y pBiFC VC155-), junto con construcciones adicionales para su uso como controles, por ejemplo, <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> y pBiFC bFosVC155-2. Vectores adicionales, incluyendo amino-terminal de vectores de Venus (PFLAG-VN173 y PHA-VC155), están disponibles en la siguiente dirección: <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/ hu1 ~ /</a> . </li><li> Etiqueta de la proteína de interés. Los fragmentos BiFC se funden en los extremos amino o carboxi-terminal de las proteínas candidato. Algunas proteínas no puede permitir que para el etiquetado en los extremos debido a la interrupción de la función de la proteína. Por ejemplo, muchos miembros de la superfamilia Ras de GTPasas son de lípidos modificados en el archivo adjunto carboxi impidiendo así de los fragmentos BiFC en ese extremo. Por lo tanto, es importante tener una idea de cómo la unión de los fragmentos BiFC puede afectar la función de las proteínas de interés. Si no está claro cómo el etiquetado de una proteína que afecta a su función de múltiples combinaciones deben ser probados. Además de los fragmentos BiFC, un péptido se pueden incluir para aumentar la flexibilidad entre el fluoróforo fragmentado y las proteínas candidato. Mientras que los sitios de clonación múltiple (MCS) en los vectores BiFC codificar corta tramos de aminoácidos que pueden proporcionar la suficiente flexibilidad, la RSIAT, KQKVMNH, y enlazadores RPACKIPNDLKQKVMNH han utilizado con éxito en experimentos BiFC 3,9 </li><li> Determinar las condiciones de transfección. Antes de probar varios mutantes, un control de los experimentos se deben realizar unos cuantos. Las dos primeras combinaciones BiFC que debería ser juzgado dos proteínas de tipo salvaje que se sabe que interactúan y un tipo salvaje y mutante que no interactúan. El uso de estas dos combinaciones, diferentes cantidades de ADN y los tiempos de la transfección debe ser probado para determinar las condiciones óptimas para la detección de una señal BiFC de las proteínas candidato. Le sugerimos probar 0.25ug, 0.5ug, 1.0ug de cada construcción BiFC de un solo pozo de una placa de 6 pocillos. El día después de la transfección las células seguimiento por microscopía de fluorescencia para determinar el tiempo óptimo para el desarrollo de la señal. El <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> y pBiFC-bFosVC155 construye dos son útiles los controles positivos en BiFC y están disponibles en Addgene (ver arriba). Además, el análisis de Western blot se debe realizar para confirmar la expresión de la igualdad de las construcciones. Las condiciones deben ser escogidos de tal manera que una señal fluorescente que se observa entre las dos proteínas de tipo salvaje, pero muy poca o ninguna señal de que se observa entre el tipo salvaje y las proteínas mutantes. Por último, lo mejor es mantener la expresión de proteínas lo más baja posible para evitar cualquier interacción no específica. </li><li> Determinar si la adición de los fragmentos BiFC altera la localización de las proteínas de interés. Cada construcción BiFC contiene ya sea un HA o etiqueta de epítopo FLAG. Inmunotinción transefected células, tanto para el HA o etiqueta de epítopo FLAG, así como también la proteína endógena (si es posible) para determinar si la etiqueta BiFC afecta a la localización de las proteínas de interés. </li></ol> B. Revestimiento y transfección de células <ol><li> Las células COS (1.3x10 5) se colocan cada uno en un fondo de la placa de vidrio Matek y dos pocillos de una placa de 6 pocillos por muestra. Permiten a las células reposar toda la noche a 37 ° C. Otros tipos de células que son más relevantes para las proteínas candidatas de interés también puede ser utilizado. </li><li> Prepare las autoridades nacionales designadas para la transfección. Por lo general utilizan Lipofectamine (Invitrogen) para transfecciones COS. Sin embargo, otros reactivos pueden ser más apropiados para la línea celular de interés. Dado que la mezcla de transfección se dividirá entre un plato con fondo de cristal y dos pocillos de una placa de 6 pocillos, use la cantidad apropiada de ADN para dar cuenta de esta división. Diluir el ADN en 250uL de suero libre (SF) DMEM. Añadir PPC a 1 / 5 la cantidad total de ADN BiFC como control de transfección. Para la cuantificación BiFC, sólo las células que son positivas para el PPC será analizada para detectar la presencia de una señal de BiFC. Tenga en cuenta que el espectro de la PPC se solapará con algunos de los pares BiFC en la Tabla 1, por lo tanto un control de transfección alternativotal vez sea necesario. Diluir Lipofectamine en 250uL SF DMEM (10 ul Lipofectamine/1ug de ADN). Mezcla el ADN y las diluciones Lipofectamine. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Nota: El Lipofectamine: relación de ADN puede variar dependiendo del tipo de célula. Utilice el método apropiado para la transfección de la línea celular de interés. </li><li> Enjuague con agua tibia células 2x DMEM SF. Añadir 2 ml de SF DMEM a cada plato con fondo de cristal o bien de un plato de 6 pocillos. </li><li> Dividir cada mezcla de transfección en partes iguales entre un plato con fondo de cristal y dos pozos de una placa de 6 pocillos. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C durante 5h. </li><li> Retire el medio de transfección y reemplazar con los medios de comunicación completo (DMEM +10% FBS). </li><li> Las células se incuban durante la noche a 37 ° C. La longitud de la transfección después de incubación puede variar en función de los niveles de expresión de las proteínas de interés. Incubación prolongado puede resultar en la no interacción específica con lo que este paso tendrá que ser determinada empíricamente. </li></ol> C. Preparación de las células de la Imagen <ol><li> Las células son inicialmente examinados con un microscopio de epifluorescencia para asegurar que el control positivo es fluorescente. Si no, puede ser necesario para dar tiempo a otras células a 37 ° C hasta que la señal que se observa. </li><li> Enjuague las células 3 veces con PBS (pH 7,4). A las células en el plato con fondo de cristal añadir paraformaldehído al 2% (pH 7,4). Fijar las células durante 10 minutos en hielo. Enjuague las células 3 veces con PBS (pH 7,4). Las células se almacenan a 4 ° C cubierto con 1 ml de PBS (pH 7,4). Las células no tienen que ser fijos para las imágenes, pero una vez que los fragmentos de la reforma BiFC un fluoróforo intacta es irreversible lo que impide el análisis de las interacciones dinámicas 3. Además, tenga en cuenta que las células no fijadas continuará desarrollando la señal. Lisis de las células en la placa de 6 pocillos y se preparan lisados ​​de Western blot. Es importante que todas las células están dispuestas en el mismo tiempo para que las células lisadas son representativos de las células de imágenes. </li></ol> D. Las células de imagen <ol><li> La intensidad de la fluorescencia se calculará por celda. Asegúrese de que las células individuales de la imagen. </li><li> PPC se incluyó como un control tranfection y sólo las células positivas PPC son seleccionados para el análisis de las señales de BiFC. Hacemos la suposición de que si la célula es transfectada con la PPC, también es transfectadas con las construcciones BiFC. Este enfoque asegura que las células de imágenes que carecen de una señal de BiFC son negativos debido a la falta de una interacción entre las proteínas de interés, y no debido a la ausencia de uno o dos construcciones de expresión BiFC en esa celda. </li><li> Utilizamos un Zeiss LSM 510 microscopio confocal de imágenes de células. Cuando se usa este microscopio es importante para mantener el zoom, diafragma, ganancia del detector, el amplificador de compensación, tamaño, velocidad de exploración, el promedio de exploración, y la potencia del láser coherente. Al utilizar cualquier sistema de imagen es importante para mantener la configuración constante, de modo que la fluorescencia es comparable entre las muestras. Además, la hora de cuantificar la fluorescencia es importante que los píxeles no están saturados. </li></ol> E. Cuantificación de fluorescencia <ol><li> Fluorescencia puede cuantificarse utilizando cualquier software de imágenes. Utilizamos ImageJ que está disponible gratuitamente desde el NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Abrir archivos de imagen en ImageJ. Ir a mediciones AnalyzeSet. Marque las casillas para el área y el valor medio gris en el cuadro de medidas. </li><li> Utilizando la herramienta de "selección de manos libres", dibujar un contorno alrededor del borde de la célula entera en el canal de la PPC. </li><li> Salir de este esquema en su lugar, el cambio en el canal de YFP. Ir al AnalyzeMeasure. El valor de gris medio es la suma de los valores de gris de todos los píxeles de la selección, dividido por el número de píxeles (es decir, la intensidad media de fluorescencia por área de la célula). </li><li> Para cada imagen dibujar un círculo en el canal de YFP en un área que no contiene una célula. Tomar una medida para esta zona como fondo. Resta el fondo de cada imagen. </li><li> La media del valor medio gris menos los antecedentes de todas las células de imágenes en una muestra. Esta será la intensidad media de fluorescencia para una población de células. Le sugerimos unos 60 células en tres experimentos se cuantificó. </li></ol> F. Representante Resultados: Nuestro laboratorio se centra en el andamio de proteínas con varios dominios, Intersectin (ITSN) que interactúa con numerosas proteínas que regulan múltiples procesos bioquímicos y de señalización 10,11,12,13,14. ITSN contiene dos Eps15 homología (EH) dominios, una región en espiral-espiral y cinco homología Src 3 (SH3) dominios. La isoforma más larga de ITSN también contiene homología Dbl (DH) y pleckstrin homología (PH) dominios que actúan en conjunto como un factor de intercambio de nucleótidos guanina de Cdc42 15. Esta estructura modular promueve la proteína: proteína y hace ITSN un candidato ideal para experimentos BiFC. La localización subcelular de ITSN puede alterar sus socios vinculante y por lo tanto alterar las vías reguladas por ITSN (unpublished de datos). Recientemente, nuestro laboratorio ha demostrado que ITSN regula la supervivencia neuronal a través de la regulación de una novela de PI3K de clase II, PI3K-C2β 11. El amino-terminal pro-rico dominio de la PI3K-C2β contiene dos sitios de unión para SH3 ITSN sus dominios. El uso de co-inmunoprecipitación con ITSN y PI3K-C2β mutantes de truncamiento se demostró que SH3A ITSN y dominios SH3C interactuar con la región amino-terminal de la PI3K-C2β. A continuación, se utiliza para visualizar BiFC la localización subcelular de este complejo. ITSN se fusionó con la amino-terminal de Venus (PFLAG-VN173) y construye PI3K-C2β fusionado con el carboxilo terminal de Venus (PHA-VC155). Como otro control negativo, un péptido no específicos se fusionó con PHA-VC155. VN-ITSN y VC-PI3K C2β formado un complejo BiFC con una distribución de puntuar (Figura 2A, paneles superiores). Las mutaciones en el dominio de Pro-ricos de la PI3K-C2β que interrumpir la co-precipitación de ITSN y PI3K C2β-disminución de la señal BiFC (Figura 2A, paneles inferiores) 11. Esta diferencia en la señal de BiFC entre ITSN y las dos proteínas C2β PI3K-no se debió a diferencias en la expresión de la proteína (Figura 2B). <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> . Figura 1 En BiFC, un fluoróforo (en este caso Venus) se divide en aminoácidos (VN) - y carboxi (VC) termina-terminal. Estos extremos se fusionan dos proteínas de interés. Cuando las dos proteínas interactúan, los fragmentos de VN y VC volver a asociar resultantes de una reconstitución del fluoróforo y la fluorescencia en los sitios de interacción. BiFC es un ejemplo específico de la proteína de ensayo de complementación de fragmentos (PCA) que se utiliza para medir la proteína: las interacciones proteína 5. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. ITSN y PI3K-C2β formar un complejo BiFC. A. VN-etiquetados ITSN fue co-transfectadas con el VC-etiquetados PI3K-C3β WT o un dominio rico en prolina mutante (PI3K-C2β-PA). ITSN y forma PESO PI3K-C2β un complejo (verde). PPC (rojo) se utilizó como control de transfección B. se llevó a cabo un Western blot para demostrar la expresión de la igualdad de las construcciones. El VC-etiquetados construcciones se HA etiquetados. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="Tabla 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabla 1"> Tabla 1. Existen varios vectores que son compatibles con BiFC. YN155: 1-155aa de YFP, YC155: 155 238aa de YFP, YN173: 1-172aa de YFP, YC173, 173-238aa de YFP, VN155: 1-154aa de Venus; VC155: 155-238 de Venus; VN173: 1-172aa de Venus; VC173: 173-238aa de Venus; CN155 1-154aa de la PPC; CC155 155 238aa de la PPC, GN173: 1-172aa de la GFP, CitN155: 1-155aa de citrino, CitC155: 155 238aa de citrino, CitN173: 1-172aa de citrino, CitC173: 173-238aa de citrino, CerN173: 1-172aa de Cerulean 2,3,9.

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</ol>

BiFC es un excelente método para la visualización de proteínas: las interacciones de proteínas en células enteras y la determinación de la localización subcelular de estos complejos. Las ventajas de BiFC es que sólo las proteínas que interactúan son fluorescentes, las interacciones transitorias se han estabilizado, y post-tratamiento de los datos de imagen es mínima. Dos desventajas de este método son el tiempo de maduración para el fluoróforo y la irreversibilidad de la compleja fluoróforo. En algunas aplicaciones de e...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Placas con fondo de vidrio y pocillos pequeños</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-14C</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Falcon BD</td><td>35-3846</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina</td><td>Invitrogen</td><td>18324020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM510 META</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescencia de complementación bimolecular

Bimolecular Fluorescence Complementation

La definición de la distribución subcelular de los complejos de señalización es imprescindible para entender el resultado de ese complejo. Los métodos convencionales, tales como la inmunoprecipitación no proporcionan información sobre la localización espacial de los complejos. Por el contrario, BiFC supervisa la interacción y la compartimentación subcelular de los complejos de proteínas. En este método, una proteína fluororescent se divide en amino-y carboxi-terminal no fluorescente fragmentos que se fusionan dos proteínas de interés. La interacción de los resultados de las proteínas en la reconstitución del fluoróforo (Figura 1) 1,2. Una limitación de BiFC es que una vez que el fluoróforo fragmentada se reconstituye el complejo es irreversible 3. Esta limitación es una ventaja en la detección de interacciones transitorias o débil, pero se opone a un análisis cinético de la compleja dinámica. Una advertencia adicional es que el flourophore reconstituido requiere 30 minutos para madurar y fluorescentes, una vez más se opone a la observación de las interacciones en tiempo real 4. BiFC es un ejemplo específico de la proteína de ensayo de complementación de fragmentos (PCA), que emplea las proteínas reportero como el verde variantes de la proteína fluorescente (BiFC), la dihidrofolato reductasa, b-lactamasa, y luciferasa para medir las proteínas: las interacciones proteína 5,6. Métodos alternativos para el estudio de proteínas: las interacciones de proteínas en las células incluyen fluorescencia co-localización y transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) 7. De co-localización, dos proteínas son etiquetados individualmente, ya sea directamente con un fluoróforo o por inmunofluorescencia indirecta. Sin embargo, este enfoque lleva a un segundo plano alto de la no interacción de proteínas por lo que es difícil de interpretar co-localización de los datos. Además, debido a los límites de la resolución de la microscopía confocal, dos proteínas pueden aparecer co-localizados sin necesidad de interactuar. Con BiFC, la fluorescencia sólo se observa cuando las dos proteínas de interés interactúan. FRET es otro método excelente para el estudio de las proteínas: las interacciones proteína, pero puede ser técnicamente difícil. FRET experimentos requieren el donante y el receptor a ser un brillo similar y la estequiometría de la célula. Además, uno debe tener en cuenta para sangrar a través de los donantes en el canal aceptor y viceversa. A diferencia de FRET, BiFC tiene pocos antecedentes de procesamiento de fluorescencia, poco después de los datos de imagen, no requiere de la sobreexpresión de alta, y puede detectar interacciones débiles o transitoria. Bioluminiscencia la transferencia de energía de resonancia (BRET) es un método similar al FRET salvo que el donante es una enzima (luciferasa, por ejemplo) que cataliza un sustrato para ser bioluminiscentes lo emocionante aceptador. BRET carece de los problemas técnicos de la sangre a través de la fluorescencia de fondo y alto, pero carece de la capacidad de proporcionar la información espacial, debido a la falta de localización del sustrato a compartimentos específicos 8. En general, BiFC es un excelente método para visualizar la localización subcelular de los complejos de proteínas para profundizar en la señalización en compartimientos.

La localización subcelular de las proteínas es importante para determinar la regulación espacio-temporal de la señalización celular. Aquí se describe la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) como un método sencillo para el control de la interacción espacial de las proteínas en la célula.

Fluorescencia de Complementación bimolecular

Definir la distribución subcelular de los complejos de señalización es imperativo para comprender el resultado de dicho complejo. Los métodos convencionales, tales como...

Este experimento tiene como objetivo determinar si dos proteínas interactúan en células y definir aspectos de los sitios de dicha interacción. Primero, las células se transfectan con constructos de expresión que codifican las dos proteínas de interés, una de las cuales se fusiona al extremo terminal de una proteína fluorescente fragmentada y la otra se fusiona al extremo C complementario de la proteína fluorescente fragmentada. Después de permitir que las células transfectadas desarrollen la señal fluorescente en cultivo, los complejos proteicos se visualizan mediante imágenes y inmunotransferencia.A continuación, las imágenes recopiladas se exportan a software de análisis de imágenes, como Image J, con el fin de cuantificar la intensidad media de fluorescencia por célula. En un experimento controlado, los resultados de BIFC pueden demostrar interacciones proteína-proteína y la localización de estos complejos, como los dominios SH tres de la proteína de andamiaje intersectina y el dominio rico en prolina de PI tres KC dos beta. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la colocalización, la inmunoprecipitación y el FRET, es que BIFC permite la localización espacial de interacciones débiles y transitorias dentro de la célula. Además, este método no requiere un procesamiento extenso de las imágenes posteriores, como ocurre con el FRET.Este método puede abordar preguntas clave en el área de la transducción de señales, como si las proteínas X e Y interactúan, y en caso afirmativo, cuáles son los compartimentos específicos a los que se localizan estos complejos en la célula. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no han elegido la configuración adecuada para expresar su biopsia. Proteínas diana marcadas Comience seleccionando uno de los múltiples fluoróforos para las proteínas de fusión BIFC.Considere que los extremos amino y carboxilo de Venus son capaces de formar un complejo a 37 grados Celsius, mientras que los fragmentos Y-F-P-B-I-F-C requieren una preincubación a 30 grados Celsius. Diseñe vectores de expresión para la adición de etiquetas a las proteínas de interés considerando cómo la unión de los fragmentos BIFC podría afectar la función de las proteínas de interés. Por ejemplo, la familia de las RAs, las GTP asas están modificadas por lípidos en el extremo carboxilo y no pueden etiquetarse en este extremo sin interrumpir dicha modificación.Realice siempre experimentos piloto para determinar las condiciones de transfección. Además, supervise las células mediante microscopía de fluorescencia para identificar un momento óptimo para el desarrollo de la señal. Luego, realice un análisis western blot para confirmar la expresión equitativa de los constructos.Es importante realizar una inmunotinción para la etiqueta HA o flag para verificar que la adición de los fragmentos BIFC no altere la localización celular de las proteínas de interés en cada placa de muestra. Inocular 1,3 × 10⁵ células en cada una de las placas con fondo de vidrio y en dos pocillos de una placa de seis pocillos y dejar que las células se asienten durante la noche en un incubador a 37 grados Celsius. Al día siguiente, preparar el ADN para la transfección mediante lipofección o cualquier otro método preferido.Primero, diluya el ADN en 250 microlitros de DMEM sin suero como control de transfección. Añada CFP en una relación de uno a cincuenta, respecto a la cantidad total de ADNs BIFC. Ahora, diluya el lip en 250 microlitros de DMEM sin suero, utilizando 10 microlitros de lip por cada microgramo de ADN.Mezcle las diluciones de ADN y lip, incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Enjuague las células dos veces con DMEM sin suero tibio. Añada dos mililitros de DMEM sin suero a cada placa con fondo de vidrio o pocillo de una placa de seis pocillos.Luego, divida cada mezcla de transfección por igual entre un platillo con fondo de vidrio y dos pocillos de una placa de seis pocillos; incube las células a 37 grados Celsius durante cinco horas. Finalmente, retire el medio de transfección y sustitúyalo por medio DMEM completo más medio con 10 % de FBS.Incube las células durante el tiempo determinado en experimentos piloto para obtener los niveles necesarios de expresión de las proteínas de interés. Examine las células transfectadas bajo un microscopio epifluorescente para asegurarse de que el control positivo sea fluorescente. Enjuague las células tres veces con PBS para la obtención de imágenes de células vivas.Coloque las células en medio sin colorantes indicadores. Para la obtención de imágenes de células fijadas, agregue paraformaldehído al 2 % y coloque en hielo durante 10 minutos.Luego, lave las células tres veces con PBS, ahora cubierto con un mililitro de PBS, y almacénelo en la oscuridad a cuatro grados Celsius; lise inmediatamente las células en la placa de seis pocillos. Para los análisis de inmunotransferencia, es importante que todas las células se preparen al mismo tiempo, de modo que las células lisadas sean representativas de las células de la imagen. Realice una inmunotransferencia para asegurar que las proteínas marcadas se expresen a niveles equivalentes.Al obtener imágenes de células con un microscopio confocal, es importante mantener constantes los ajustes durante todo el experimento para que la fluorescencia sea comparable entre muestras. Asegúrese de obtener imágenes de células individuales en las que los píxeles no estén saturados. Dado que se incluyó CFP como control de transfección, seleccione únicamente células positivas para CFP para el análisis de las señales BIFC.Cuantifique la fluorescencia utilizando un software de imágenes como ImageJ. Abra los archivos de imagen en ImageJ. Vaya a Analizar y establezca las mediciones. Marque las casillas de área y valor medio de escala de grises en el cuadro de mediciones. Tenga en cuenta que, en este ejemplo, las imágenes venosas se han coloreado artificialmente de verde y las imágenes de CFP, de rojo.Utilizando la herramienta de selección a mano alzada, dibuje un contorno alrededor del borde de toda la célula en el canal CFP, dejando este contorno en su lugar. Cambie al canal YFP. Vaya a analizar y mida el valor medio de gris, que refleja la intensidad media de fluorescencia por célula para cada imagen.Dibuje un círculo en el canal YFP en un área que no contenga una célula. Tome una medición de esta área como fondo. Reste el fondo de cada imagen.Finalmente, para calcular la intensidad media de fluorescencia en una población de células, promedie el valor medio del grado menos el fondo para todas las células capturadas en una muestra. Idealmente, cuantifique 60 células a lo largo de tres experimentos. La proteína de andamiaje multifuncional intersectina regula la supervivencia neuronal mediante la regulación de una nueva clase dos de fosfatidilinositol tres quinasa, PI3K-C2β. Los dominios SH3 de intersectina interactúan con la región rica en prolina del extremo amino terminal de PI3K-C2β. La transfección de intersectina marcada con VN junto con PI3K-C2β marcada con VC da como resultado una señal fluorescente en el canal YFP, que se colorea artificialmente de verde, indicando la formación del complejo.El CFP, pseudocoloreado aquí en rojo, se utiliza como control para marcar las células transfectadas. Las mutaciones en el dominio rico en prolina de PI tres KC dos beta, que interrumpen la coprecipitación de intersectina y PI tres KC dos beta, reducen la señal de BIFC. Esta diferencia en la señal de BIFC no se debe a diferencias en la expresión de las proteínas de tipo silvestre y PA PI tres K. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres días si se lleva a cabo correctamente. Al realizar este procedimiento, debe recordar ejecutar los controles adecuados y verificar la expresión de las proteínas para asegurarse de que las diferencias en la señal de BC se deban a diferencias en la formación del complejo y no a la expresión tras seguir este procedimiento.Otras técnicas, como el plasma de superficie en residentes, se pueden realizar para responder preguntas como: ¿cuáles son las diferentes afinidades de estos complejos entre sí?

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Biología

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Análisis citométrico de flujo de Complementación fluorescencia bimolecular proporciona un método cuantitativo de alto rendimiento para estudiar la interacción proteína-proteína. Esta metodología se puede aplicar a los sitios de unión de proteínas y de mapeo para los factores que regulan la interacción proteína-proteína de cribado.

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Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

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Las interacciones proteína-proteína se visualizan en células con resolución espacial nanométrica mediante la combinación de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) con microscopía de localización fotoactivada (PALM). Aquí se describe el uso de BiFC-PALM para obtener imágenes de las interacciones Ras-Raf en células U2OS para visualizar la agrupación y difusión a nanoescala de complejos Ras-Raf individuales.

Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

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Disección señalización complejos por purificación de la afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP)

Este protocolo describe caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro); un método basado en la proyección de imagen que se puede utilizar para visualizar la proximidad inducida de las caspasas de iniciador, que es el primer paso para su activación.

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Aprende a utilizar BiFC para visualizar interacciones proteína-proteína y su localización subcelular en células vivas. Esta técnica permite detectar complejos débiles o transitorios con resolución espacial.

Fluorescencia de Complementación bimolecular

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