Name: Uso práctico de ARN de interferencia: administración Oral de ARN bicatenario en liposomas portadores para las cucarachas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a administrar ARN bicatenario encapsulado en liposomas por vía oral en cucarachas para silenciar genes en el intestino medio. Este método ofrece nuevas estrategias de control de plagas eficaces.

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Este estudio fue apoyado por becas de Taiwán (Ministerio de ciencia y tecnología, más 100-2923-B-002-002-MY3 y 106-2313-B-002-011-MY3 a H.J.L.), la República Checa (concesión Agencia de Bohemia del sur Universidad, GAJU conceder 065/2017/P a Y.H.L) y España ( Ministerio de economía y competitividad, concede CGL2012-36251 y CGL2015-64727-P a Saintines y el gobierno catalán, la concesión 2014 SGR 619 a Saintines); también recibió la ayuda financiera del Fondo Europeo para el desarrollo económico y Regional (fondos FEDER a Saintines).

1. síntesis y preparación de dsRNA
<ol><li>Identificar los sitios de destino de dsARN en el 3' región sin traducir de los genes diana. El dsTub se utiliza para apuntar el gen de la α-tubulina (tub) (GenBank número de accesión: KX228233), y dsEGFP como un control negativo de dsARN se diseña de la secuencia de la proteína de fluorescencia verde (EGFP; GenBank número de accesión: LC311024).</li>
	<li>Realizar la amplificación por PCR estándar para sintetizar las plantillas de dsRNA con cartillas gene-específicas que contenga la secuencia de promotor de T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). La cartilla información utilizado y las condiciones de amplificación de PCR son las reportadas por Lin et al. (2017) 12 (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Proceder con la preparación de dsRNA utilizando una transcripción T7 Kit (véase Tabla de materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante. Nota: Para producir alta cantidad dsRNA, mezclar dos reacciones en un tubo (en total 40 μL) e incube a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Añadir 2 μl de DNasa (véase Tabla de materiales) en muestras de dsRNA durante 15 min a 37 ° C a plantillas de la DNA de digerir.</li>
	<li>Añadir 200 μL de reactivo de extracción (véase Tabla de materiales) y cloroformo de 40 μl, y vortex.</li>
	<li>Centrifugar durante 10 min a 13.000 x g a 4 ° C, y luego recoger sobrenadante (150 μL) en un nuevo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Precipitar el dsRNA agregando 150 de μl isopropanol y incubar durante 15 minutos en hielo.</li>
	<li>Centrifugar durante 15 min a 13.000 x g a 4 ° C, luego retire el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 200 μL de etanol 70% para lavar dsARN pellets. Centrifugar 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Eliminar el etanol y repita los pasos de lavado del etanol.</li>
	<li>Eliminar el etanol y el dsRNA seco pellet por concentradores de vacío centrífugos durante 3 min., luego resuspender dsRNA con agua libre de ARNasa.</li>
	<li>Determinar la cantidad del dsRNA purificada usando un espectrofotómetro de UV-Vis de micro-volumen (véase Tabla de materiales) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y ajustar a la concentración deseada (p. ej., 0,25 μg/μl para la preparación de dsRNA lipoplexes).</li>
	<li>Almacenar las muestras de dsRNA a-20 ° C hasta por 3 meses.</li>
</ol>2. preparación de dsARN Lipoplexes
<ol><li>Diluir 4 μL del reactivo de transfección (véase Tabla de materiales) al añadir 4 μL de solución de glucosa 5%. Diluir 4 μL de dsRNA (1 μg) al añadir 4 μL de solución de glucosa 5%.</li>
	<li>Añadir la solución de reactivo de liposomas diluido inmediatamente en la solución de dsRNA diluido todos a la vez. Vortex para mezclar e incubar por 15 min a 25 ° C. Nota: No mezcle las soluciones en el orden inverso.</li>
	<li>El dsRNA lipoplexes están listas para usarse. Use dentro de 1 hora de preparación y desechar después de 1 hora. Nota: Según las instrucciones del fabricante, los lipoplexes debe usarse tan pronto como sea posible.</li>
</ol>3. colección de enzimas extracelulares de hemolinfa y jugo del Midgut
<ol><li>
Tampón salino insectos (stock de x 10)
	<ol>
<li>Mezclar 900 mL de agua bidestilada con 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g CaCl2y 8,3 g MgCl2·6H2O.</li>
		<li>Ajustar el pH a 6.8 y completar hasta 1.000 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colección de hemolinfa
	<ol>
<li>Anestesiar las cucarachas en el hielo hasta que no se muevan durante 3 minutos.</li>
		<li>Sostenga la cucaracha con dos dedos (índice y pulgar) y subir el lado ventral de la cucaracha.</li>
		<li>Utilizar la tijera de disección para corte frente a la punta de la cadera de una pata trasera. Nota: Cortar la intersección conectada entre la coxa y trocánter. La supresión de la otra parte de la cadera era menos eficiente para recoger la hemolinfa.</li>
		<li>Apriete el abdomen suavemente con el dedo medio y recoger la hemolinfa sangrado de la incisión con una micropipeta 10 μl.</li>
		<li>Piscina de la hemolinfa de varias cucarachas (5 individuos) en un tubo de microcentrífuga. Nota: Mantenga los tubos de microcentrífuga en hielo para evitar melanization. El volumen promedio de hemolinfa de una cucaracha macho es 2-3 μl.</li>
		<li>Girar por la hemolinfa brevemente con una centrífuga de mesa para 10 s.</li>
		<li>Transferir el volumen de hemolinfa (es decir, 10 μl) y mezclar con 50 μl de tampón salino insectos de 1 x.</li>
		<li>Centrifugar 10 min a 1.000 x g a 4 ° C para girar por hemocitos. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio.</li>
		<li>Cuantificar la concentración de proteína total utilizando un espectrofotómetro de UV-Vis de micro volumen midiendo A28015.</li>
		<li>Ajustar cada muestra para tener la misma concentración de proteína (6 mg/μl de proteínas totales).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colección de jugo del midgut
	<ol>
<li>Anestesiar las cucarachas en el hielo. Arreglar las cucarachas lado ventral de la placa de disección con tampón salino insecto frío 1 x usando pernos de insectos.</li>
		<li>Diseccionar el abdomen con una pinza fina. Quitar la tripa entera (incluyendo el intestino delantero, mediados, anteriores y posteriores) a un plato fresco con 1 x buffer salina insectos.</li>
		<li>Retire el intestino delantero y trasero y transferir rápidamente el midgut en un tubo de microcentrífuga que contiene 100 μl de tampón salino de insectos.</li>
		<li>Piscina midguts de seis cucarachas en el mismo tubo y el vortex por 10 s.</li>
		<li>Centrifugar 10 min a 1.000 x g a 4 ° C para girar por los hemocitos y los tejidos del intestino. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio.</li>
		<li>Cuantificar la concentración de proteína total utilizando un espectrofotómetro de UV-Vis de micro volumen midiendo A28015.</li>
		<li>Ajustar cada muestra para tener la misma concentración de proteína (6 mg/μl de proteínas totales).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis de la degradación de dsRNA
<ol><li>Recién preparar 4 μL de dsARN desnuda o dsRNA lipoplexes (1 μg).</li>
	<li>Mezcla de enzimas de soluciones con 10 μl de tampón salino insectos (control), extraídas de dsRNA de hemolinfa o midgut jugo.</li>
	<li>Añadir 2 μl de EGTA (20 mM) o agua libre de ARNasa para separar las muestras como los controles para la inhibición de actividades enzimáticas.</li>
	<li>Incubar durante 1 hora o más (6, 12 o 24 horas) a 25 ° C.</li>
	<li>Añadir 200 μL de reactivo de extracción y 40 μl cloroformo, entonces el vórtice.</li>
	<li>Centrifugar durante 10 min a 13.000 x g a 4 ° C, y luego recoger sobrenadante (150 μL) en un nuevo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Precipitar el dsRNA agregando 150 de μl isopropanol y incubar durante 15 minutos en hielo.</li>
	<li>Centrifugar durante 15 min a 13.000 x g a 4 ° C, luego retire el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 200 μL de etanol 70% para lavar dsARN pellets. Centrifugar 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Eliminar el etanol y repita los pasos de lavado del etanol.</li>
	<li>Eliminar el etanol y el dsRNA seco pellet por concentradores de vacío centrífugos de dsRNA de resuspender 3 minutos con 10 μl de agua libre de ARNasa.</li>
	<li>Comprobar la integridad del dsRNA tratada mediante electroforesis en gel de agarosa 1.5%.</li>
</ol>5. oral Administración de dsRNA
<ol><li>Mantener las cucarachas en una dieta ad libitum de alimento seco (chow del perro). Privar de abastecimiento de agua de las cucarachas un día antes experimentos de ingestión de dsRNA.</li>
	<li>Mantenga una cucaracha por el acaparamiento de sus alas con el fórceps flexible (figura 1, paso 5). Nota: No agarre las partes del cuerpo de las cucarachas.</li>
	<li>Preparar el dsRNA lipoplexes, así como el dsRNA desnuda, para la alimentación, como se describe en la sección 2. Nota: Recién se preparara los lipoplexes dsRNA antes de alimentar.</li>
	<li>Alimentación 4 μL de dsARN lipoplexes o dsRNA desnuda (250 ng) con una micropipeta.</li>
	<li>Lentamente pipetee la gota de la solución de dsRNA cerca de las piezas bucales de las cucarachas y que las cucarachas ingieren la gota completamente.</li>
	<li>Realizar los experimentos de ingesta dos veces al día (1 h después de luces y 1 h antes de apagar las luces) de 8 días o 16 días continuamente. Nota: Todas las cucarachas adquirieron agua sólo a través de la alimentación manual con reactivos con solución o control de dsRNA (p. ej., agua libre de nucleasa, solución de glucosa y reactivo de liposomas) durante experimentos de ingestión.</li>
	<li>Ofrecen botellas de agua a las cucarachas después de 16 días de la ingestión del dsRNA experimentos.</li>
</ol>6. evaluar la caída
<ol><li>En el tiempo escogido puntos (2, 9 y 17 días después análisis de dsARN ingestión), recoger los insectos tratados con dsEGFP y dsTub y disecar los tejidos solicitados(por ejemplo, el intestino medio).</li>
	<li>Realizar PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Las condiciones de amplificación qRT-PCR e información de la cartilla por Lin et al. (2017) 12.</li>
	<li>Evaluar el control y trató de dsARN insectos diariamente para verificar la mortalidad y eliminar las cucarachas que ya no se están moviendo.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo presenta un método para RNAi eficaz a través de la administración oral de dsARN lipoplexes, con protección contra la digestión de la ribonucleasa en el jugo del midgut de la cucaracha alemana. Como se muestra en otros estudios en diferentes especies de insectos, el pobre efecto de RNAi a través de la administración oral de dsRNA es sobre todo explicado por la degradación de dsARN8,9,10. Este protocolo produce lipo...

RNAi se ha demostrado como un método eficaz para la expresión génica de precipitación a través de un mecanismo de una vía de silenciamiento postranscripcional provocada por las moléculas de dsRNA en muchos eucariotas1. En la última década de estudio, RNAi se ha convertido en una herramienta útil para el estudio de las funciones de los genes de desarrollo comportamiento por agotamiento de la expresión de genes específicos a través de inyección o alimentación de dsARN en varios taxa de insectos2,3. Debido a la especificidad y la robustez del efecto que agota, la aplicación de ARNi se considera actualmente como una estrategia potencial para4,de gestión de control de plagas5. Sin embargo, la eficacia de RNAi varía ampliamente entre especies de insectos, dependiendo de los diferentes genes blanco y los métodos de entrega. Un cuerpo creciente de evidencia sugiere que la inestabilidad del dsRNA, que se degrada por ribonucleasas, es un factor crítico para la eficacia limitada de ARNi5,6. Por ejemplo, la baja sensibilidad de ARNi en sexta de Manduca ha sido explicada por el hecho de que el dsARN mezclado con hemolinfa fue rápidamente degradado dentro de 1 hora7. Del mismo modo, la presencia de nucleasas alcalinas en el intestino medio, que eficientemente degradar dsRNA ingerido, está fuertemente correlacionada con baja eficiencia de ARNi en diferentes órdenes de insectos8,9,10.
La administración oral de dsRNA es particularmente interesante para el uso de RNAi en una estrategia de control de plagas, pero retardar la degradación del dsRNA de nucleasas en el midgut ha no aún ha desarrollado un método, que tendrían el potencial para asegurar la eficaz Arni mediante la alimentación. Sin embargo, la insensibilidad de RNAi para administración oral de dsARN se han descrito gran cantidad de dsRNA, por ejemplo, 50 μg de Bombyx mori, la alimentación o alimentación continua por 8 días (8 μg dsRNA en total) en las especies de langosta. La cucaracha alemana Blattella germinica, es altamente sensible a ARNi por la inyección de dsRNA11,12,13,14, pero no responde a dsARN a través de la alimentación. Recientemente, Lin et al. (2017) han demostrado que el dsARN encapsulado con resultados de portadores de liposomas en ARNi éxito a caída la expresión de genes de la α-tubulina en la mortalidad significativa del midgut y disparador de la cucaracha alemana15. Como la degradación de dsARN en el intestino medio es el factor limitante para RNAi oral, los portadores de liposomas son un vehículo para proteger dsRNA de degradación, que es fácilmente aplicable en otros insectos con actividades de nucleasa fuerte en la tripa. De la nota, la razón para elegir el reactivo de transfección particular (véase Tabla de materiales) utiliza como portador del liposoma en el protocolo actual es que ha sido probado para la transfección de células de insecto línea con menos toxicidad, según la instrucciones del fabricante. Según la comparación de los sistemas de transfección de liposoma diferente en Gharavi et al. (2013) 16, la eficiencia de transferencia pequeño arn interferente (siRNA) es aproximadamente el mismo entre este y otros sistemas disponibles en el mercado que se han utilizado para los sistemas de entrega de dsARN en otros insectos17,18 . Además, nuestro método de alimentación es lo suficientemente cuidadoso asegurar la cantidad adecuada de dsRNA es ingerida por cada cucaracha, y que los resultados son robustos y confirmado. En Resumen, el presente Protocolo y los resultados demuestran que usando dsARN lipoplexes mejora la estabilidad de dsARN y abre la puerta al diseño de la administración oral de la estrategia de ARNi, que es un enfoque prometedor para el control de plagas en el futuro.

<table><tbody><tr><td>GenJe Plus DNA in vitro Reactivo de transfección</td><td>SignaGen</td><td>SL100499</td><td>para la preparación de lipoplexes</td></tr><tr><td>Blend Taq plus</td><td>TOYOBO&nbsp;</td><td>BTQ-201</td><td>para PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>ABI&nbsp;</td><td>4385612</td><td>para qPCR</td></tr><tr><td>FirstChoice RLM-RACE Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1700</td><td>para identificación UTR 3'&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de transcripción MEGAscript T7</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>para la síntesis de dsRNA</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2239</td><td>eliminar la plantilla de ADN de dsRNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>para la extracción de dsRNA o ARN total</td></tr><tr><td>RQ1 DNasa libre de ARNasa</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>eliminar la plantilla de ADN del ARN total&nbsp;</td></tr><tr><td>cloroformo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>para extracción de dsRNA o ARN total</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td> para extracción de <td>dsRNA o ARN total</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td> para extracción de <td>dsRNA o ARN total</td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietilo, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>para la preparación de agua sin ARNasa</td></tr><tr><td>solución de glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3285</td><td>para la preparación de lipoplexes</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio, NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td> fórmula de <td>tampón salino para insectos</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio, KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>fórmula de tampón salino para insectos</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio, CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>fórmula</td></tr> <tr><td>de tampón salino para insectosCloruro de magnesio hexahidratado, MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>fórmula tampón salina para insectos</td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td>Inhibidor de la enzima <td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>tijera de disección</td><td>F.S.T.</td><td></td> pinzas finas para <td>disección de cucarachas</td></tr><tr><td></td><td>F.S.T.</td><td></td> pinza flexible <td>para disección de cucarachas</td></tr><tr><td></td><td>F.S.T.</td><td></td><td>tenencia de cucarachas&nbsp;</td></tr><tr><td>pipetman</td><td>RAININ</td><td>P10</td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga</td><td>para preparación de muestras Axygen</td><td>MCT175C, PCR02C</td> punta de pipeta para <td>preparación de muestras</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Axygen</td><td></td><td>preparación de muestras</td></tr><tr><td>vortexter</td><td>Digisystem</td><td>vm1000</td><td>preparación de muestras</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Minispin The Gruffin Group</td><td>GMC 206</td><td>para centrifugado líquido&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>ALC</td><td>PK121R Medidor de</td> pH para <td>preparación</td>de</tr><tr><td>muestras&nbsp;</td><td>JENCO</td><td>6071</td><td>para ajuste de pH</td></tr><tr><td>espectrofotómetro de microvolumen</td><td>Quawell</td><td>Q3000</td> ácido <td>nucleico PCR cuantitativo</td></tr><tr><td>termociclador</td><td>ABI&nbsp;</td><td>2720</td><td>para PCR en plantilla o&nbsp; incubación de síntesis de dsRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR cuantitativa en tiempo real</td><td>ABI&nbsp;</td>Concentradores de vacío centrífugos <td>cuantitativos de expresión génica</td> <td>StepOne plus</td></tr><tr><td></td><td>eppendorf</td><td>5301</td><td>para la extracción de dsRNA o ARN total</td></tr><tr><td>Multipette&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>xstream</td><td>para la carga de muestras de PCR en tiempo real&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarosa I</td><td>amresco</td><td>0710</td><td>para electroforesis de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>tub gene specfifc forward preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td></tr><tr><td>tub specfifc reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA</td></tr><tr><td>dsTub template forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG &nbsp;</td></tr><tr><td>dsTub plantilla imprimación inversa</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsEGFP plantilla forward preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG</td></tr><tr><td>dsEGFP template reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC</td></tr><tr><td>tub qPCR forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC</td></tr><tr><td>tub qPCR reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC</td></tr><tr><td>ef1 qPCR forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG</td></tr><tr><td>A ef1 qPCRreverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCT GCA GAG GAA GAC GAA G</td></tr></tbody></table>

uso práctico de arn de interferencia: administración oral de arn bicatenario en liposomas portadores para las cucarachas

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

ARN de interferencia (ARNi) ha sido ampliamente aplicado para descubrir las funciones biológicas de numerosos genes y se ha previsto como una herramienta control de plagas funcionamiento por alteración de la expresión génica esencial. Aunque se han reportado diversos métodos, como la inyección, alimentación y remojo, entrega exitosa de ARN bicatenario (dsRNA), la eficacia de ARNi a través de la administración oral de dsRNA es altamente variable entre los diferentes grupos de insectos. La cucaracha alemana Blattella germanica, es altamente sensible a la inyección de dsRNA, como lo demuestran muchos estudios publicados con anterioridad. El presente estudio describe un método para demostrar que el dsARN encapsulado con portadores de la liposoma es suficiente para retardar la degradación del dsRNA de jugo del midgut. En particular, la continua alimentación de dsARN encapsulado por liposomas significativamente reduce la expresión de la tubulina en el midgut y condujo a la muerte de las cucarachas. En conclusión, la formulación y utilización de dsARN lipoplexes, que protegen el dsRNA contra las nucleasas, podrían ser un uso práctico de RNAi para control de insectos plagas en el futuro.

Un esquema simplificado del protocolo para la entrega oral de dsARN se presenta en la figura 1, donde se muestran los pasos para la preparación de dsARN lipoplexes.
Con el fin de investigar la protección otorgada por las compañías de liposomas sobre degradación de dsARN en el jugo del midgut de B. germanica, un ensayo ex vivo de donde se llevó a cabo dsTub lipoplexes se incubaron c...

Este manuscrito muestra el agotamiento de la expresión génica en el midgut de la cucaracha alemana a través de la ingestión oral de ARN bicatenario encapsulado en liposomas.

Uso práctico de ARN de interferencia: administración Oral de ARN bicatenario en liposomas portadores para las cucarachas

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

El objetivo general de este protocolo es agotar la expresión génica en el intestino de las cucarachas mediante la interferencia de ARN a través de la ingestión oral de ARN bicatenario encapsulado en portadores de liposomas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el desarrollo de nuevos métodos de control de plagas, como ¿puede matar las plagas derribar genes esenciales en campo abierto? La principal ventaja de esta técnica es que el liposoma protege el ARN bicatenario específico del gen para asegurar su entrega a la célula diana.Los encargados de demostrar el procedimiento serán Jia-Hsin Huang, un postdoctorado, y Yun Liu, un técnico de mi laboratorio. Para empezar, anestesia a las cucarachas en hielo hasta que no se muevan durante tres minutos. Luego, levanta un insecto con el pulgar y el índice para acceder a su lado ventral.A continuación, use tijeras de disección para cortar la punta de una coxa de una pata trasera entre la coxa y el trocánter. El corte en otras partes de la coxa es menos eficiente para las colecciones de hemolinfa. A continuación, coloque una micropipeta de 10 microlitros en la incisión y apriete suavemente el abdomen mientras extrae la hemolinfa sangrante.Repita este proceso hasta que la hemolinfa de cinco cucarachas se haya recogido en un solo tubo de microcentrífuga. A continuación, gire brevemente la hemolinfa acumulada durante 10 segundos. Luego, combine 10 microlitros de hemolinfa con 50 microlitros de 1x tampón salino para insectos.Ahora, centrifuga la hemolinfa diluida durante 10 minutos para sacar los hemocitos de la solución. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. Por último, cuantifique la concentración total de proteína utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen y ajuste la concentración de cada muestra a seis miligramos de proteína por microlitro.Para recolectar el jugo del intestino medio, primero, anestesia a las cucarachas en hielo. Luego, transfiera uno a una placa de disección cargada con 1x tampón de solución salina para insectos frío y use alfileres para insectos para asegurarlo con el lado ventral hacia arriba. Ahora, disecciona el abdomen con pinzas finas.Luego, retire todo el intestino y transfiéralo a un plato fresco con 1x tampón salino de insectos. A continuación, aísle el intestino medio, que es la región entre el cultivo y los túbulos de Malpighi. Para ello, retira la parte delantera del animal y retira el intestino posterior.A continuación, transfiera rápidamente el intestino medio a un tubo de microcentrífuga con 100 microlitros de tampón salino para insectos. Recoge las tripas medias de seis cucarachas en el mismo tubo. Luego, agita el tubo durante 10 segundos.A continuación, centrifuga la mezcla durante 10 minutos para separar los hemocitos y los tejidos intestinales. Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio y ajuste la concentración a seis miligramos de proteína por microlitro. Los lipoplex de ARN bicatenario deben usarse dentro de una hora de la preparación.Durante su preparación, asegúrese de combinar todo el reactivo diluido con el ARN bicatenario diluido al mismo tiempo. Luego, vórtice rápidamente e incube la mezcla. Una vez listo, mezcle cuatro microlitros de la solución de ARN bicatenario con 10 microlitros de tampón salino de insectos como control, o mezcle con 10 microlitros de enzimas extraídas de la hemolinfa o del jugo del intestino medio.A continuación, realice un control inhibido por enzimas añadiendo dos microlitros de EGTA. De lo contrario, agregue dos microlitros de agua libre de RNasa. Luego, incube las muestras durante una hora o más a 25 grados centígrados.Después de la incubación, agregue 200 microlitros de reactivo de extracción y 40 microlitros de cloroformo, y luego vórtice. A continuación, centrifuga las muestras durante 10 minutos. A continuación, transfiera 150 microlitros de cada sobrenadante a un nuevo tubo y precipite el ARN bicatenario de cada muestra añadiendo 150 microlitros de isopropanol e incubando las muestras en hielo durante 15 minutos.Después de la incubación, vuelva a centrifugar las muestras y deseche el sobrenadante. A continuación, lave los gránulos de ARN dos veces añadiendo 200 microlitros de etanol al 70% a cada gránulo y centrifugando el tubo. Después del segundo lavado, seque los gránulos de ARN bicatenario con un concentrador de vacío centrífugo durante tres minutos.A continuación, vuelva a suspender los pellets en 10 microlitros de agua libre de RNasa. Por último, compruebe la integridad del ARN bicatenario tratado con un gel de agarosa al 1,5%. Alimenta a las cucarachas dos veces al día, una hora después de que se enciendan las luces y una hora antes de que se apaguen.Hazlo durante ocho o 16 días sin descansos. Durante este tiempo, las cucarachas deben estar hambrientas de agua. Para la alimentación, tiene disponibles lipoplex de ARN bicatenario recién preparados y ARN bicatenario desnudo.Para el bolo, úselo con cuatro microlitros de lipoplex de ARN bicatenario o 250 nanogramos de ARN bicatenario desnudo. Para alimentar a una cucaracha, primero, agárrala por las alas con pinzas flexibles. No agarre las partes del cuerpo de una cucaracha.Luego, pipetea lentamente la gota de solución cerca de las piezas bucales y observa cómo la cucaracha ingiere la gota. Después de la última alimentación, proporcione botellas de agua a las cucarachas. A lo largo del período de alimentación, evalúe los insectos diariamente para verificar la mortalidad y eliminar las cucarachas que ya no se muevan del experimento.La administración oral continua de lipoplexes de doble cadena fue capaz de disminuir la expresión de tubulina en el intestino medio del 40% en el día nueve al 60% en el día 17. En comparación, el ARN bicatenario desnudo no tuvo ningún efecto. Lo más probable es que esto se deba al hallazgo de que la exposición del ARN bicatenario desnudo al jugo del intestino medio resultó en la degradación en una hora, mientras que el ARN bicatenario conjugado con liposomas permaneció estable.No solo disminuyeron los niveles de ARN, sino que la alimentación continua de los lipoplexes de ARN bicatenario de tubulina también resultó en una letalidad significativa. Es poco probable que esto se deba al vector, ya que los lipoplex que transportan ARN bicatenario al EGFP no resultaron letales. Al intentar este sistema de administración oral de ARN de interferencia, es importante realizar una alimentación continua de ARN bicatenario durante varios días.Una vez dominado, el paso de alimentación se puede realizar en dos minutos por insecto si se realiza correctamente. Si es necesario, se pueden aplicar diferentes formulaciones de nanopartículas de liposomas para mejorar el procedimiento de alimentación y la eficiencia del ARNi. En última instancia, esta técnica ha hecho posible que los investigadores en el campo del manejo de plagas exploren nuevas estrategias de control utilizando ARNi.

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Investigación

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Biología

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En la transcripción in vitro y la nivelación de mRNA de luciferasa Gaussia Seguido por transfección de células HeLa

Aprenda a administrar ARN bicatenario encapsulado en liposomas por vía oral en cucarachas para silenciar genes en el intestino medio. Este método ofrece nuevas estrategias de control de plagas eficaces.

Uso práctico de ARN de interferencia: administración Oral de ARN bicatenario en liposomas portadores para las cucarachas

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