Identificación de los complejos de proteínas en Escherichia coli La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

El objetivo de este experimento es identificar proteínas, interacciones proteicas y la composición de subunidades de complejos MultiPro nativos de E. coli. Esto se logra amplificando los productos de PCR lineal específicos de la secuencia, codificando la etiqueta SPA y un marcador seleccionable, que se integran y expresan en el marco como fusiones terminales carboxilas en un fondo ddy 3, 3 0 utilizando bacterias Sistema de recombinación lambda Fage como segundo paso, la purificación de doble paso se realiza utilizando modlin de vaca y perlas de afinidad Anti-Flag para recuperar de manera eficiente los complejos de proteínas de baja abundancia. A continuación, las proteínas unidas aludidas con modlina de vaca, tampón de elución o CEB se digieren con tripsina y se procesan con espectrometría de masas para la identificación de proteínas.

Los resultados obtenidos muestran que las diversas subunidades de la enzima ARN polimerasa central, incluida la terminación de la transcripción, los factores de antideterminación se purifican de manera eficiente con la proteína de la subunidad D de la ARN polimerasa marcada, lo que indica que los nuevos componentes asociados se pueden descubrir de manera eficiente utilizando este enfoque. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades con dos purificaciones de afinidad redondas, donde el procesamiento cuidadoso de los lisados celulares con soluciones tampón adecuadas es absolutamente necesario para garantizar el éxito en la recuperación eficiente de complejos de carga de baja y alta abundancia de cultivos a gran escala. Este protocolo comienza con la orientación de secuencias amplificadas específicas a la cepa DDY tres 30 en la que se expresa la maquinaria de recombinación de rojo Lambda como se describe en el protocolo escrito.

A continuación, donde las bacterias farge el sistema de recombinación Lambda expresando cepa durante la noche en dos mililitros de medio Luria bati o LB a 32 grados Celsius, agitando a 180 RPM al día siguiente, inocule un mililitro del cultivo durante la noche en 70 mililitros de medio LB fresco en un matraz cónico de 500 mililitros. Cultive el inóculo a 32 grados centígrados agitándolo a 180 RPM hasta que el diámetro exterior de 600 alcance aproximadamente 0,8. Inducir las células incubando el matraz en un baño de agua a 42 grados centígrados agitando suavemente a 180 RPM durante 15 minutos.

Inmediatamente después de la inducción, incubar el matraz en un baño de agua helada durante al menos 30 minutos con agitación. Después de recolectar y lavar las células como se describe en el procedimiento escrito, Reese suspende el pellet de la celda en 700 microlitros de hielo, agua fría y estéril, lo que da como resultado celdas electrocompetentes a través de la electroporación. Introducir un microlitro del amplicón purificado en 40 microlitros de las celdas electrocompetentes.

Las células se electroporan después de la recombinación e integración homólogas. Los transformantes que recombinaron con éxito el casete de barra diagonal en el cromosoma se seleccionan en función de la resistencia a la micina de lata, seleccionan múltiples transformadores para la transferencia occidental para verificar la generación correcta de las proteínas de fusión marcadas con SPA con el anticuerpo Anti-Flag M, dos que es selectivo contra los epítopos bandera de la etiqueta SPA. Transfiera 10 mililitros del cultivo nocturno a 990 mililitros de tuberculosis fresca. Suplementado con 25 microgramos por mililitro de micina en un matraz de cuatro litros.

Cultive el cultivo a 32 grados centígrados con agitación constante a 250 RPM durante cinco a seis horas hasta que el diámetro exterior de 600 alcance entre dos y tres. Transfiera el cultivo de un litro de E. coli SPA a botellas de centrifugación limpias y haga girar las células a cuatro grados Celsius y 3.993 veces G durante 15 minutos. Después de resus suspender las celdas como se describe en el protocolo escrito.

Transfiera las muestras a un recipiente estéril de acero inoxidable colocado sobre hielo para la sonicación. Sumerja la sonda en la muestra y sonique durante tres minutos. Después de la sonicación, espere dos minutos adicionales para enfriar la muestra para evitar el sobrecalentamiento después de la centrifugación del lisado de sonicate.

Transfiera con cuidado el sobrenadante S del tubo de centrifugación a un tubo falcon de polipropileno de 50 mililitros. Congele la muestra con nitrógeno líquido y almacene el extracto de células congeladas sonicadas durante un período máximo de seis meses a menos 80 grados centígrados para su uso futuro. Para comenzar la purificación de la afinidad del extracto de células sonicadas congeladas colocando el tubo en agua fría, incube el extracto de células TH con tres microlitros de benzo, una nucleasa durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

A esta mezcla, agregue el detergente no iónico Triton X 100 y suspensiones de 200 microlitros de Anti-Flag M dos perlas agrícolas. Mezcle suavemente el contenido girando el tubo durante tres horas a cuatro grados centígrados después de tres horas de rotación, centrifugue el tubo a 1, 700 veces G durante seis minutos. Después de la centrifugación, retire con cuidado la mayor cantidad posible de sate sin alterar el pellet de velocidad suelta.

Vuelva a suspender el pellet en el SNA restante y luego transfiéralo a una columna de preparación de polipropileno. Retire los tapones de salida inferiores de la columna para permitir que el eluido drene por gravedad. Fluir. A continuación, lavar la columna cinco veces con 200 microlitros de un tampón FC y proceder a Cleve con TEV como se describe en el protocolo escrito.

Siguiendo la división rápidamente tanto en la parte superior como en la inferior de la columna firmemente. Mezcle suavemente el contenido de la columna girando durante la noche a cuatro grados centígrados después de la rotación durante la noche. Drene el eluido quitando la tapa superior y el tapón inferior en la nueva columna.

Lave la columna vieja con 400 microlitros de un tampón de encuadernación x cal Modlin y 150 microlitros de suspensión de cuentas de encuadernación Cal Modlin. Eluir la proteína unida en cuatro fracciones de 50 microlitros en un tubo de orph eend fresco. Usando un tampón de elución Modlin x cal.

Distribuya la fracción eluida en dos tubos de extremo limpios en volúmenes iguales. A continuación, seque el contenido de ambos tubos con una aspiradora rápida. El eluido seco de un tubo se utiliza para hacer funcionar un gel tintor de plata como se describe en el texto, mientras que el otro se almacena a menos 80 grados centígrados.

Para su uso futuro en espectrometría de masas a la muestra seca, agregue 50 microlitros del tampón de digestión y 0,9 microlitros de ácido clorhídrico tris fosfina de 100 milimolares incube la mezcla durante 45 minutos a temperatura ambiente para el paso de reducción A continuación, agregue un microlitro de acetamida IDO de 500 milimolares e incube en la oscuridad durante otros 40 minutos. Para permitir la alquilación de la muestra Después de la segunda ronda de incubación, agregue un microgramo de viajes a la mezcla. Incubar la muestra a 37 grados centígrados durante cinco horas o toda la noche a temperatura ambiente después de la incubación.

Asegúrese de detener la reacción agregando un microlitro de ácido acético. A continuación, prepare la punta de la cremallera Millipore, la punta de la pipeta como se describe en el texto para una unión eficaz del péptido a la pepita del tubo de la punta. Mezcle la mezcla de péptidos 20 veces y lave la mezcla de péptidos que hizo en la punta aspirando y dispensando la solución de lavado.

Repita este procedimiento dos veces para lograr una unión eficaz de la mezcla de péptidos a la punta con la punta que contiene el péptido unido. Aspire 10 microlitros de la solución de humectación y equilibrio y dispense en un tubo de e-orph limpio. Repita este paso dos veces.

Después de secar las muestras eluidas en un vacío rápido, las muestras pueden analizarse inmediatamente por espectrometría de masas o almacenarse a menos 80 grados Celsius antes de su uso. Las micro columnas utilizadas en este procedimiento están empaquetadas con aproximadamente 10 centímetros de resina lunar C 18 de tres micras y están conectadas a una fuente de iones de electrospray nano pro Zion que se coloca en línea con el instrumento orbitrap. Se utiliza una bomba de HPLC binaria de nanoflujo pro Zion para proporcionar un caudal de punta estable de aproximadamente 300 nanolitros por minuto durante las separaciones de péptidos para lograr la dilución de péptidos, establecer un gradiente de tampón orgánico de acuerdo con la complejidad de la muestra.

Para esta muestra de SPA de E. coli, el disolvente de fase móvil A tiene un 95 % de agua de gradiente de HPLC y un 5 % de aceto nitrilo con un 0,1 % de ácido fórmico, mientras que el disolvente B tiene un 5 % de agua de gradiente de HPLC y un 95 % de aceto nitrilo con un 0,1 % de ácido fórmico después de una búsqueda por espectrometría de masas en los espectros utilizando un algoritmo de búsqueda de bases de datos como SeaQuest contra una base de datos de secuencias de proteínas de E. coli. Filtre estadísticamente el resultado utilizando un algoritmo de probabilidad como Star Quest para garantizar una baja tasa de falsos descubrimientos, tanto el factor sigma de ARN polimerasa marcado con SPA como la proteína yak LA de función desconocida copurificados específicamente con la enzima ARN polimerasa central, incluidas las subunidades alfa beta y beta prima, así como el factor de reciclaje de ARN polimerasa. A diferencia de la ARN polimerasa marcada, el factor sigma yak L se une adicionalmente a un factor de antideterminación esencial para la terminación de la transcripción, lo que sugiere una función especializada en la transcripción.

Varias otras proteínas copurificantes más pequeñas también fueron detectadas por LCMS que no eran evidentes en el gel, incluyendo la subunidad Omega de la ARN polimerasa y los factores de transcripción, terminación y determinación, así como USA y NUSD. Por el contrario, en un experimento independiente etiquetado como movilización de maquinaria de azufre, S-U-F-B-S-U-F-C y SUFD co purificados entre sí, lo que indica una participación conjunta en la biosíntesis del grupo de azufre y hierro como un solo complejo de andamios. Este ejemplo representativo pone de manifiesto el hecho de que los complejos MultiPro bacterianos altamente anotados y bien estudiados anteriormente que participan en procesos biológicos esenciales a menudo tienen nuevos componentes asociados que pueden identificarse de manera eficiente.

Utilizando este enfoque, el bajo número de copias de la proteína SUFB puede haber resultado en una intensidad de señal débil en relación con la intensidad fuerte observada en los experimentos de reducción de SUFC y SUFD para definir la composición de complejos de proteínas de unidades múltiples estables, las puntuaciones de purificación de co se asignaron a interacciones de alta confianza teniendo en cuenta la singularidad de las presas de cebo, cebo cebo y presas relaciones con presas. A continuación, utilice procedimientos de agrupación de grafos, como el algoritmo de agrupación en clústeres de markoff. Los grupos de proteínas discretas se identifican a partir de la red probabilística PPI particionada.

Las redes de interacción putativas se pueden visualizar utilizando cyto scape. La combinación de datos proteómicos con evidencia adicional de asociación funcional inferida por métodos genómicos se puede utilizar para investigar nuevas funciones mecanicistas de las proteínas E. coli previamente anotadas. Aquí, se han definido subredes de complejos de proteínas y módulos funcionales que participan como vecindarios funcionales más amplios en E. coli.

El principal grupo jerárquico Graham muestra los patrones de predicciones funcionales y las anotaciones existentes para los genes funcionalmente huérfanos y caracterizados de E. coli, los colores amarillo y azul representan funciones existentes e inferidas respectivamente, mientras que las intensidades de sombra reflejan puntuaciones de confianza. Los procesos biológicos asociados con varios vecindarios se indican en los recuadros de la derecha, muestran los componentes individuales de un vecindario representativo en función de las puntuaciones de similitud de la red de interacción física y funcional integrada. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se pueden aislar los complejos de proteínas estables de estia Coli utilizando el enfoque de purificación de afinidad junto con espectrometría de masas.

En principio, esta técnica se puede aplicar para caracterizar complejos proteicos de membrana o complejos proteicos de cualquier otra especie para su recombinación en la medida de lo posible.