Simple y eficaz administración y visualización de micropartículas en el sistema circulatorio de peces pequeños con inyección de riñón

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una técnica para la introducción de micropartículas en el sistema circulatorio del pez cebra adulto mediante la inyección en el riñón del pez. Las micropartículas introducidas se visualizan aún más en la vasculatura mediante una técnica simple de imágenes intravitales en las branquias de los peces. Este procedimiento se puede utilizar, por ejemplo, para realizar mediciones repetidas del pH de la sangre de los peces in vivo mediante la introducción de sondas fluorescentes microencapsuladas para el pH.

Para ello, en la primera etapa, el colorante sensible al pH SNARF-1 conjugado con dextrano se encapsula en la capa de polielectrolito semipermeable utilizando un enfoque capa por capa. El tinte fluorescente se coprecipita en micronúcleos porosos de carbonato de calcio, y los núcleos se recubren con múltiples capas de polímeros no biodegradables de carga opuesta y se recubren con un polímero biocompatible que contiene polietilenglicol. A continuación, los núcleos de carbonato de calcio se resuelven para obtener microcápsulas completas que encierran SNARF-1.

En la segunda etapa de la anestesia y fijación de los peces, las microcápsulas preparadas se inyectan directamente en el riñón del animal para administrar el tinte encapsulado en el sistema circulatorio del pez. A continuación, se necesita una cirugía mínima para eliminar la cubierta branquial y desnudar los capilares de las branquias de los peces. Luego, la visualización de microcápsulas en la sangre y el registro del espectro fluorescente se pueden realizar in vivo mediante microscopía intravital para monitorear el pH de la sangre.

Cuando la inyección funcionó correctamente, es posible observar microcápsulas fluorescentes en las branquias de los peces inmediatamente después del procedimiento. El espectro de fluorescencia de la sonda encapsulada se puede registrar utilizando un espectrómetro acoplado a un microscopio fluorescente. SNARF-1 tiene dos picos de emisión, y la relación entre dos longitudes de onda correspondientes a esos picos se puede utilizar para medir el pH.

El procedimiento propuesto permite administrar microcápsulas fluorescentes en el sistema circulatorio de los peces y monitorear de forma remota la fluorescencia en la sangre de los peces in vivo. En el caso de la investigación fisiológica, la principal ventaja de este método son las mediciones repetidas de los parámetros sanguíneos en pequeños animales de laboratorio, que suelen ser difíciles de realizar. Si se utiliza una sonda fluorescente sensible a la luz, es aconsejable realizar todo el procedimiento en una habitación con poca luz.

Mezcle dos mililitros de solución de un colorante fluorescente unido a un polímero elegido aquí, SNARF-1-dextrano, con 0,6 mililitros de una solución de cloruro de calcio molar y 0,6 mililitros de una solución de carbonato de sodio molar bajo agitación rápida. En este paso, se sintetizan micronúcleos porosos de carbonato de calcio que encierran el tinte fluorescente. Después de cinco o 10 segundos de agitación, transfiera la suspensión a microtubos de dos mililitros y centrifugue durante 15 segundos para pellets micronúcleos de carbonato de calcio.

Deseche el sobrenadante, lave los núcleos con unos dos mililitros de agua desionizada y agite la suspensión. Repita el procedimiento de centrifugación y lavado tres veces. Incubar la suspensión durante un minuto en un baño ultrasónico para reducir la agregación de los micronúcleos.

Resuspender los micronúcleos de carbonato de calcio en aproximadamente dos mililitros de una solución de cuatro microgramos por mililitro del polímero catiónico PAH para depositar la primera capa polimérica en las plantillas. Mantenga los micronúcleos en la solución de pH durante unos cinco minutos con agitación constante. Después de 15 segundos de centrifugación, deseche el sobrenadante con HAP no unido y lave los micronúcleos con agua tres veces mediante múltiples pasos de centrifugación y lavado.

Repita el mismo procedimiento con una solución de cuatro miligramos por mililitro de polímero aniónico PSS para depositar la segunda capa polimérica en las plantillas. Justo antes de añadir la siguiente capa, es aconsejable aplicar un minuto de incubación en baño ultrasónico. Repita secuencialmente la deposición de polímeros catiónicos y aniónicos seis veces para obtener una cubierta de microcápsulas de 12 capas.

A continuación, incube los micronúcleos con cáscaras en la poli-L-lisina injertada en polietilenglicol durante al menos dos horas. A continuación, lavar los micronúcleos cubiertos una vez con agua mediante centrifugación secuencial y resuspensión. Finalmente, disolver las plantillas de carbonato cálcico en dos mililitros de solución de EDTA 0,1 molar, ajustada a un pH aproximado de 7,1, para obtener microcápsulas huecas.

Deseche el sobrenadante después de 45 segundos de centrifugación y repita el lavado con EDTA dos veces. Deseche el sobrenadante después de 45 segundos de centrifugación y agregue dos mililitros de solución salina. Repita los pasos de centrifugación de lavado con solución salina tres veces.

Investigar el tamaño, la distribución y la concentración de las microcápsulas preparadas en un hemocitómetro bajo un microscopio fluorescente. Utilice ImageJ o un software equivalente para el análisis del tamaño de las partículas. Guarde la sonda encapsulada obtenida en la oscuridad.

Para preparar el sistema óptico, coloque el conjunto requerido de filtros fluorescentes en el microscopio fluorescente de acuerdo con las características del tinte fluorescente aplicado y encienda la lámpara fluorescente. Tire de la palanca hasta los oculares. Conecte la fibra óptica desde un extremo al espectrómetro y en el otro extremo a un colimador.

Usando adaptadores, toque el colimador en el foco del tubo de la cámara u otro puerto disponible del microscopio fluorescente. Para la calibración de las microcápsulas preparadas, coloque unos cinco microlitros de la suspensión de microcápsulas en un portaobjetos de microscopio y seque la gota en un lugar oscuro. Encienda el espectrómetro.

Ejecute el programa de control del espectrómetro y prepare el espectrómetro para las mediciones. Para calibrar las características espectrales del SNARF-1 microencapsulado, utilice series de tampones con diferente pH. Deje caer unos 10 microlitros de tampón de sodio sobre las microcápsulas secas con SNARF-1 y cúbralas con un cubreobjetos.

Coloque un portaobjetos de vidrio en la platina del microscopio. Localice las microcápsulas con un aumento de aproximadamente 400. Gire la palanca del microscopio hasta el puerto de la cámara.

Registre la fluorescencia con el espectrómetro. Asegúrese de que la señal espectral esté mucho más allá del nivel de fondo y observe que las microcápsulas no están en una burbuja. Evite la iluminación prolongada de las mismas microcápsulas, ya que SNARF-1 es sensible al fotoblanqueo.

Vuelva a girar la palanca hacia los oculares. Calcule la relación de la intensidad de fluorescencia de SNARF-1 encapsulado en la longitud de onda correspondiente a los picos de emisión del colorante protonada y desprotonada. Construya una curva de calibración de la relación en función del pH del medio.

Recolecta alrededor de 10 microlitros de sangre de peces sacrificados. Determine su pH mediante un medidor de pH con un microelectrodo. A continuación, deje caer la sangre en un portaobjetos con microcápsulas secas y registre la relación de la intensidad de fluorescencia como se describe para los tampones de calibración.

Dado que debe tener en cuenta la influencia de los componentes de la sangre en la lectura del SNARF-1 encapsulado, ajuste el coeficiente lineal de la curva de calibración para que la curva coincida con las mediciones en la sangre de los peces. Para preparar la aguja para la inyección, suelte una aguja de acero de la punta de la jeringa de insulina retirando el plástico con una lanceta afilada. Inserte la aguja hasta la mitad en el microcapilar de vidrio.

Suéldelo rápida y suavemente con un soplete de gas. Conecte el microcapilar de vidrio al microinyector y enjuáguelo con agua estéril durante tres veces. Asegúrese de que el líquido fluya a través de la aguja.

Llene el sistema con agua. Asegúrese de que no haya burbujas en el sistema. El día del experimento, tome la suspensión preparada de microcápsulas en solución salina estéril que contenga de medio a seis millones de microcápsulas por microlitro.

Vuelva a suspenderlo mediante el baño ultrasónico durante un minuto. Durante la siguiente inyección, agitar el vial periódicamente para resuspender las microcápsulas y evitar su agregación. Con una cuchara, saque el pez de la anestesia y colóquelo suavemente sobre una esponja húmeda en posición lateral con la cabeza hacia la izquierda si es diestro o hacia la derecha si es zurdo.

Justo antes de la inyección, aspire uno o dos milímetros de aire en el capilar de vidrio conectado con el microinyector. A continuación, cárgalo con aproximadamente dos microlitros de las microcápsulas dispersas. Estabiliza suavemente el cuerpo del pez sobre la esponja con la mano no dominante.

Encuentra la línea lateral de los peces. Coloque la aguja un mililitro por debajo del punto medio de un segmento abdominal de la línea lateral. Luego, con un movimiento de raspado, mueva la escama de pescado a un lado y haga una perforación.

Inserte la aguja en el cuerpo en un ángulo de 45 grados con respecto a la superficie de la mesa. Empuje la aguja hacia la columna vertebral hasta que descanse cuidadosamente contra la columna. Luego, libere lentamente aproximadamente un microlitro de la suspensión de microcápsulas en el riñón y retire lentamente la aguja.

Enjuague el pescado de la cabeza a la cola con un chorro de agua para eliminar las microcápsulas derramadas en el lugar de la inyección. Use tijeras de disección para quitar la cubierta branquial de la cabeza del pez y desnudar las branquias del pez. Enjuague las branquias con agua.

Con una cuchara, transfiera el pez a un portaobjetos de microscopio y colóquelo en la platina de un microscopio fluorescente. Cuando realice los siguientes procedimientos, asegúrese de que las branquias del pescado no se sequen. Para ello, humedézcalos periódicamente con agua utilizando una pipeta Pasteur.

Oscurece la habitación y, con un aumento bajo, inspecciona las branquias para encontrar microcápsulas fluorescentes. Cuando lo encuentres, cambia la lente a una magnitud más alta y colócala en el centro del campo de visión. Gire la palanca hasta el puerto con un espectrómetro conectado.

Registre la señal espectral. Vuelva a girar la palanca hacia los oculares. Repita varias veces las mediciones de las diferentes microcápsulas.

Transfiera los peces al acuario con la aireación adecuada para su recuperación. El procedimiento de medición se puede repetir para un individuo varias veces con el uso de anestesia repetida u otro método de fijación. La imagen muestra un ejemplo representativo de mediciones in vivo de sangre de pez cebra e hipercapnia mediante colorante fluorescente encapsulado SNARF-1.

En condiciones de control, el pH de la sangre permanece estable durante cuatro horas después de la inyección de microcápsulas, mientras que la exposición de cinco minutos bajo niveles elevados de dióxido de carbono provoca la acidificación de la sangre de los peces. Al llevar a cabo el procedimiento, es importante minimizar el estrés animal causado por la manipulación y la cirugía. Con un poco de práctica, tanto la inyección como el registro de la señal tardan en promedio unos dos o tres minutos, por lo que este protocolo permite completar las manipulaciones antes de que el pez se despierte de una anestesia leve.

Durante el procedimiento, asegúrese de que las branquias del pescado estén siempre humedecidas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar una implantación simple y efectiva de micropartículas en el sistema circulatorio de peces pequeños. Como se ha demostrado, esta técnica es muy conveniente para registros repetidos in vivo del pH de la sangre en peces cebra adultos utilizando microcápsulas llenas de una sonda fluorescente.