Identificación de los complejos de proteínas en

El objetivo de este experimento es identificar proteínas, interacciones proteicas y la composición de subunidades de complejos MultiPro nativos de *E. coli*. Esto se logra amplificando productos lineales de PCR específicos de secuencia, que codifican la etiqueta SPA y un marcador seleccionable, los cuales se integran y expresan en marco como fusiones en el extremo carboxi terminal en un fondo ddy 3, 3 0 utilizando el sistema de recombinación bacteriana Fage lambda. Como segundo paso, se realiza una purificación dual empleando perlas de afinidad de cow modlin y Anti-Flag para recuperar eficazmente complejos proteicos de baja abundancia. A continuación, las proteínas retenidas se eluyen con buffer de elución de cow modlin o CEB, se digieren con tripsina y se procesan mediante espectrometría de masas para la identificación de proteínas.

Los resultados obtenidos muestran que varias subunidades de la enzima de ARN polimerasa central, incluidos los factores de terminación de la transcripción y de anti-determinación, copurificaron eficientemente con la proteína etiquetada de la subunidad D de la ARN polimerasa, lo que indica que los nuevos componentes asociados pueden identificarse eficazmente mediante este enfoque. En general, las personas nuevas en este método podrían tener dificultades con las dos rondas de purificación por afinidad, en las que el procesamiento cuidadoso de los lisados celulares con soluciones de tampón adecuadas es absolutamente necesario para garantizar el éxito en la recuperación eficiente de complejos con baja y alta abundancia a partir de cultivos a gran escala. La demostración de los procedimientos de purificación por afinidad y espectrometría de masas la realizarán Olga Kagan y HBO guo, dos técnicas en mi laboratorio. Este protocolo comienza con la introducción de secuencias amplificadas específicas a la cepa DDY tres 30, en la cual la maquinaria de recombinación Lambda red se expresa según se describe en el protocolo escrito.

A continuación, siembra la cepa que expresa el sistema de recombinación bacteriano fage Lambda durante la noche en dos mililitros de medio Luria bati o medio LB a 32 grados Celsius, agitando a 180 RPM. Al día siguiente, inocular un mililitro de la cultura nocturna en 70 mililitros de medio LB fresco en un matraz cónico de 500 mililitros. Incubar el inóculo a 32 grados Celsius con agitación a 180 RPM hasta que la DO 600 alcance aproximadamente 0,8. Inducir las células incubando el matraz en un baño de agua a 42 grados Celsius con agitación suave a 180 RPM durante 15 minutos.

Inmediatamente después de la inducción, incubar el matraz en un baño de hielo con agua durante al menos 30 minutos con agitación. Después de recolectar y lavar las células según se describe en el procedimiento escrito, Reese suspende el botón celular en 700 microlitros de agua estéril, fría con hielo, obteniendo así células electrocompetentes mediante electroporación. Introducir un microlitro del amplicón purificado en 40 microlitros de las células electrocompetentes.

Las células se electropermean tras la recombinación homóloga y la integración. Los transformantes que recombinaron con éxito el cassette de marcador en el cromosoma se seleccionan en función de la resistencia a la canamicina; seleccione múltiples transformantes para inmunotransferencia con el fin de verificar la generación correcta de las proteínas de fusión marcadas con SPA mediante el anticuerpo Anti-Flag M2, que es específico contra los epítopos Flag del marcador SPA. Transfiera 10 mililitros de la cultura nocturna a 990 mililitros de medio TB fresco suplementado con 25 microgramos por mililitro de canamicina en un matraz de cuatro litros.

Cultive el cultivo a 32 grados Celsius con agitación constante a 250 RPM durante cinco a seis horas hasta que la DO 600 alcance entre dos y tres. Transfiera el cultivo de una litro de etiqueta SPA de E. coli a botellas de centrifugación limpias y centrifugue las células a cuatro grados Celsius y 3.993 × g durante 15 minutos. Después de resuspender las células como se describe en el protocolo escrito.

Transfiera las muestras a un vaso estéril de acero inoxidable colocado sobre hielo para la sonicación. Sumerja la sonda en la muestra y sométala a sonicación durante tres minutos. Tras la sonicación, espere dos minutos adicionales para enfriar la muestra y evitar el sobrecalentamiento, tras la centrifugación del lisado sonicado.

Transfiera cuidadosamente el sobrenadante S desde el tubo de centrifugación a un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros. Congele la muestra utilizando nitrógeno líquido y almacene el extracto celular sonicado congelado durante un período máximo de seis meses a menos 80 grados Celsius para su uso futuro. Para iniciar la purificación por afinidad del extracto celular sonicado congelado, coloque el tubo en agua fría e incube el extracto de células TH con tres microlitros de benzo, una nucleasa, durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.

A esta mezcla, agregue el detergente no iónico Triton X-100 y 200 microlitros de suspensiones de perlas Anti-Flag M2. Mezcle suavemente el contenido girando el tubo durante tres horas a cuatro grados Celsius. Tras tres horas de rotación, centrifugue el tubo a 1.700 × g durante seis minutos. Tras la centrifugación, retire cuidadosamente la mayor cantidad posible del sobrenadante sin perturbar el pellet suelto.

Re-suspenda el precipitado en el SNA restante y luego transfiéralo a una columna de preparación de polipropileno. Retire los tapones del orificio inferior de la columna para permitir que el eluato drene por gravedad. A continuación, lave la columna cinco veces con 200 microlitros de tampón FC 1X y continúe con la escisión mediante TEV según se describe en el protocolo escrito.

Después de la escisión, ajuste firmemente tanto la tapa superior como el tapón inferior de la columna. Mezcle suavemente el contenido de la columna girándolo durante la noche a cuatro grados Celsius tras una rotación nocturna. Drene el eluato retirando la tapa superior y el tapón inferior hacia la nueva columna.

Lave la columna antigua con 400 microlitros de tampón de unión Cal Modlin 1x y una suspensión de 150 microlitros de perlas de unión Cal Modlin. Eluya la proteína unida en cuatro fracciones de 50 microlitros en un tubo eppendorf nuevo. Utilice tampón de elución Cal Modlin 1x.

Divida la fracción eluida en dos tubos eppendorf limpios en volúmenes iguales. Luego, seque el contenido de ambos tubos utilizando un vacío rápido. El eluato seco de un tubo se utiliza para realizar un gel teñido con plata según se describe en el texto, mientras que el otro se almacena a menos 80 grados Celsius.

Para su uso futuro en espectrometría de masas con la muestra seca, agregue 50 microlitros del tampón de digestión y 0,9 microlitros de tris fosfina al ácido clorhídrico 100 milimolar, incube la mezcla durante 45 minutos a temperatura ambiente para la etapa de reducción. A continuación, agregue un microlitro de iodoacetamida 500 milimolar e incube en la oscuridad durante otros 40 minutos para permitir la alquilación de la muestra. Después de la segunda ronda de incubación, agregue un microgramo de tripsina a la mezcla. Incube la muestra a 37 grados Celsius durante cinco horas o durante la noche a temperatura ambiente tras la incubación.

Asegúrese de detener la reacción agregando un microlitro de ácido acético. Luego prepare el extremo tipo zip de Millipore, punta de pipeta como se describe en el texto para una unión eficiente del péptido al extremo pipeta pep. Mezcle la mezcla de péptidos 20 veces y lave la mezcla de péptidos que se unió al extremo aspirando y dispensando la solución de lavado.

Repita este procedimiento dos veces para lograr una unión eficiente de la mezcla de péptidos a la punta que contiene el péptido unido. Aspire 10 microlitros de la solución de humectación y equilibrio y dispense en un tubo eppendorf limpio. Repita este paso dos veces.

Después de secar las muestras eluidas en un vacío rápido, las muestras pueden analizarse inmediatamente mediante espectrometría de masas o almacenarse a menos 80 grados Celsius antes de su uso. Las microcolumnas utilizadas en este procedimiento están empaquetadas con aproximadamente 10 centímetros de resina lunar C 18 de tres micrones y se conectan a una fuente de ionización por electroaspersión nano Pro Zion que se coloca en línea con el instrumento Orbitrap. Se utiliza una bomba HPLC binaria de flujo nano Pro Zion para mantener un flujo estable de aproximadamente 300 nanolitros por minuto durante las separaciones peptídicas, con el fin de lograr la dilución de péptidos y establecer un gradiente de tampón orgánico según la complejidad de la muestra.

Para esta muestra de SPA de E. coli, la fase móvil A contiene 95 % de agua para gradiente HPLC y 5 % de acetonitrilo con 0,1 % de ácido fórmico, mientras que el solvente B contiene 5 % de agua para gradiente HPLC y 95 % de acetonitrilo con 0,1 % de ácido fórmico. A continuación, buscar los espectros mediante un algoritmo de búsqueda en bases de datos como SEQUEST frente a una base de datos de secuencias proteicas de E. coli. Filtrar estadísticamente los resultados utilizando un algoritmo de probabilidad como STARPEP para garantizar una baja tasa de descubrimiento falso. Tanto el factor sigma de la ARN polimerasa etiquetado con SPA como la proteína YakL de función desconocida se copurificaron específicamente con la enzima ARN polimerasa central, incluyendo las subunidades alfa, beta y beta prima, así como el factor de reciclaje de la ARN polimerasa. En contraste con el factor sigma de la ARN polimerasa etiquetado, YakL se unió adicionalmente a un factor esencial de antiterminación transcripcional, lo que sugiere una función especializada en la transcripción.

También se detectaron mediante LCMS varias otras proteínas más pequeñas que co-purificaron, las cuales no eran evidentes en el gel, incluyendo la subunidad omega de la ARN polimerasa, factores de transcripción, terminación y determinación, así como USA y NUSD. Por el contrario, en un experimento independiente de movilización marcada del sistema de azufre, S-U-F-B-S-U-F-C y SUFD co-purificaron entre sí, lo que indica su participación conjunta en la biosíntesis de grupos hierro-azufre como un único complejo andamio. Este ejemplo representativo resalta el hecho de que complejos bacterianos MultiPro previamente bien estudiados y altamente anotados, que participan en procesos biológicos esenciales, a menudo poseen componentes asociados novedosos que pueden identificarse de manera eficiente.

Mediante este enfoque, el bajo número de copias de la proteína SUFB podría haber dado como resultado una intensidad de señal débil en comparación con la intensidad fuerte observada en los experimentos de inmunoprecipitación de SUFC y SUFD para definir la composición de complejos proteicos estables de múltiples unidades; se asignaron puntajes de co-purificación a interacciones de alta confianza teniendo en cuenta la singularidad de las relaciones entre captor y presa, captor y captor, y presa y presa. Luego, mediante procedimientos de agrupamiento por grafos, como el algoritmo de agrupamiento markoff, se identificaron grupos proteicos discretos a partir de la red probabilística de interacciones proteína-proteína particionada.

Las redes de interacción putativas pueden visualizarse utilizando cyto scape. Combinar datos de proteómica con evidencia adicional de asociación funcional inferida mediante métodos de genómica puede utilizarse para investigar nuevos roles mecanicistas de proteínas de e coli previamente anotadas. Aquí, se han definido subredes de complejos proteicos y módulos funcionales que participan como vecindarios funcionales más amplios en e coli.

El principal agrupamiento jerárquico de Graham muestra los patrones de predicciones funcionales y anotaciones existentes para los genes huérfanos funcionalmente y los genes caracterizados de Escherichia coli; los colores amarillo y azul representan funciones existentes e inferidas, respectivamente, mientras que las intensidades del tono reflejan las puntuaciones de confianza. Los procesos biológ游戏副本

En principio, esta técnica puede aplicarse para caracterizar complejos de proteínas de membrana o complejos de proteínas de cualquier otra especie por su capacidad de recombinarse lo más posible.