Name: Identificación de los complejos de proteínas en Escherichia coli La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Aprende a identificar complejos de proteínas en Escherichia coli mediante purificación de afinidad de péptido secuencial combinada con espectrometría de masas tándem. Este método permite recuperar eficientemente complejos de baja abundancia.

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Este trabajo fue financiado con fondos de la Fundación Canadiense para la Innovación, Genoma Canadá, el Instituto de Genómica de Ontario, Ontario el Ministerio de Innovación, y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud de subvención a JG y AE E. Rojo-expresión DY330 coli cepa fue una especie de regalo de Donald L. Corte (National Cancer Institute, Frederick, MD).

1. Construcción de Genes específicos de SPA-tagging en E. DY330 coli cepa <ol><li> El plásmido pJL148 que abarca la secuencia de ADN SPA-tag y el antibiótico kanamicina casete marcador de resistencia (Kan R) se utiliza como una plantilla en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) 7. A 45 nt de genes específicos de cebador directo, que se encuentra inmediatamente aguas arriba del codón de parada del gen diana en el marco con un 27 bp (&#39;5&#39;-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) tag cebador específico, y un 45 nt de genes específicos de cebador inverso, situado inmediatamente abajo del codón de parada del gen diana en el marco con un pb 27 (5&#39;-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 &#39;) cebador inverso etiqueta específica, se usan para amplificar el SPA-tag y casete Kan R de la pJL148 utilizando las siguientes condiciones de ciclo de PCR: 94 ° C durante 5 min, 30 ciclos de 94 ° C por 1 min, 55 ° C durante 1 min, 68 ° C durante 2 min 10 seg, seguido de 68 ° C durante 10 min. Estas secuencias amplificadas servir uns sustratos para la ectópica introducido λ-Rojo maquinaria de recombinación homóloga (véase a continuación). </li><li> El producto de PCR se purifica utilizando un kit de purificación de PCR QIAquick para eliminar las sales que pueden interferir con la electroporación. El producto de PCR purificado es posteriormente dirigida a integrar en el extremo 3 &#39;(inmediatamente aguas arriba del codón de parada nativa) de un gen específico en DY330 cepa en la que se expresa el λ-Rojo maquinaria de recombinación 10. </li><li> El DY330 λ-Red cepa que expresa se cultivaron durante la noche en 2 ml de medio Luria-Bertani (LB) a 32 ° C con agitación a 180 rpm. 1 ml del cultivo durante toda la noche posteriormente se inocularon en 70 ml de medio LB fresco en 500 ml matraz cónico. El inóculo se cultivaron a 32 ° C con agitación a 180 rpm hasta que la DO 600 alcanza ~ 0,8. </li><li> El cultivo se transfirió a un nuevo matraz de 250 ml cónico, donde las células son inducidas mediante la incubación el matraz en un baño de agua a 42 ° C agitando suavemente en180 rpm durante 15 min. Inmediatamente después de la inducción, el matraz se incuba en un baño de hielo suspensión en agua durante al menos 30 min con agitación. </li><li> El cultivo enfriado con hielo se transfiere inmediatamente en pre-refrigerada 50 ml tubo de polipropileno y se sometieron a centrifugación a 3.993 xg durante 6 min a 4 ° C. El sedimento celular se resuspendió en 50 ml de helado de agua estéril y se centrifugaron de nuevo a 3.993 xg durante 6 min a 4 ° C. El sedimento de células se resuspende en 1 ml de agua fría y se transfirió a un tubo de 1,5 ml Effendorf, y se centrifugó a velocidad máxima durante 20 segundos a 4 ° C. Después de dos o tres etapas de lavado con agua fría de hielo, el precipitado celular se resuspendió finalmente en 700 l de agua enfriada con hielo estéril, resultando en electro-competentes células. </li><li> A través de la electroporación, una l de la amplicón purificado se introduce en 40 l de las células electro-competentes. Las células se someten a electroporación en un II Bio-Rad GenePulser con los siguientes ajustes: 2,5 kV, 25 mF con pulsocontrolador de 200 Ω. Después de la recombinación homóloga y la integración, los transformantes que recombinados con éxito la etiqueta / casete en el cromosoma se seleccionan basándose en la resistencia a Kan (Figura 1A). Varios transformantes se seleccionan para el Western Blot para verificar la correcta generación (es decir, la señal positiva) de SPA-etiquetados proteínas de fusión con anticuerpos anti-FLAG M2 que es selectivo contra los epítopos bandera de la SPA-tag. </li><li> Confirmado carboxi terminal SPA-tag cepa de fusión se cultivaron en una gran escala para aislar complejos proteína soluble a partir de células cosechadas utilizando el protocolo de purificación de SPA. El esquema de los pasos implicados en el procedimiento de purificación por afinidad etiqueta se muestra en la Figura 1B. </li></ol> 2. El cultivo y la sonicación <ol><li> Inocular 100 l de una E. SPA-etiquetado Imágenes coli glicerol en 50 ml de caldo Terrific (TB) medio líquido suplementado con 50 l de 25 mg / ml of Kan solución en un matraz cónico de 250 ml. Mantener el cultivo durante la noche a 32 ° C. Nota: Puesto que el casete λ temperatura inducible Red en la cepa DY330 está bajo el control de un represor sensible a la temperatura 10, la cepa SPA-etiquetados E. coli se hace crecer a 32 ° C. </li><li> Transferir 10 ml del cultivo durante la noche en 990 ml de TB fresco suplementado con 25 g / ml de Kan en un matraz de 4 litros. El cultivo se hace crecer a 32 ° C con agitación constante a 250 rpm, durante 5 a 6 horas, hasta que la DO 600 alcanza a ~ 2 a 3. </li><li> Transferir el 1 litro E. coli SPA-etiqueta cultura para limpiar botellas de centrifugación y centrifugar las células a 4 º C en Beckman J6-HC centrífuga @ 3993 xg durante 15 min. </li><li> El sobrenadante se elimina de las botellas de centrifugación. Resuspender el E. gránulos coli células con 25 ml de tampón de sonicación. Asegúrese de mantener las botellas de centrifugación sobre hielo en todo momento. </li><li> El precipitado resuspendido setransferido a 50 ml de polipropileno tubo Falcon y se congelan con nitrógeno líquido. Las células congeladas se almacenan a -80 ° C para uso a largo plazo. </li><li> Antes de la sonicación, las células congeladas descongelar completamente, manteniendo los gránulos en hielo. Las muestras descongeladas se transfirió a un vaso de acero inoxidable estéril colocó en hielo durante la sonicación. La sonda se sumerge en la muestra y se sonicó durante 3 min. Un adicional de 2 min se deja enfriar la muestra del sobrecalentamiento. </li><li> El lisado celular sonicado se transfiere en el tubo de centrifugación pre-refrigerada estéril, y se sometió a centrifugación a 4 ° C en una centrífuga Beckman usando un rotor JA-17 @ 35.267 xg (16.000 rpm) durante 15 min dos veces. Nota: En el caso de la purificación de proteínas de membrana, el lisado celular sonicado se centrifuga sólo una vez durante 15 min, ya que no sabe en qué fracción de las proteínas de membrana son, es decir, ya sea en el sedimento o en la fracción sobrenadante. Así que para evitar pérdida excesiva de memproteínas de membrana, hacemos girar las células durante 15 min a centrifugación a alta velocidad y el sobrenadante se procesa posteriormente para la purificación (ver pasos abajo) donde el 1% se usa un detergente para solubilizar las proteínas de la membrana. </li><li> El sobrenadante de la centrifugación en tubo se transfiere cuidadosamente a un tubo de 50 ml de polipropileno Falcon y se congelaron con nitrógeno líquido. El extracto sonicado de células congeladas se almacena durante un período máximo de 6 meses a -80 ° C para su uso futuro. </li></ol> 3. Purificación por afinidad <ol><li> Antes de su uso, 100 l de anti-FLAG M2 perlas se lavan por 10 volúmenes de tampón de AFC (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% de detergente, y 0.1-0.5 mM TCEP [tris (2-carboxietil) fosfina - ácido clorhídrico]) sin el detergente y el agente reductor de TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina). </li><li> El extracto congelado, sonicado celular se descongela colocando el tubo en agua fría. El extracto de células descongeladas se incubaron con 3 l de benzonase nucleasa durante 30 min a 4 ° C. A esta mezcla, agregar un detergente no iónico Triton X-100 (concentración final del detergente debe ser 0,1%) y 200 l de suspensiones anti-FLAG M2 perlas de agarosa. Nota: Para todas las purificaciones de proteína soluble, 0,1% de Triton X-100 se utiliza para minimizar la adsorción no específica, mientras que para la purificación de una proteína de membrana, diferentes suaves detergentes no iónicos, tales como C12E8 (éter de octaetilenglicol dodecil glicol), DDM ( n-dodecil-β-D-maltósido) y maltosa-neopentilglicol (MNG) se puede utilizar en una concentración de detergente 1% para mejorar la solubilización. Ya que los detergentes diferentes tienen diferentes eficiencia de solubilización de proteínas de membrana, se recomienda llevar a cabo purificaciones independientes de proteínas utilizando más de un detergente. </li><li> El contenido se mezcla suavemente haciendo girar el tubo durante 3 horas a 4 ° C usando un agitador de LabQuake. Después de 3 horas de rotación, el tubo se centrifugó a 1.700 xg durante 6 min. El sobrenadante es entonces removed cuidadosamente, tanto como sea posible, sin perturbar el sedimento suelto perla. </li><li> El sedimento se resuspende en el sobrenadante restante y luego se transfiere a un 0,8 x 4 cm de columna Bio-Rad polipropileno prep. Asegúrese de quitar los tapones de salida inferior de la columna, para permitir que los eluatos para drenar por gravedad. Lavar la columna con 5 veces el paso de escisión TEV. </li><li> Después de drenar los eluatos lavados, la salida del fondo de la columna está cerrado. Para la misma columna, la escisión se lleva a cabo mediante la adición de ~ 5 a 10 l (50 unidades) de la proteasa TEV y 400 l de 1X tampón de AFC en la columna. Asegúrese de cerrar la parte superior de la columna con una tapa. La columna que contiene las perlas se gira suavemente durante la noche a 4 ° C durante la noche usando un agitador LabQuake. </li><li> Quitar el tapón en la parte superior y el tapón de salida en la parte inferior de la columna, y la fuga de los eluatos recuperados después de la escisión TEV en una columna reciente que contenía 200 l de suspensiones calmodulina-sepharose bolas, que se lava por 10volúmenes de tampón de unión a calmodulina. </li><li> Tanto la parte superior y la parte inferior de la columna se sujetan firmemente, y el contenido de la columna se mezcló suavemente por rotación durante 3 horas a 4 ° C usando un agitador de LabQuake. </li><li> Después de 3 horas de rotación, el eluato se drena mediante la eliminación de la tapa superior y el tapón de fondo de la columna. La columna se lava cuatro veces con 200 l de 1X tampón de unión a calmodulina seguido por un lavado riguroso con 400 l de tampón de lavado calmodulina. </li><li> La proteína unida se eluyó en cuatro fracciones de 50 l en un tubo Eppendorf usando 1X tampón de elución calmodulina. La fracción eluida se distribuye en dos tubos Eppendorf limpios en volúmenes iguales. Tanto los tubos se secan posteriormente usando un vacío de velocidad. </li><li> El eluato se secó de un tubo se utiliza para el funcionamiento de un gel de tinción de plata, mientras que la otra se almacena en -80 ° C, antes de usar la espectrometría de masas. </li></ol> 4. Silver Staining <ol><li> Para la plata staining, la mitad del volumen de 3X SDS (dodecil sulfato sódico) tampón de muestra se añade a 50 l de eluato se secó. Después de hervir la mezcla durante 5 min, las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida SDS. </li><li> Después de que el gel ha finalizado la ejecución, que se coloca cuidadosamente en la solución de fijación (50% de metanol y 10% de ácido acético) y se agitó suavemente en un agitador rotatorio durante 20 min. El gel después se enjuaga con 20% de etanol durante 10 min. </li><li> El gel fijo se lava dos veces a fondo con 500 ml de agua doblemente destilada durante 10 minutos para asegurar fondo uniforme bajo. </li><li> Después el gel se agitó suavemente en 500 ml de tiosulfato de sodio durante 1 min, seguido por dos etapas de lavado con agua destilada durante 20 segundos. </li><li> El agua se elimina, y el gel se incuba en 200 ml de nitrato de plata 0,1% durante 30 min. Después de ese tiempo, el nitrato de plata se retira y se lava el gel con agua destilada durante 20 segundos para eliminar el exceso de nitrato de plata. </li><li> El gel es finalmente a mano agita en 75 mlde la solución de revelado. Cuando la intensidad deseada, la solución de revelado se descarta y 80 ml de ácido acético se añade para detener la reacción. Asegúrese de incubar el gel en ácido acético durante un mínimo de 20 min para la correcta visualización de bandas de gel. </li></ol> 5. La proteólisis y preparación de muestras para espectrometría de masas <ol><li> Para la muestra seca, se añaden 50 l de tampón de digestión y 0,9 l de 100 mM TCEP-HCl (tris (2-carboxietil) fosfina - ácido clorhídrico) y se incuba la mezcla durante 45 min a temperatura ambiente para la etapa de reducción. A continuación, 1 l de yodoacetamida 500 mM y se incuba en la oscuridad durante 40 min adicionales para permitir la alquilación de la muestra. </li><li> Después de la segunda ronda de la incubación, añadir 1 g de tripsina inmovilizada a la mezcla e incubar bien a 37 ° C durante 5 horas o durante la noche a temperatura ambiente. Asegúrese de detener la reacción mediante la adición de 1 l de ácido acético. </li><li> Humedecer previamente el Millipore Zip-Tip punta de pipeta de aspiración 10 l de la solución humectante y equilibrado. Vierta la solución a los residuos. Posteriormente aspirar 10 l de la solución de lavado y dispensar la solución a los residuos. Repita este paso dos veces. </li><li> Para una unión eficaz de la mezcla de péptidos a la punta, pipeta mezclar la mezcla de péptidos 20 veces. La mezcla de péptidos que se adhería a la punta es lavado por aspiración y dispensación de la solución de lavado. Repita este procedimiento dos veces para una unión eficiente de la mezcla de péptidos a la punta. </li><li> Con la punta que contiene el péptido unido, aspire 10 l de la solución humectante y la equilibración, y se distribuye en un tubo eppendorf limpio. Repita este paso dos veces. Después de secar las muestras eluidas en vacío velocidad, las muestras pueden ser analizadas por espectrometría de masas inmediatamente o se almacenaron a -80 ° C antes de su uso. </li></ol> 6. Identificación de proteínas por LTQ Velos Orbitrap Espectrómetro de Masas Thcomponentes electrónicos de polipéptidos de los complejos aislados se identifican utilizando una Orbitrap LTQ Velos híbrido espectrómetro de masas en tándem. El Orbitrap tiene una potencia excepcional resolver (&gt; 60.000 Máximo completa Media Ancho, o FWHM) y exactitud de la masa (&lt;2 ppm) que minimiza MS / MS de muestreo de irrelevantes contaminantes de fondo no específicas detectadas en purificaciones de control, mientras que la velocidad alta Velos trampa de iones componente puede detectar y péptidos fragmento baja abundancia utilizando tanto la transferencia de electrones y la disociación inducida por colisión modos de disociación. Partidos de alta confianza entre resultante MS / MS espectros de referencia se asignan a E. secuencias de proteínas coli utilizando el algoritmo de búsqueda de base de datos como SEQUEST y cada secuencia correspondiente evaluados durante un algoritmo de probabilidad como STATQUEST 11. El número total de espectros, la singularidad y la secuencia de péptidos contaminantes comunes fondo detectados en el control negativo (es decir. Simulado) purificaciones son consideradas para lograr la máxima empírico falso disdescubrimiento tasa. Los siguientes pasos se realizan para la identificación de proteínas: <ol><li> Las columnas micro-se embalan con ~ 10 cm de 3 m Luna C-18 de resina y están interconectados a una fuente de iones de nanoelectropulverización Proxeon que se coloca en línea con el instrumento Orbitrap. </li><li> Un Proxeon flujo binario nano HPLC bomba se utiliza para proporcionar una velocidad de punta de flujo estable de ~ 300 nl min -1 durante las separaciones de péptidos. </li><li> Para conseguir la elución de péptidos, un gradiente de tampón orgánico se establece de acuerdo a la complejidad de la muestra. Por ejemplo, el siguiente gradiente normalmente se configura para E. muestras coli SPA: disolvente B se aumentó de 2% a 6% en 1 min, a 24% en 38 min, a 100% en los próximos 4 min, se mantuvo a 100% durante 1 min, y luego se redujo a 2% en 1 min, y final de mantener a 2% durante 15 min. La fase móvil disolvente A tiene 95% HPLC gradiente de agua y 5% de ACN con 0,1% de ácido fórmico, mientras que el disolvente B tiene 5% HPLC gradiente de agua y 95% de ACN con fórmico 0,1% acid. La velocidad de flujo en la punta de la aguja se establece en -1 300 nl min durante 60 min. </li><li> A medida que los ciclos del espectrómetro de masas ejecutar a través de un ciclo completo de masas en 60.000 resoluciones, 10 concomitantes tándem escaneos masivos de fragmentación son recogidos por los iones precursores más intensos. Exclusión dinámico, selección masal monoisotópico, y en tiempo real los datos que dependen de características del instrumento de adquisición han sido habilitadas. </li><li> Los espectros se buscan utilizando un algoritmo de búsqueda de bases de datos tales como SEQUEST contra una base de datos de E. coli secuencias de proteínas, y el resultado es estadísticamente filtrada utilizando un algoritmo de probabilidad como STAQUEST 11 para garantizar una baja tasa de falsos descubrimiento. Sólo los candidatos de confianza alto (99% de probabilidad) se seleccionan, mientras que los partidos que muestra más de 10 ppm de masa de error en comparación con la masa del péptido teórico se eliminaron de otros estudios. </li></ol>

<ol><li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, e1000096(2009).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Un aspecto clave del enfoque basado en SPA APMS descrito aquí es que el marcado se realiza en el contexto cromosómico natural, garantizando así la regulación de genes normales se mantiene (es decir. Cebo promotor nativo conserva, por lo tanto, los niveles de expresión no es perturbado) y nativo de manera estable asociada a complejos de proteínas se recuperan casi a los niveles endógenos. Cuestiones operón polaridad también se evitan mediante la inclusión de un promotor orientada hacia fuera en el marcador selec...

<table><tbody><tr><td colspan="4">I. Antibióticos</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Bioshop</td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bioshop</td><td>#AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Terrific-Caldo medio</fuerte></td></tr><tr><td>Bio-Tryptone</td><td>Bioshop</td><td>#TRP 402</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Bioshop</td><td>#YEX 555</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>#GLY 002</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 302</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 303</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. Cepa bacteriana y plásmido</td></tr><tr><td>DY330</td><td></td><td>Yu et al. (2000)10</td><td></td></tr><tr><td>pJL148</td><td></td><td>Zeghouf et al. (2004)7</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Reactivos de PCR y Electroforesis</fuerte></td></tr><tr><td>Taq ADN polimerasa</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 X tampón PCR</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTPs</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl2</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Cargando colorante</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>10X Tampón TBE</td><td>Thermo Scientific</td><td>#28355</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bioshop</td><td>#TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Bioshop</td><td>#BOR001</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Sigma</td><td># E6768</td><td></td></tr><tr><td>escalera de ADN</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">5. Kits de aislamiento y limpieza de plásmidos</td></tr><tr><td>Plasmid kit Midi</td><td>Qiagen</td><td>#12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">6. Equipos de PCR y Transformación</fuerte></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>BioRad</td><td>iCycler</td><td></td></tr><tr><td>Electroforesis en gel de agarosa</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporador</td><td>Bio-Rad</td><td>GenePulser II</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de electroporación de 0,2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &deg; C agitador</td><td></td> de baño de agua <td>Innova 3100</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Centrífuga TJ-25</td><td>Beckman Coulter</td><td>TS-5.1-500</td><td></td></tr><tr><td>32 &deg; C Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, EE. UU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>. 32 &deg; C grande Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, EE.UU</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>32 &deg; Incubadora de placa C</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">7. Electroforesis y Western blot</</td></tr><tr><td>monómero >acrilamida fuerte, N,N'-metilenobis-acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0125</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Bioshop</td><td># AMP001</td><td></td></tr><tr><td>n-butanol</td><td>Sigma</td><td># B7906</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bioshop</td><td>#TEM001</td><td></td></tr><tr><td>Whatman No. 1 papel de filtro</td><td>Fischer Scientific</td><td>#09-806A</td><td></td></tr><tr>Dispositivo de transferencia de gel <td>Mini protean de 3 células</td><td>Bio-Rad</td><td>#165-3301</td><td></td></tr><tr><td>iBlot</td><td>Invitrogen</td><td>#IB1001</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de nitrocelulosa</td><td>Bio-Rad</td><td>#162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal Anti-Flag M2</td><td>Sigma</td><td>#F3165</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidasa de rábano picante</td><td>Amersham</td><td>#NA931V</td><td></td></tr><tr><td>Pre-teñido Patrones de peso molecular de proteínas</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0363</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de quimioluminiscencia</td><td>PIERCE</td><td>#1856136</td><td></td></tr><tr><td>Película de autorradiografía</td><td>Clonex Corp</td><td>#CLEC810</td><td></td></tr><tr><td>papel secante Quick Draw Sigma</td><td></td><td>#P7796</td><td></td></tr><tr><td>C2 agitador mecedora de plataforma</td><td>New Brunswick Scientific, EE. UU</td><td></td><td></td></tr>.<<tr>td colspan="4"><fuerte>8. Equipos de sonicación y reactivos</fuerte></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Ultrasonic</td><td>#23395</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>#SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidores de la proteasa</td><td>Roche</td><td>#800-363-5887</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM TCEP-HCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>#20490</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">9. Reactivos y equipos de purificación por afinidad</fuerte></td></tr><tr><td>0,8 x 4 cm Columna de polipropileno Bio-Rad</td><td>Bio-Rad</td><td>#732-6008</td><td></td></tr><tr><td>Benzonasa nucleasa</td><td>Novagen</td><td>#70746</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 perlas de agarosa</td><td>Sigma</td><td>#A2220</td><td></td></tr><tr><td>Calmodulina-sefarosa</td><td>GE Healthcare</td><td>#17-0529-01</td><td></td></tr><tr><td>TEV proteasa</td><td>Invitrogen</td><td>#12575-015</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>#T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>#C2661</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>#E3889</td><td></td></tr><tr><td>LabQuake Shaker</td><td>Thermolyne</td><td>#59558</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">10. Reactivos de tinción de plata</fuerte></td></tr><tr><td></td><td>Metanol Bioshop</td><td>#MET302</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Bioshop</td><td>t#ACE222</td><td></td></tr><tr><td>Tiosulfato de sodio</td><td>Sigma</td><td>#S-7143</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de plata</td><td>Fischer Scientific</td><td>#S181-100</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Bioshop</td><td>#FOR201</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato</td> <td>de sodioBioshop</td><td>#SOC512</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">11. Reactivos y equipos para la identificación de proteínas </Oro ></td></tr> <tr><td>tripsina fuerte, espectrometría de masas grado</td><td>Promega</td><td># V5280</td><td></td></tr><tr><td>50 mM NH4HCO3</td><td>Bioshop</td><td>#AMC555</td><td></td></tr><tr><td>1 mM CaCl2</td><td>Bioshop</td><td>#CCL302</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma</td><td>#A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Formic ácido</td><td>Sigma</td><td>#F0507</td><td></td></tr><tr><td>agua de grado HPLC</td><td>Sigma</td><td>#95304</td><td></td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>Sigma</td><td>#16125</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Zip-Tip</td><td>Millipore</td><td># ZTC18M960</td><td></td></tr><tr><td>~10 cm de 3 &mu; m Resina Luna-C18</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proxeon nano Bomba de HPLC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos espectrómetro</td><td></td><td>de masas Thermo Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">12. Material de laboratorio</resistente></td></tr><tr><td>Matraces cónicos de 4 litros</td><td>VWR</td><td>#89000-372</td><td></td></tr><tr><td>Tubos halcón de polipropileno de 50 ml</td><td>Cualquier proveedor Tubos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flaks cónicos de 250 ml</td><td>VWR</td><td>#29140-045</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo estériles de 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>#366052</td><td></td></tr><tr><td>Viales criogénicos</td><td>VWR</td><td>#479-3221-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C congelador</td><td>Fisher Scientific</td><td>#13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de vacío de velocidad</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Buffers and Solutions 1. 1 litro de caldo fantástico (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g Extracto de levadura 2% Glycerol 50 ml de caldo de sal potásica solución 2. Solución madre de sal de potasio 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3. Tampón de sonicación 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 10% Glycerol Antes de usar, agregue inhibidor de la proteasa (PI) y 0,1-0,5 mM TCEP 4. Tampón AFC 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,1% detergente Antes de usar, agregue PI y 0,1-0,5 mM TCEP 5. Tampón de escisión TEV 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 0,1% detergente Antes de usar, añadir PI y 0,1-0,5 mM TCEP 6. Tampón de unión a calmodulina 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% detergente Antes de usar, agregue PI y 0.1-0.5 mM TCEP 7. Tampón de lavado de calmodulina 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8. Tampón de elución de calmodulina 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9. Solución en desarrollo (1L) 37% Formaldehído 30 g de carbonato de sodio 1000 ml de agua destilada 10. Tampón de digestión 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Solución de humectación y equilibrio 70% acetonitrilo (ACN) en ácido fórmico al 0,1% 12. Solución de lavado 100% H2O en ácido fórmico al 0,1%</td></tr></tbody></table>

identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; escherichia coli</em&gt; la purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Como la mayoría de los procesos celulares están mediadas por las asambleas macromoleculares, la identificación sistemática de las interacciones proteína-proteína (PPI) y la identificación de la composición de la subunidad de multi-proteína complejos pueden dar una idea de la función de genes y mejorar la comprensión de los sistemas biológicos 1, 2. Interacciones físicas se pueden mapear con alta confianza vialarge escala aislamiento y caracterización de complejos de proteínas endógenas en condiciones próximas a las condiciones fisiológicas basado en la purificación por afinidad de proteínas cromosómicamente etiquetados en combinación con espectrometría de masas (APMS). Este enfoque ha sido aplicado con éxito en diversos organismos evolutivamente, incluyendo levaduras, moscas, gusanos, células de mamíferos, bacterias y 1-6. En particular, hemos generado una afinidad carboxi-terminal del péptido secuencial (SPA) Sistema de marcado doble para los complejos de purificación por afinidad de proteínas nativas de cultivos de bacterias gram-negativas Escherichia coli, utilizando genetically-tratables cepas huésped de laboratorio que están bien adaptados para todo el genoma investigaciones de la biología fundamental y los procesos conservados de procariotas 1, 2, 7. Nuestro SPA-tagging sistema es análogo al método de purificación de afinidad en tándem desarrollado originalmente para la levadura 8, 9, y consta de un péptido de unión a calmodulina (CBP), seguido por el sitio de escisión para la proteasa altamente específica tabaco etch virus (TEV) y tres copias del epítopo FLAG (FLAG 3X), permitiendo por dos rondas consecutivas de enriquecimiento de afinidad. Después de la amplificación casete, específicas de secuencia lineales productos de PCR que codifican el SPA-tag y un marcador seleccionable se integran y se expresa en marco como carboxi-terminal de fusiones en un fondo DY330 que es inducida para expresar transitoriamente un muy eficiente sistema de recombinación heteróloga bacteriófago lambda 10. Posterior de doble etapa de purificación usando calmodulina y anti-FLAG perlas de afinidad permite que el altamente selectivoy la recuperación eficaz de incluso complejos de baja abundancia de proteínas de cultivos a gran escala. La espectrometría de masas se utiliza para identificar los purificadores de manera estable co-proteínas con alta sensibilidad (bajos límites de detección de nanogramos). A continuación, describimos detalladas paso a paso los procedimientos que comúnmente se utilizan para el etiquetado sistemático de proteínas, purificación y espectrometría de masas basado en el análisis de complejos de proteínas solubles de E. coli, que pueden ser ampliadas y potencialmente adaptado a otras especies bacterianas, incluyendo ciertos patógenos oportunistas que son susceptibles de recombinería. Las interacciones físicas resultantes a menudo pueden revelar interesantes componentes y conexiones inesperadas que sugieren nuevos enlaces mecánicos. La integración de los datos de PPI con alternativas datos de la asociación molecular, tales como genéticos (gen-gen) las interacciones y el contexto genómico-(GC) predicciones pueden facilitar la elucidación de la organización mundial molecular de los complejos multi-proteína dentro de bivías metodológicas. Las redes generadas por E. coli se puede utilizar para obtener una perspectiva de la arquitectura funcional de los productos de genes ortólogos en otros microbios para que las anotaciones funcionales están faltando.

Una vez que las proteínas cebo marcadas, expresadas a niveles endógenos, se purificaron por afinidad a partir de cultivos en fase logarítmica, las muestras se separaron en un gel teñido con plata para visualizar los componentes individuales de polipéptidos de los complejos estables aislados. También sometimos una segunda porción de las muestras proteicas purificadas por afinidad a espectrometría de masas en tándem sin gel (LCMS) para identificar las secuencias de polipéptidos correspondientes. La eficacia de este procedi...

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la bacteria<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Que se puede utilizar para aislar y caracterizar proteínas estables de múltiples complejos a cerca de homogeneidad incluso partiendo de bajo número de copias por célula.

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

El objetivo de este experimento es identificar proteínas, interacciones proteicas y la composición de subunidades de complejos MultiPro nativos de *E. coli*. Esto se logra amplificando productos lineales de PCR específicos de secuencia, que codifican la etiqueta SPA y un marcador seleccionable, los cuales se integran y expresan en marco como fusiones en el extremo carboxi terminal en un fondo ddy 3, 3 0 utilizando el sistema de recombinación bacteriana Fage lambda. Como segundo paso, se realiza una purificación dual empleando perlas de afinidad de cow modlin y Anti-Flag para recuperar eficazmente complejos proteicos de baja abundancia. A continuación, las proteínas retenidas se eluyen con buffer de elución de cow modlin o CEB, se digieren con tripsina y se procesan mediante espectrometría de masas para la identificación de proteínas.Los resultados obtenidos muestran que varias subunidades de la enzima de ARN polimerasa central, incluidos los factores de terminación de la transcripción y de anti-determinación, copurificaron eficientemente con la proteína etiquetada de la subunidad D de la ARN polimerasa, lo que indica que los nuevos componentes asociados pueden identificarse eficazm

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe una nueva técnica de proteómica cuantitativa para la identificación de complejos de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. En este estudio, hemos utilizado el método de SILAC junto con la purificación de afinidad seguida de espectrometría de masas para identificar con una alta especificidad de la unión de compañeros de una proteína del RE, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Tandem purificación de afinidad es un enfoque sólido para la identificación de socios de la unión a proteínas. Como prueba de concepto, esta metodología se aplicó a la traducción factor eIF4E bien caracterizado iniciación a co-precipitado los factores implicados en la célula huésped iniciación de la traducción. Este método se adapta fácilmente a cualquier proteína celular o viral.

Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

Este video muestra la purificación por afinidad en tándem, una técnica para purificar complejos de proteínas de células eucariotas para estudiar la interacción proteína-proteína. El complejo contiene dos proteínas marcadas con diferentes etiquetas de epítopos. Tras la purificación del complejo utilizando dos resinas con afinidad por las dos marcas diferentes de forma secuencial, la presencia de ambas proteínas en el eluido confirma la interacción entre ambas.

Ensayo de purificación de afinidad en tándem para estudiar las interacciones proteína-proteína

Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Describimos aquí un novedoso, robusto y eficiente método de purificación de afinidad en tándem (TAP) para la expresión, aislamiento y caracterización de complejos de proteínas de células eucariotas. Este protocolo podría utilizarse para la caracterización bioquímica de complejos discretos, así como para la identificación de nuevos interactores y modificaciones postraduccionales que regulen su función.

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Las interacciones proteína-proteína y proteína-metabolito son cruciales para todas las funciones celulares. Adjunto, describimos un protocolo que permite el análisis paralelo de estas interacciones con una proteína de elección. Nuestro protocolo fue optimizado para cultivos de células vegetales y combina la purificación de la afinidad con la proteína basada en espectrometría de masa y detección de metabolitos.

2 en 1: purificación de la afinidad para el análisis paralelo de proteínas y complejos de proteína-metabolito de un solo paso

Aquí presentamos un protocolo para supervisar el montaje y desmontaje de la toxina del ántrax mediante interferometría de la biocapa (BLI). Tras el montaje y desmontaje en la superficie del biosensor, los complejos de proteínas grandes son liberados de la superficie para la visualización e identificación de componentes de los complejos usando microscopia electrónica y espectrometría de masas, respectivamente.

Análisis complejos de la proteína dinámica montan en y de interferometría de biocapa Biosensor usando espectrometría de masas y microscopia electrónica

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

Aquí presentamos un protocolo para la identificación rápida de proteínas producidas por bacterias patógenas secuenciadas genómicamente utilizando espectrometría de masas en tándem MALDI-TOF-TOF y análisis proteómico de arriba hacia abajo con software desarrollado internamente. Los iones proteicos metaestables se fragmentan debido al efecto del ácido aspártico y esta especificidad se explota para la identificación de proteínas.

Identificación de proteínas de inmunidad antibacteriana en Escherichia coli utilizando MALDI-TOF-TOF-MS/MS y análisis proteómico de arriba hacia abajo

Aprende a identificar complejos de proteínas en Escherichia coli mediante purificación de afinidad de péptido secuencial combinada con espectrometría de masas tándem. Este método permite recuperar eficientemente complejos de baja abundancia.

Identificación de los complejos de proteínas en Escherichia coli La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem (Video) | JoVE Journal

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