Name: Un método colorimétrico para medir el contenido de hierro en plantas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprende a medir el contenido de hierro en tejidos vegetales mediante el método colorimétrico de Azul de Prusia. Esta técnica precisa permite cuantificar hierro en muestras biológicas de forma sencilla y confiable.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Israel de ciencia, tecnología y espacios por una beca del jefe científico del Ministerio israelí de Agricultura (#16-16-0003).

1. Material y condiciones de crecimiento de la planta
<ol><li>Semillas de tabaco uno (cultivar Samsun) de semilla por maceta de 5 cm x 5 cm llenan con medio pote estándar. Coloque las macetas sobre bandejas. Crecer las plantas en un cuarto de crecimiento bajo condiciones de día largo (16/8 h luz/oscuridad) a una temperatura constante de 23 ° C. Regar con agua del grifo hasta los desagües de agua de la olla.</li>
	<li>Después de días de 50±5, iniciar tratamientos de Fe en el riego, según las concentraciones adecuadas para el experimento. Por ejemplo, utilizamos una gama de concentraciones de hierro de 0 a 6 mM, complementado por un quelante de Fe soluble (Fe EDDHA). Regar las plantas con la solución adecuada cada dos días (para evitar la deshidratación) para 6-8 días.</li>
</ol>2. preparación de las hojas para la medición de hierro
Notas: Todos los materiales a utilizarse deben estar libre de hierro con el fin de reducir el riesgo de contaminación de hierro. Limpiar el mortero y Maja dos veces con solución de HCl 4% y secar con papel de filtro cada vez que lo use. Si se reutiliza cualquier material, limpiar dos veces con solución de HCl 4% y secar con papel de filtro.
<ol><li>Separar las hojas del tallo a mano, usando guantes (no usar cualquier equipo de metal). Utilice aproximadamente 10 g de hojas (peso fresco) para cada muestra. Limpiar cada hoja con agua bidestilada (DDW) utilizando una botella rociadora. Este paso es importante para evitar la contaminación de la Fe.</li>
	<li>Secar las hojas en una toalla de papel y ponerlos en una bolsa de papel. Transferir las bolsas de papel a un horno a una temperatura constante de 80 ° C durante 2-3 días.</li>
	<li>Cuando esté seco, aplasta las hojas a polvo con un mortero y Maja y transferencia a tubos de plástico estériles de 15 mL.</li>
</ol>3. quema las hojas de ceniza
Notas: El uso de una solución de HCl de pH bajo (cerca de 0) está destinado a aumentar la solubilidad del hierro. La lana de roca se utiliza para evitar que los gases escapen el frasco durante la quema.
<ol><li>Pesa un vial de centelleo 20 mL nuevo, sellado sin su tapa. Tenga en cuenta el valor o establecer el valor a cero usando el botón tare. Añadir las hojas secas machacadas (muestra) al vial.</li>
	<li>Pesar la muestra y recipiente y observe el valor. Cerrar la cubeta con lana de roca.</li>
	<li>Pesan 3 frascos adicionales sin el adición de muestras y anota sus valores. Estos frascos se utilizará como controles para evaluar la cantidad de lana de roca que podría haber llevado a un aumento en peso de la muestra.</li>
	<li>Colocar los frascos de muestra y control en un horno y comenzar a quemar los siguientes pasos de temperatura: temperatura ambiente, rápido aumento a 425 ° C y, finalmente, 425° C por 4 horas. Por este tiempo, las hojas secas habrá convertido a cenizas.</li>
	<li>Deje que se enfríe hasta unos 100 ° C las muestras pero no por debajo de esta temperatura para los dos pasos siguientes evitar la humedad, que podrían afectar el peso final de la muestra. Uso de guantes para trabajo pesados, quitar las muestras del horno con pinzas, sosteniendo el frasco externamente.</li>
	<li>Ponga los frascos sobre una superficie plana, sacar la lana de roca y cerrar los frascos con sus tapas originales.</li>
	<li>Pesar los frascos de 3 control (véase 3.3) y calcular su ganancia de peso promedio. Si aumento de peso es igual o superior al 1% del peso de cenizas (ver paso 4.2), utilice este valor como una estimación del error de medición.</li>
</ol>4. preparación de las cenizas para medición de hierro
Notas: La concentración final de hierro en la muestra inicial se calcula como el peso de las cenizas dividido por el volumen añadido de ácido clorhídrico.
<ol><li>Preparar una solución de HCl de 1 M (4% HCl) mediante la adición de 12,5 mL de una solución madre de ácido clorhídrico de 37% a 87,5 mL de DDW (en un frasco de plástico o vidrio).</li>
	<li>Pesa un tubo de plástico de 15 mL y anote el valor o ajuste a cero usando el botón tare. Transferir las cenizas al tubo, pesan y anote el valor. Este es el peso de la ceniza.</li>
	<li>Añadir 5 mL de 1 M de HCl a las cenizas. Las cenizas del filtro a través de un filtro de 22 μm y añadir un adicional 5 mL de 1 M de HCl a través del mismo filtro.</li>
	<li>El volumen final debe ser 10 mL. Tenga en cuenta que se perderá parte de la solución en el filtro. Nota: Las muestras están ahora listas para medición de Fe por FAAS o por el método de azul de Prusia.</li>
	<li>Hacer una curva de calibración con la concentración de Fe midió por Espectrometría Atómica y por el método de azul prusiano (ver figura 4) para cada especie de planta. Posteriormente, la concentración de Fe puede medirse por el método Prusiano azul solo.</li>
</ol>5. medir la concentración de Fe por FAAS
<ol><li>Extraiga 4 mL de cada muestra para la medición por FAAS.</li>
	<li>Dividir los resultados obtenidos de la medición de la FAAS por el peso de las cenizas. Dividir el valor resultante por 0.01 (porque las cenizas fueron solubilizadas en 10 mL). El valor resultante es la concentración de hierro por gramo de ceniza (ppm).</li>
</ol>6. preparación de la solución de tinción del azul de Prusia
<ol><li>Preparar un 4% solución azul prusiano al agregar 4 g de K4Fe(CN)6 a 100 mL DDW y vortex (otros volúmenes o concentraciones pueden utilizarse para diversas demandas). Cabe señalar que en este estudio, menos azul prusiano solución concentraron que se utilizó previamente divulgados (20%)14 .</li>
	<li>Mantener la solución en la oscuridad a 4 ° C hasta su uso. La solución es estable por 6 meses almacenado en estas condiciones.</li>
</ol>7. generar una curva de calibración para el método de azul de Prusia con FAAS resultados
Nota: Calcular la concentración de hierro en las cenizas con la siguiente fórmula <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57408/57408eq1.jpg">Ecuación 1 C: concentración, V: volumen, W: peso de cenizas (g) de muestra.
<ol><li>Mezclar 0,50 mL de solución de azul prusiano y 0,50 mL de 1 M de HCl. Esto servirá como la solución en blanco.</li>
	<li>Mezclar 0,5 mL de muestra (cenizas en el 4% HCl, como se describe en la sección 3) y 0,5 mL de solución de azul prusiano (paso 6.1) mediante pipeteo. Espere al menos 1 minuto pero no más de 5 minutos. Después de 5 minutos, se producirá la sedimentación en las muestras.</li>
	<li>Transferir la mezcla a una cubeta y medir la do a 715 nm usando un espectrofotómetro. Anote el valor.</li>
	<li>Dividir el valor de OD (paso 7.3) por el peso de la ceniza (paso 3.2) de la muestra. El resultado representa do por gramo de ceniza.</li>
	<li>Trama de la regresión lineal entre las concentraciones de hierro obtenidos de las mediciones de la FAAS (eje Y) y los valores de OD (eje X). Utilizar los resultados obtenidos en los pasos 5.2 y 7.4. Calcular la fórmula de regresión, Y = a + bX, donde Y representa la concentración de hierro, una representa la absorbancia se cruzan, b representa la pendiente de la absorbancia y X representa el OD.</li>
</ol>8. el método de azul de Prusia para la determinación de los niveles de hierro en otras muestras del mismo tipo de planta
Notas: Desde una curva de calibración se ha establecido ya para este tipo de planta, la concentración de hierro en las muestras nuevas del mismo tipo de planta puede ser directamente calculada utilizando la fórmula de regresión lineal.
<ol><li>Siga los pasos en las secciones 3 y 4, seguida por pasos de 7.1 a 7.4.</li>
	<li>Calcular la concentración de hierro en solución utilizando la fórmula obtenida de la regresión lineal (paso 7.5).</li>
</ol>

<ol><li>Kobayashi, T., Nishizawa, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+uptake%2C+translocation%2C+and+regulation+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Iron uptake, translocation, and regulation in higher plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 131-152 (2012).</li>
<li>Bradley, J. M., Le Brun, N. E., Moore, G. R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00775-016-1336-0">Ferritins: Furnishing proteins with iron.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 21 (1), 13-28 (2012).</li>
<li>Zielińska-Dawidziak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+ferritin+-+a+source+of+iron+to+prevent+its+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Plant ferritin - a source of iron to prevent its deficiency.</a> Nutrients. 7 (2), 1184-1201 (2015).</li>
<li>Johnson, D. C., Dean, D. R., Smith, A. D., Johnson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+formation+of+biological+iron-sulfur+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and formation of biological iron-sulfur clusters.</a> Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 247-281 (2015).</li>
<li>Guo, H., Barnard, A. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/ta/c2ta00523a">Naturally occurring iron oxide nanoparticles: morphology, surface chemistry and environmental stability.</a> Journal of Materials Chemistry A. 1 (1), 27-42 (2013).</li>
<li>Hem, J. D., Cropper, W. H. <a target="_blank" href="https://pubs.usgs.gov/wsp/1459a/report.pdf">Chemistry of iron in natural water.</a> Report US Geological Survey. , 1-31 (1962).</li>
<li>Rout, G. R., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.agrsci.jp/ras/article/view/12">Role of iron in plant growth and metabolism.</a> Reviews in Agricultural Science. 3, 1-24 (2015).</li>
<li>Speretto, R. A., Ricachenevsky, F. K., Stein, R. J., de Abreu Waldow, V., Fett, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+stress+in+plants+Dealing+with+deprivation+and+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Stress%22%5BJournal%5D)">Iron stress in plants Dealing with deprivation and overload.</a> Plant Stress. 4, 57-69 (2010).</li>
<li>Tautkus, S., Steponeniene, L., Kazlauskas, R. <a target="_blank" href="https://www.shd.org.rs/JSCS/Vol69/No5/V69-No5-10.pdf">Determination of iron in natural and mineral waters by flame atomic absorption spectrometry.</a> Journal of the Serbian Chemical Society. 69 (5), 393-402 (2006).</li>
<li>Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reevaluation+of+colorimetric+iron+determination+methods+commonly+used+in+geomicrobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology.</a> Journal of Microbiological Methods. 89 (1), 41-48 (2012).</li>
<li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Atomic+Spectroscopy+-+Guide+to+Selecting+the+Appropriate+Technique+and+System%22">Atomic Spectroscopy - Guide to Selecting the Appropriate Technique and System</a>. 16, (2011).</li>
<li>Wachasunder, S. D., Nafade, A. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00207230108711348">Precision and accuracy control in the determination of heavy metals by atomic absorption spectrometry.</a> Science. 58, 517-528 (2001).</li>
<li>Woods, J. T., Mellon, M. G. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/i560096a013">Thiocyanate method for iron. A spectrophotometric study.</a> Industrial & Engineering Chemistry Analytical Edition. 13 (8), 551-554 (1941).</li>
<li>Perls, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007%2FBF01878983">Nachweis von Eisenoxyd in gewissen Pigmenten.</a> Virchows Archiv Fur Pathologische Anatomie Und Physiologie Und Fur Klinische Medizin. 39 (1), 42-48 (1867).</li>
<li>Connorton, J. M., Jones, E. R., Rodriguez-Ramiro, I., Fairweather-Tait, S., Uauy, C., Balk, J. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/04/28/131888">Altering expression of a vacuolar iron transporter doubles iron content in white wheat flour.</a> bioRxiv. , 1-25 (2017).</li>
<li>de la Fuente, V., Rufo, L., Rodríguez, N., Franco, A., Amils, R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11104-017-3251-8">Comparison of iron localization in wild plants and hydroponic cultures of Imperata cylindrica (L.) P. Beauv.</a> Plant Soil. 418 (1-2), 25-35 (2017).</li>
<li>Hsiao, P. Y., Cheng, C. P., Koh, K. W., Chan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+defensin+gene%2C+AtPDF1.1%2C+mediates+defence+against+Pectobacterium+carotovorum+subsp.+carotovorum+via+an+iron-withholding+defence+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis defensin gene, AtPDF1.1, mediates defence against Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum via an iron-withholding defence system.</a> Science Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Johnson, D. B., Kanao, T., Hedrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+transformations+of+iron+at+extremely+low+pH%3A+Fundamental+and+applied+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Redox transformations of iron at extremely low pH: Fundamental and applied aspects.</a> Frontiers in Microbiology. 3, 1-13 (2012).</li>
<li>Stumm, W., Lee, G. F. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ie50614a030">Oxygenation of ferrous iron.</a> Industrial & Engineering Chemistry. 53 (2), 143-146 (1961).</li>
<li>Jones, A. M., Griffin, P. J., Collins, R. N., Waite, T. D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016703714005663">Ferrous iron oxidation under acidic conditions - The effect of ferric oxide surfaces.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 145, 1-12 (2014).</li>
<li>Hawkesworth, C. J., Kemp, A. I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+continental+crust%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of the continental crust.</a> Nature. 443 (7113), (2006).</li>
<li>Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThompson%2C+LM+%22Soils+and+soil+fertility%22">Soils and soil fertility</a>. Louis, M., Troeh, F. R., Thompson, L. M. , (1973).</li>
<li>Krueger, B. J., Grassian, V. H., Cowin, J. P., Laskin, A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1352231004006442">Heterogeneous chemistry of individual mineral dust particles from different dust source regions: The importance of particle mineralogy.</a> Atmospheric Environment. 38 (36), 6253-6261 (2004).</li>
<li>Bewick, V., Cheek, L., Ball, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistics+review+7%3A+Correlation+and+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Statistics review 7: Correlation and regression.</a> Journal of Critical Care. 7 (6), 451-459 (2003).</li>
<li>Asuero, A. G., Sayago, A., González, A. G. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/10408340500526766">The correlation coefficient: An overview.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 36 (1), 41-59 (2006).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Analytical Chemistry. Calibration Curves. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves">https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves</a> (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Medición de hierro en los tejidos vegetales es muy importante para evaluar los efectos de riego u otras condiciones ambientales. Aquí, describimos un método colorimétrico fácil y preciso para la medición de contenido de Fe en hojas de tabaco, que puede ser fácilmente adaptado a otras especies de plantas y de los tejidos.
En la optimización de las condiciones para el método colorimétrico, utilizamos un medio de pH bajo (pH < 1.0) para permitir la solubilidad del hierro. El proceso de grabación ...

Hierro (Fe) es un micronutriente importante en todos los organismos vivos. En las plantas, es un micronutriente esencial1 debido a su implicación en procesos básicos, como la biosíntesis de la clorofila, la fotosíntesis y la respiración. Alta acumulación de iones de hierro libre es dañino para las células debido a las reacciones que conducen a la liberación de radicales libres que causan el estrés oxidativo de la planta. Para mantener la homeostasis del hierro dentro de la célula de la planta, los iones se almacenan en vacuolas y secuestrados en ferritins y jaulas de proteínas directamente involucradas en la homeostasis de hierro2 la estructura principal de almacenamiento de hierro en todos los organismos vivos. Al mismo tiempo, la anemia por deficiencia de hierro afecta a una proporción significativa de la población humana, resultando en una creciente necesidad de planta bioenriquecimiento del contenido de Fe. Debido a las propiedades únicas de ferritina de planta, enriquecimiento de alimentos con hierro de la ferritina ofrece una prometedora estrategia para combatir este problema de la desnutrición3.
Los iones de hierro son principalmente en dos Estados de oxidación, es decir, ferrosos (divalente del Fe2 + o hierro (II)) y férrico (trivalente Fe3 + o hierro (III)) formas. Varias otras formas de hierro, como hierro de grupos4, también se encuentran en las células. Fe se almacena como óxido de hierro dentro de la célula y naturalmente hematites de formas (Fe2O3) y ferryhidrites ((Fe3 +)2O3•0.5 H2O) bajo condiciones fisiológicas5. Los hidróxidos formados en estas reacciones, especialmente la forma férrica, tienen muy baja solubilidad. Retención de hierro por lo tanto se ve afectada por el pH de la solución y es en gran parte en estado sólido por encima de pH 56.
Teniendo en cuenta la pobre solubilidad y reactividad alta de Fe, su transferencia entre órganos y tejidos de la planta debe ser asociado con moléculas quelantes adecuadas. Por otra parte, se deben controlar sus Estados redox entre las formas ferrosa y férrica1 . Dentro de hojas, aproximadamente el 80% del hierro se encuentra en células fotosintéticas, debido a su papel esencial en el sistema de transporte de electrones, en la biosíntesis de los citocromos, clorofila y otras moléculas de hemo y en la formación de Fe-S grupos de7. En el caso de hierro exceso dentro de la célula, el superávit se transloca en la vacuola donde el metal se almacena en moléculas de ferritina8.
Hierro puede medirse en los tejidos vegetales por varios métodos, incluyendo llama absorción atómica Espectroscopia9 (FAAS) o análisis colorimétrico10, el primero es mucho más precisa que la segunda. FAAS es una técnica muy precisa que permite determinar la composición elemental de una muestra sobre la base de la emisión electromagnética de los elementos individuales. FAAS convierte los iones del metal en Estados atómicos de llama-calentamiento de la muestra, llevando a ion excitación y emisión de una longitud de onda específica cuando un ion dado regresa a su estado de tierra. Las emisiones de los diferentes iones se separan por un monocromador y detectadas por un sensor de absorción11. FAAS así sirve cuantificar directamente las concentraciones de hierro. Sin embargo, otras técnicas para la visualización de hierro en los tejidos biológicos están disponibles. Espectroscopia de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS)12 es una técnica muy precisa para medir el hierro y otros oligoelementos, pero la falta de equipamiento, tanto para la FAAS y ICP-MS, es un problema común. Por otro lado, medición de hierro con tiocianato colorimetría13 carece de precisión y no detectar pequeñas variaciones entre las muestras. Azul prusiano tinción14,15,16,17 es un método indirecto basado en la reacción de ferrocianuro férrico de potasio (K4Fe(CN)6) con cationes de Fe, produciendo un color azul fuerte y se utiliza para la detección cualitativa de hierro en secciones histológicas de los tejidos animales y vegetales.
Hierro metálico (cero-Valente) es rara en la litosfera. La forma iónica no complejado dominante de hierro en el medio ambiente sobre todo obedece a la cantidad de oxígeno en los alrededores, con hierro ferroso, siendo relativamente más abundantes en ambientes anóxicos y hierro férrico predomina en sitios de aeróbicos. Esta última forma también es dominante en ambientes extremadamente ácidos, aunque los agentes causantes de la oxidación de hierro ferroso diferencian a menudo en un ambiente anóxico y ácido18. Cuando el hierro es solubilizado en el 4% HCl (pH 0) en un ambiente aeróbico, la mayor parte del hierro diluido existe ya que el férrico (Fe3 +)19,20.
Las reacciones entre los iones de Fe y K4Fe(CN)6 son las siguientes:
Fe3 +: FECLAS3 + K4Fe(CN)6 = KFe(III)Fe(II)(CN)6̄ + 3KCl
Fe2 +: 4 FECLAS2 + 2 K4Fe(CN)6 =4(Fe(CN)6) Fe2 + 8 KCl
En el presente estudio, preguntamos si la coloración azul prusiano puede ser útil para medir los niveles de hierro en solución.
Inicialmente, verificó la correlación entre la concentración de Fe en la solución acuosa y la coloración azul prusiano. La concentración de Fe (como FECLAS2, FECLAS3 o una mezcla 1:1 de los dos) en soluciones acuosas se midió absorbancia (OD) y espectroscopia atómica después de la adición de azul de Prusia. La figura 1 muestra las curvas de regresión lineal de las mediciones obtenidas por cada método. Llegamos a la conclusión que el método de azul prusiano puede utilizarse para el análisis cuantitativo de la concentración de hierro en solución.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig1.jpg"> Figura 1: regresiones lineales entre la concentración de Fe medición por FAAS y ligera absorbancia (OD, 715 nm) obtenidos por el método de azul prusiano. Los cuadrados azules y línea representan la solución de Fe2 + , la línea y cuadrados rojos representan la solución de Fe3 + y los cuadrados negros y línea representan una mezcla de 1:1 entre el Fe2 + y Fe3 +. Se obtuvieron las siguientes regresiones: [Fe2 +] = 3 + 123 x OD, r = 0.996, R2 = 0.989; [Fe3 +] = 1 + 292 x OD, r = 0.999, R2 = 0.997; y [Fe2 + / 3 +] = 11 + 146 x OD, r = 0.983, R2 = 0.956. El Fe2 + donante era FECLAS2 y el Fe3 + donante era FECLAS3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para adaptar el método colorimétrico del azul prusiano para el análisis cuantitativo del hierro de los tejidos de la planta, se midió el contenido de hierro de las cenizas de hoja de tabaco por espectroscopía de absorción atómica por llama y coloración azul prusiano. Hubo buena correlación entre los resultados de las dos técnicas.

<table><tbody><tr><td>Hexacianoferrato de potasio(II)</td><td>Reactivo de Fisher Chemical</td><td>14459-95-1</td> para la unidad de filtro de jeringa <td>Pussian Blue</td></tr><tr><td>Millex, ventilación de vial 0.22 &mu; m</td><td>Millec</td><td>SLGP033RS</td><td>Filtro utilizado para filtrar las cenizas + 4% de HCl Solución</td></tr><tr><td>de centelleo Viales Fisherbrand</td><td></td><td>03-337-4</td><td>Se utiliza para mantener el material vegetal en polvo seco durante el procedimiento de quema.</td></tr><tr><td>Jeringa desechable 10 ml</td><td>Medi-Plus</td><td>1931</td><td>Jeringa utilizada durante la filtración</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>231-595-7</td><td>Se utiliza en la solución de HCl al 4% para diluir las cenizas y limpiar los materiales</td></tr><tr><td>Tabaco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN</td><td>Obtenido del Prof. Simon Barak y utilizado habitualmente en el Laboratorio</td> <td>ZaccaiBarak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Regulación transcripcional y postranscripcional del gen de la glicolato oxidasa en plántulas de tabaco. Biología Molecular de Plantas. 1 de marzo de 2001; 45(4):399-407.</td><td>Cultivar de tabaco utilizado en este protocolo</td></tr><tr><td>Lana de vidrio (lana de roca)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>659997-17-3</td><td>Se utiliza en el procedimiento de quema de muestras en el horno.</td></tr></tbody></table>

un método colorimétrico para medir el contenido de hierro en plantas

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Hierro, uno de los micronutrientes más importantes en los organismos vivos, está involucrado en procesos básicos, tales como la respiración y la fotosíntesis. Contenido de hierro es más bien bajo en todos los organismos, por importe de cerca de 0.009% de peso seco en plantas. Hasta la fecha, uno de los métodos más exactos para medir la concentración de hierro en los tejidos vegetales es la espectroscopía de absorción atómica por llama. Sin embargo, este enfoque es lento y costoso y requiere un equipo específico no comúnmente en laboratorios de la planta. Por lo tanto, es necesario un método más simple, pero preciso que puede ser utilizado rutinariamente. El método colorimétrico de azul de Prusia se utiliza regularmente para hierro cualitativo tinción en secciones histológicas animales y vegetales. En este estudio, hemos adaptado el azul de Prusia, método para la medición cuantitativa de hierro en el tabaco deja. Validamos la exactitud de este método usando Espectroscopia atómica y azul de Prusia de tinción para medir contenido de hierro en las mismas muestras y encontró una regresión lineal (R2 = 0.988) entre los dos procedimientos. Concluimos que el método de azul de Prusia para la medición cuantitativa de hierro en los tejidos vegetales es precisa, simple y barato. Sin embargo, la regresión lineal presentada aquí puede no ser apropiada para otras especies de plantas, debido a las interacciones potenciales entre la muestra y el reactivo. Establecimiento de una curva de regresión es así necesario para diferentes especies de plantas.

Cuando este protocolo se lleva a cabo correctamente, se debe conseguir excelente correlación entre los resultados obtenidos por los métodos de espectroscopia atómica y azul prusiano. Por lo tanto, el método azul prusiano puede utilizar fácilmente para obtener una medición precisa de la concentración de hierro en muestras de la planta, como se refleja en el siguiente experimento.
Plantas de tabaco cultivadas como se describe en e...

Presentamos un protocolo sencillo y fiable para medir el contenido de hierro en los tejidos de la planta usando el método colorimétrico de azul de Prusia.

Un método colorimétrico para medir el contenido de hierro en plantas

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Solo desde el punto de vista médico, puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la biología. Por ejemplo, cómo podemos cuantificar fácilmente el hierro en muestras de núcleos de biología. La apuesta principal de esta técnica es que es una técnica colorimétrica fácil de producir y muy precisa.Al preferir esta técnica, debe evitar la contaminación por hierro. La demostración visual de este método le ayudará a comprender sus diferentes pasos. Para comenzar este procedimiento, prepare macetas de cinco centímetros por cinco centímetros llenándolas con un medio de olla estándar.Plante una semilla de tabaco en cada maceta. Transfiera las plantas a una sala de crecimiento que esté a una temperatura constante, en condiciones de día largo de 23 grados centígrados. Riegue con agua del grifo hasta que el agua se drene de la maceta y cultive las plantas durante aproximadamente 50 días.Pasado este tiempo, iniciar tratamientos con hierro en la irrigación a concentraciones adecuadas para el experimento. Riegue las plantas con esta solución cada dos días durante seis a ocho días. Luego, separe las hojas del tallo con la mano, asegurándose de no usar ningún equipo metálico.Con una botella rociadora llena de agua destilada doble, limpie cada hoja. Seque las hojas en una toalla de papel y luego transfiéralas a una bolsa de papel. Coloque las bolsas llenas de hojas en un horno, a una temperatura constante de 80 grados centígrados, durante dos o tres días.Limpie el mortero dos veces, con una solución de ácido clorhídrico al 4%. Y usa un papel de filtro para secar. Con el mortero, triture las hojas secas hasta convertirlas en polvo.Luego, transfiera el polvo a tubos de plástico estériles de 15 mililitros. Primero, pese un vial de centelleo nuevo y sellado de 20 mililitros sin tapa. Anote el peso o tara la báscula.Luego agregue las hojas trituradas. Pesa la muestra en el vial y anota el peso. Use lana de roca para cerrar el vial.Pese tres viales adicionales sin agregar muestras, para su uso como controles, tomando nota de cada peso. A continuación, transfiera la muestra y los viales de control a un horno. Queme las hojas como se describe en el protocolo de texto.Después de esto, deje que las muestras se enfríen a aproximadamente 100 grados centígrados. Con guantes gruesos y pinzas, retire las muestras del horno, asegurándose de sujetar el frasco exteriormente. Coloque los viales sobre una superficie plana.Retire la lana de roca y cierre los viales con sus tapas originales. A continuación, pese los tres viales de control y calcule su ganancia de peso media. Si la ganancia de peso es igual o superior al 1% del peso de las cenizas, utilice este valor como estimación del error de medición.Pesa un tubo de plástico de 15 mililitros. Registre el peso o tara la báscula. Luego transfiera las cenizas al tubo.Registre este valor, que es el peso de las cenizas. A continuación, agregue cinco mililitros de la solución de ácido clorhídrico molar a las cenizas. Filtra las cenizas a través de un filtro de 22 micrómetros.Luego agregue cinco mililitros adicionales de la solución de ácido clorhídrico molar a través del mismo filtro, lo que lleva a un volumen de muestra final de 10 mililitros. Después de esto, retire cuatro mililitros de cada muestra para su medición por espectroscopia atómica. Y determine la concentración de hierro por gramo de ceniza como se describe en el protocolo de texto.Para comenzar, agregue cuatro gramos de ferrocianuro de potasio a 100 mililitros de agua bidestilada, para preparar la solución de azul de Prusia. Vórtice para mezclar y almacenar a 4 grados centígrados hasta que esté listo para usar. Cuando esté listo para usar, mezcle 50 mililitros de solución de azul de Prusia con 50 mililitros de ácido clorhídrico molar para que sirva como solución en blanco.A continuación, utilice una pipeta para mezclar 0,5 mililitros de una muestra obtenida previamente con 0,5 mililitros de solución de azul de Prusia. Deje reposar esta mezcla durante al menos un minuto, pero menos de cinco minutos. Transfiera esta mezcla a una cubeta y use un espectrofotómetro para medir la densidad óptica a 715 nanómetros.Luego, determine la densidad óptica por gramo de ceniza y trace la regresión lineal entre las concentraciones de hierro, como se describe en el protocolo de texto. Los resultados representativos de 21 muestras de hojas de tabaco muestran que la concentración de hierro en el agua de riego afectó en gran medida el contenido de hierro en la hoja. A continuación, se analizan los espectros de las 21 muestras representativas con el método del azul de Prusia.Como se ve aquí, la absorbancia a 715 nanómetros es la longitud de onda óptima al medir soluciones que contienen diferentes concentraciones de hierro dos y hierro tres. Una curva de regresión lineal, que se obtiene mediante el trazado de los valores de concentración de hierro obtenidos por espectroscopia atómica, frente a los valores de absorbancia, obtenidos por el método del azul de Prusia, permite analizar nuevas muestras del mismo tipo de planta. No olvide que trabajar con HCL puede ser extremadamente peligroso.Y siempre se deben tomar precauciones, como la protección de los ojos, al realizar este procedimiento. En la regresión lineal, es importante comprobar que los resultados están en un rango realista. Después de su desarrollo, esta técnica puede ayudar a los investigadores en biología a explorar plantas adicionales para la producción de alimentos o la biorremediación.

a-colorimetric-method-for-measuring-iron-content-in-plants

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este video, describimos un método basado en la colorimetría para determinar el contenido de hierro no hemo en el tejido hepático de ratón. El sulfonato de batofenantrolina se utiliza como sustrato cromogénico en presencia de un agente reductor, que convierte el hierro férrico en hierro ferroso quelastable.

Ensayo colorimétrico basado en sulfonato de bateofenantrolina: un método simple y rápido para la cuantificación de hierro no hemo en tejido hepático de ratón

Este video muestra una técnica in vitro para evaluar la biodisponibilidad de hierro en fuentes de alimentos complejas. La técnica combina la simulación de la digestión humana junto con la absorción de hierro por parte de células Caco-2 diferenciadas. La formación de ferritina intracelular actúa como un marcador para la absorción de hierro celular.

Bioensayo celular Caco-2: un método in vitro para medir la biodisponibilidad del hierro en fuentes alimentarias complejas

Este video describe el método para cuantificar los carbohidratos digeribles presentes en los tejidos vegetales. Esto ayuda a recopilar datos de varios tejidos vegetales para estudiar la ecología nutricional, las interacciones entre plantas y herbívoros y la dinámica de la red alimentaria.

Ensayo colorimétrico para la cuantificación de hidratos de carbono no estructurales en tejidos vegetales

Hemos simulado un sistema de afloramiento marino ferruginosa Precámbrico en una columna de flujo continuo vertical, a escala de laboratorio. El objetivo era comprender cómo los perfiles geoquímicos de O 2 y Fe (II) evolucionar a medida que las cianobacterias producen O2. Los resultados muestran el establecimiento de una chemocline debido a la oxidación Fe (II) por fotosintéticamente producido O 2.

Simulación de un laboratorio de hierro (II) ricos sistema de afloramiento Precámbrico marina para explorar el crecimiento de bacterias fotosintéticas

Este método de especiación redox de hierro se basa en la espectrometría de masas plasmáticas acoplada inductivamente por electroforesis capilar con apilamiento de muestras combinada con análisis cortos en una sola ejecución. El método analiza rápidamente y proporciona bajos límites de cuantificación para las especies de redox de hierro en una amplia gama de tejidos y muestras de biofluidos.

Configuración de Espectrometría de Masas De Plasma Acoplada Inductivamente Electroforesistiva (CE-ICP-MS) para Cuantificación de Especies redox de Hierro (Fe(II), Fe(III))

Este artículo demuestra cómo preparar y administrar hierro isotópico no radiactivo unido a transferrina para estudios de transporte de hierro en el embarazo de ratón. También se describe el enfoque para cuantificar el hierro isotópico en compartimentos fetoplacentarios.

Cuantificación del transporte de hierro a través de la placenta del ratón in vivo utilizando isótopos de hierro no radiactivos

Aquí, se proporciona un protocolo para la medición del contenido de hierro no hemo en tejidos animales, utilizando un ensayo colorimétrico simple y bien establecido que se puede implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios.

Medición del contenido de hierro no hemo en tejidos utilizando un ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina

El bioensayo de células Caco-2 para la biodisponibilidad de hierro (Fe) representa un enfoque rentable y versátil para evaluar la biodisponibilidad de Fe de alimentos, productos alimenticios, suplementos, comidas e incluso regímenes dietéticos. Completamente validado para estudios en humanos, representa el estado del arte para estudios de biodisponibilidad de Fe.

El bioensayo de células Caco-2 para la medición de la biodisponibilidad de hierro en los alimentos

Describimos un ensayo fluorescente que puede confirmar de forma rápida y económica la capacidad de nuevos compuestos para quelar el hierro. El ensayo mide la capacidad de los compuestos para superar la actividad de unión al hierro de la sonda fluorescente quelante de hierro débil Calceína, lo que resulta en un aumento cuantificable de la fluorescencia cuando se produce la quelación.

Método fluorescente sin células, cuantificable y económico, para confirmar la capacidad de nuevos compuestos para quelar el hierro 

Este protocolo presenta métodos para evaluar la distribución y cantidad de deposición de hierro en los tejidos, especialmente en el cerebro. El protocolo detalla los procedimientos para la preparación de muestras, la tinción de Perls/DAB, la captura de imágenes y el análisis de datos.

Evaluación de la deposición de hierro en el cerebro de ratones 5xFAD mediante tinción de Perls/DAB

Este trabajo ha discutido el protocolo para diseñar y desarrollar un dispositivo E-Eye-Enable POCT para detectar Fe, Cr, As y F en muestras ambientales, muestras biológicas y alimentos y bebidas. Se han analizado casi 2000 muestras y los resultados concuerdan con la técnica estándar de oro.

Técnica avanzada de detección E-Eye guiada por TD-DFT para la cuantificación in situ de Fe, Cr, F y As en muestras ambientales, biológicas y alimentarias

Aprende a medir el contenido de hierro en tejidos vegetales mediante el método colorimétrico de Azul de Prusia. Esta técnica precisa permite cuantificar hierro en muestras biológicas de forma sencilla y confiable.

Un método colorimétrico para medir el contenido de hierro en plantas

Explorar más videos