Alta sensibilidad detección de micrometástasis de GFP Lentivirus-transduced organitas cultivados de un Tumor de Colon paciente derivado

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología tumoral sobre las micrometástasis encontradas en pacientes con cáncer de colon. La principal ventaja de esta técnica es que permite la detección altamente sensible con micrometástasis inducidas por organoides de cáncer de colon marcados con GFP y derivados del paciente en ratones. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque puede ser difícil detectar micrometástasis derivadas de organoides tumorales de colon en órganos distantes en ratones.

Demostrando el procedimiento con Yu Okazawa estarán Kosuke Mizukoshi y Yu Koyama, ambos estudiantes de doctorado y cirujanos de mi grupo. Para generar organoides de células de cáncer colorrectal humano, primero agregue 150 microlitros de matriz extracelular artificial por pocillo a una placa de 12 pocillos en hielo. Cuando se hayan cubierto todos los pocillos, incube la placa durante 30 a 60 minutos en una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de CO2 para solidificar los geles.

A continuación, vuelva a suspender un pellet de células de xenoinjerto tumoral derivado del paciente en un medio de cultivo fresco de organoides de cáncer colorrectal suplementado con suero de ternera fetal al 5%, o FCS, para lograr una concentración de tres veces 10 a cinco células por mililitro, y siembre un mililitro de células en cada matriz extracelular artificial. Luego, devuelva las células a la incubadora de cultivo celular. A la mañana siguiente, transfiera cuidadosamente los sobrenadantes del cultivo, incluidas las células flotantes, a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para su centrifugación, y vuelva a suspender los gránulos en 70 microlitros de matriz extracelular artificial fresca en hielo.

Para aumentar la viabilidad de las células de cáncer colorrectal, superponga la célula tumoral flotante que contiene matriz extracelular artificial a los pocillos recubiertos de matriz extracelular artificial e incube los cultivos de células tumorales durante 30 minutos en la incubadora de cultivos celulares. Cuando el nuevo gel de matriz extracelular se haya solidificado, alimente los cultivos con un mililitro de medio fresco de cultivo de organoides de cáncer colorrectal suplementado con 1% de FCS y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular. Después de siete a 10 días de cultivo, separe los organoides mecánicamente con un raspador de células estéril y transfiera los organoides a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para su centrifugación.

Luego, vuelva a suspender los gránulos en 500 microlitros de PBS con golpecitos suaves para otra centrifugación. Para disociar los organoides del cáncer colorrectal, agregue 500 microlitros de solución de enzimas proteolíticas y colagenolíticas a los tubos y mezcle con golpecitos suaves. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, agregue 500 microlitros de medio suplementado con 1% de FBS a las células, y pipetee muy suavemente la suspensión celular varias veces para romper los organoides.

El pipeteo suave de los organoides del CCR humano durante el procesamiento es fundamental para mantener una formación de esferoides intacta en el cultivo. Vuelva a centrifugar las células y vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de caldo de lentivirus 5X GFP y 400 microlitros de medio de cultivo de organoides frescos para cáncer colorrectal. Es esencial infectar los organoides del CCR humano con un alto título de lentivirus GFP, especialmente para lograr una infección de casi el 100% del CCR.

Ajuste el volumen de cada tubo para lograr un cinco por 10 por cinco células tumorales disociadas por 500 microlitros de concentración media, y coloque 500 microlitros de células en cada pocillo de una placa de 12 pocillos recubierta de matriz extracelular artificial, como se demuestra. Después de 18 horas en la incubadora de cultivos celulares, transfiera los sobrenadantes flotantes que contienen células a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros para la centrifugación, seguida de la resuspensión de los gránulos en 70 microlitros de matriz extracelular artificial por tubo en hielo. Para mejorar la viabilidad de las células de cáncer colorrectal, superponga la matriz extracelular artificial que contiene células tumorales sobre los organoides tumorales en la placa de 12 pocillos y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 30 minutos.

Cuando el recubrimiento de la matriz extracelular artificial se haya solidificado, alimente los cultivos con un mililitro de medio de cultivo de organoides CRC fresco suplementado con 1% de FCS y devuelva las células a la incubadora de cultivos celulares durante tres días. Luego, observe las células infectadas mediante microscopía de fluorescencia para confirmar una positividad de casi el 100% de GFP y devuelva las células a la incubadora durante otros cuatro a seis días. Para establecer un modelo de ratón con metástasis espontánea de xenoinjertos tumorales derivados de pacientes con CCR, se disociaron los organoides marcados con GFP como se demostró y se diluyeron las suspensiones de células tumorales individuales a una tasa de cinco veces 10 a las cinco células tumorales por cada 50 microlitros de PBS suplementado con una concentración de matriz extracelular artificial al 50%.

Cargue 50 microlitros de células por ratón en una jeringa equipada con una aguja de calibre 22 y coloque las células tumorales en hielo. A continuación, confirme la falta de respuesta al pinzamiento de los dedos del pie y coloque el primer ratón NOG anestesiado en posición supina en la mesa de laboratorio. Con pinzas estériles, extraiga suavemente la mucosa rectal del ano e inyecte inmediatamente las células tumorales en la submucosa rectal.

Para establecer un modelo experimental de metástasis de xenoinjertos tumorales derivados de pacientes con CCR, se diluyen las suspensiones de células tumorales individuales a una concentración de cuatro veces 10 por cada 50 microlitros de células y se cargan 50 microlitros de células por ratón en una jeringa equipada con una aguja de calibre 22. Coloque el primer ratón NOG anestesiado en posición prona en el banco y haga una pequeña incisión en la región inferior del flanco izquierdo. Use tijeras y pinzas estériles para cortar cuidadosamente el peritoneo y exponer el bazo, y use las pinzas para agarrar la grasa adherida al bazo.

Luego, inyecte lentamente 50 microlitros de la suspensión de células tumorales en el bazo, teniendo cuidado de que no se observen fugas. Después de que todos los ratones hayan sido inyectados y suturados según sea necesario, regrese a los animales a sus jaulas domésticas y verifique si hay fugas de sutura y viabilidad un día después de la entrega de células tumorales. Utilice calibradores para medir los tumores semanalmente, recolectando los tumores primarios y los tejidos relevantes hasta los criterios de valoración experimentales adecuados.

Transfiera los tumores y órganos disecados a cinco mililitros de PBS helado en una placa de Petri de 10 centímetros sobre hielo, y observe los tejidos disecados bajo un microscopio de fluorescencia estereoscópica para evaluar su expresión de GFP. La infección por lentivirus GFP por CCR, como se ha demostrado, da lugar a que casi todos los organoides expresen GFP muy brillante. La inyección ortotópica e intraesplénica de los organoides marcados con GFP en ratones NOG receptores secundarios revela la formación de tumores primarios positivos para GFP en el sitio ortotópico, así como en los pulmones de la mayoría de los ratones examinados a los 2,5 meses después de la inyección.

Además, se observan metástasis hepáticas en animales receptores de NOG un mes después de la inyección intraesplénica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar micrometástasis de organoides de células de cáncer colorrectal humano marcados con GFP después de su introducción en ratones receptores. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la eficiencia de localización del tumor y la metástasis de los organoides de células de cáncer de colon humano en ratones depende en gran medida de la variabilidad entre pacientes de las células tumorales originales.