Uso práctico de ARN de interferencia: administración Oral de ARN bicatenario en liposomas portadores para las cucarachas

El objetivo general de este protocolo es agotar la expresión génica en el intestino de las cucarachas mediante la interferencia de ARN a través de la ingestión oral de ARN bicatenario encapsulado en portadores de liposomas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el desarrollo de nuevos métodos de control de plagas, como ¿puede matar las plagas derribar genes esenciales en campo abierto? La principal ventaja de esta técnica es que el liposoma protege el ARN bicatenario específico del gen para asegurar su entrega a la célula diana.

Los encargados de demostrar el procedimiento serán Jia-Hsin Huang, un postdoctorado, y Yun Liu, un técnico de mi laboratorio. Para empezar, anestesia a las cucarachas en hielo hasta que no se muevan durante tres minutos. Luego, levanta un insecto con el pulgar y el índice para acceder a su lado ventral.

A continuación, use tijeras de disección para cortar la punta de una coxa de una pata trasera entre la coxa y el trocánter. El corte en otras partes de la coxa es menos eficiente para las colecciones de hemolinfa. A continuación, coloque una micropipeta de 10 microlitros en la incisión y apriete suavemente el abdomen mientras extrae la hemolinfa sangrante.

Repita este proceso hasta que la hemolinfa de cinco cucarachas se haya recogido en un solo tubo de microcentrífuga. A continuación, gire brevemente la hemolinfa acumulada durante 10 segundos. Luego, combine 10 microlitros de hemolinfa con 50 microlitros de 1x tampón salino para insectos.

Ahora, centrifuga la hemolinfa diluida durante 10 minutos para sacar los hemocitos de la solución. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. Por último, cuantifique la concentración total de proteína utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen y ajuste la concentración de cada muestra a seis miligramos de proteína por microlitro.

Para recolectar el jugo del intestino medio, primero, anestesia a las cucarachas en hielo. Luego, transfiera uno a una placa de disección cargada con 1x tampón de solución salina para insectos frío y use alfileres para insectos para asegurarlo con el lado ventral hacia arriba. Ahora, disecciona el abdomen con pinzas finas.

Luego, retire todo el intestino y transfiéralo a un plato fresco con 1x tampón salino de insectos. A continuación, aísle el intestino medio, que es la región entre el cultivo y los túbulos de Malpighi. Para ello, retira la parte delantera del animal y retira el intestino posterior.

A continuación, transfiera rápidamente el intestino medio a un tubo de microcentrífuga con 100 microlitros de tampón salino para insectos. Recoge las tripas medias de seis cucarachas en el mismo tubo. Luego, agita el tubo durante 10 segundos.

A continuación, centrifuga la mezcla durante 10 minutos para separar los hemocitos y los tejidos intestinales. Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio y ajuste la concentración a seis miligramos de proteína por microlitro. Los lipoplex de ARN bicatenario deben usarse dentro de una hora de la preparación.

Durante su preparación, asegúrese de combinar todo el reactivo diluido con el ARN bicatenario diluido al mismo tiempo. Luego, vórtice rápidamente e incube la mezcla. Una vez listo, mezcle cuatro microlitros de la solución de ARN bicatenario con 10 microlitros de tampón salino de insectos como control, o mezcle con 10 microlitros de enzimas extraídas de la hemolinfa o del jugo del intestino medio.

A continuación, realice un control inhibido por enzimas añadiendo dos microlitros de EGTA. De lo contrario, agregue dos microlitros de agua libre de RNasa. Luego, incube las muestras durante una hora o más a 25 grados centígrados.

Después de la incubación, agregue 200 microlitros de reactivo de extracción y 40 microlitros de cloroformo, y luego vórtice. A continuación, centrifuga las muestras durante 10 minutos. A continuación, transfiera 150 microlitros de cada sobrenadante a un nuevo tubo y precipite el ARN bicatenario de cada muestra añadiendo 150 microlitros de isopropanol e incubando las muestras en hielo durante 15 minutos.

Después de la incubación, vuelva a centrifugar las muestras y deseche el sobrenadante. A continuación, lave los gránulos de ARN dos veces añadiendo 200 microlitros de etanol al 70% a cada gránulo y centrifugando el tubo. Después del segundo lavado, seque los gránulos de ARN bicatenario con un concentrador de vacío centrífugo durante tres minutos.

A continuación, vuelva a suspender los pellets en 10 microlitros de agua libre de RNasa. Por último, compruebe la integridad del ARN bicatenario tratado con un gel de agarosa al 1,5%. Alimenta a las cucarachas dos veces al día, una hora después de que se enciendan las luces y una hora antes de que se apaguen.

Hazlo durante ocho o 16 días sin descansos. Durante este tiempo, las cucarachas deben estar hambrientas de agua. Para la alimentación, tiene disponibles lipoplex de ARN bicatenario recién preparados y ARN bicatenario desnudo.

Para el bolo, úselo con cuatro microlitros de lipoplex de ARN bicatenario o 250 nanogramos de ARN bicatenario desnudo. Para alimentar a una cucaracha, primero, agárrala por las alas con pinzas flexibles. No agarre las partes del cuerpo de una cucaracha.

Luego, pipetea lentamente la gota de solución cerca de las piezas bucales y observa cómo la cucaracha ingiere la gota. Después de la última alimentación, proporcione botellas de agua a las cucarachas. A lo largo del período de alimentación, evalúe los insectos diariamente para verificar la mortalidad y eliminar las cucarachas que ya no se muevan del experimento.

La administración oral continua de lipoplexes de doble cadena fue capaz de disminuir la expresión de tubulina en el intestino medio del 40% en el día nueve al 60% en el día 17. En comparación, el ARN bicatenario desnudo no tuvo ningún efecto. Lo más probable es que esto se deba al hallazgo de que la exposición del ARN bicatenario desnudo al jugo del intestino medio resultó en la degradación en una hora, mientras que el ARN bicatenario conjugado con liposomas permaneció estable.

No solo disminuyeron los niveles de ARN, sino que la alimentación continua de los lipoplexes de ARN bicatenario de tubulina también resultó en una letalidad significativa. Es poco probable que esto se deba al vector, ya que los lipoplex que transportan ARN bicatenario al EGFP no resultaron letales. Al intentar este sistema de administración oral de ARN de interferencia, es importante realizar una alimentación continua de ARN bicatenario durante varios días.

Una vez dominado, el paso de alimentación se puede realizar en dos minutos por insecto si se realiza correctamente. Si es necesario, se pueden aplicar diferentes formulaciones de nanopartículas de liposomas para mejorar el procedimiento de alimentación y la eficiencia del ARNi. En última instancia, esta técnica ha hecho posible que los investigadores en el campo del manejo de plagas exploren nuevas estrategias de control utilizando ARNi.